乙型肝炎病毒感染患者PBMC表面PD-1、Caspase-9在不同病情階段中臨床表達意義

付婷婷 賈 暉 黃 遂 歐 芳 謝芳芳 周 佩 廖 健

湖南省湘潭市中心醫(yī)院感染性疾病與肝病科，湖南湘潭 411100

乙型肝炎病毒（hepatitis bvirus，HBV）是常見的傳染性疾病，且呈現(xiàn)世界性流行趨勢[1]，世界衛(wèi)生組織提出的2030年病毒性肝炎消除目標中指出，慢性乙型肝炎診斷率應達到90%，治療率應達到80%，但我國目前的診斷及治療率僅有22%及15%[2]。有研究指出，中國有約77%的肝硬化和84%的肝癌是由HBV感染所進展而來的[3]，慢性乙型肝炎是HBV感染所致的傳染性疾病，嚴重影響了患者生活質量[4]。因此，需要尋找新的方法提高乙型肝炎診斷率，并及時干預，改善預后。過往研究顯示，HBV病情進展與外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）凋亡、免疫耐受有關[5]，程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白[6]，在HBV感染過程中，PD-1處于持續(xù)活躍狀態(tài)[7]，半胱氨酸天冬氨酸酶（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）屬于啟動性，介導參與PBMC死亡受體凋亡和線粒體凋亡[8]。所以本研究探究乙型肝炎患者不同階段的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平，尋找其臨床表達意義，希望能對不同病情階段乙型肝炎的診斷提供積極影響并提高乙型肝炎患者的預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取湘潭市中心醫(yī)院（本院）感染性疾病與肝病科2020年3月至2022年9月進行治療的224例乙型肝炎患者，根據(jù)其病情階段將其分為乙型肝炎輕度組（n=83）、乙型肝炎中度組（n=76）和乙型肝炎重度組（n=65）。另取同期肝癌患者21例作為肝癌組，同期健康體檢人員70例為健康組。乙型肝炎輕度組中男51例（61.45%），女32例（38.55%），年齡33～59歲，平均（43.72±6.27）歲；乙型肝炎中度組中男46例（60.53%），女30例（39.47%），年齡33～58歲，平均（45.07±5.98）歲；乙型肝炎重度組中男41例（63.08%），女24例（36.92%），年齡31～56歲，平均（44.69±6.13）歲；肝癌組中男15例（71.43%），女6例（28.57%），年齡39～65歲，平均（49.22±6.08）歲；健康組中男44例（62.86%），女26例（37.14%），年齡32～61歲，平均（47.27±6.02）歲。5組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），具有可比性，見表1，本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，并且所有參與本研究的患者均知情同意本研究內容。

表1 5組一般資料比較

1.2 納入及排除標準

納入標準：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[9]中有關乙型肝炎和肝癌的診斷標準；臨床資料完整；同意并愿意配合本次研究。排除標準：患有其他嚴重器官及功能障礙或惡性腫瘤的乙型肝炎者；意識障礙或患有嚴重精神疾病的乙型肝炎患者；不同意或不愿意配合本研究內容的乙型肝炎患者；臨床資料不完整的乙型肝炎患者。

1.3 方法

乙型肝炎及肝癌患者在入院次日清晨、健康體檢人員在體檢日清晨空腹抽取10 ml外周靜脈血進行肝功能指標的檢測以及PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的檢測，比較各組乙型肝炎患者肝功能指標，PBMC表面PD-1、Caspase-9水平，統(tǒng)計分析不同病情階段與PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的關系以及其對于病情階段的預測價值。

1.4 觀察指標

1.4.1 肝功能指標 取5 ml靜脈血，以3500 r/min的速度在離心機中離心15 min，分離血清后通過全自動生化儀進行谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的檢測，通過實時熒光定量PCR法進行乙型肝炎DNA（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）的定量檢測[10]。

1.4.2 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平 取5 ml靜脈血，以3500 r/min的速度在離心機中進行15 min的離心，分離血清后通過酶聯(lián)免疫吸附法進行Caspase-9水平的檢測，過程按照試劑盒說明進行，免疫組化染色SP法進行PBMC表面PD-1表達的檢測，陽性對照選擇已知陽性標本切片，陰性對照選擇PBS液替代血清進行檢測。

1.4.3 診斷敏感度和特異度 診斷敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理

通過雙人錄入方法保證數(shù)據(jù)的質量，使用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件對所有記錄資料進行相關分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用F檢驗，計數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗，采用Pearson進行相關性分析，過ROC曲線分析PBMC表面PD-1、Caspase-9水平及聯(lián)合檢測對重度乙型肝炎發(fā)展為肝癌的預測價值，確定其曲線下面積（AUC值）、置信區(qū)間（95%CI）、截斷值、敏感度及特異度，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5組肝功能指標比較

乙型肝炎輕度組、乙型肝炎中度組、乙型肝炎重度組患者和肝癌患者的AST、ALT、HBV-DNA顯著高于健康組，乙型肝炎輕度組、乙型肝炎中度組、乙型肝炎重度組和肝癌組AST、ALT依次升高，并且各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。但乙型肝炎輕度組、乙型肝炎中度組、乙型肝炎重度組和肝癌組患者的HBV-DNA差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），見表2。

表2 5組肝功能指標分析（）

表2 5組肝功能指標分析（）

注 與健康組比較，aP ＜ 0.05；與輕度組比較，bP ＜ 0.05；與中度組比較，cP ＜ 0.05；與重度各組比較，dP ＜ 0.05；AST：谷草轉氨酶；ALT：谷丙轉氨酶；HBV-DNA：乙型肝炎DNA

HBV-DNA（IU/ml）健康組7024.27±3.2726.82±2.011.31±0.31乙型肝炎輕度組8343.47±6.23a114.28±23.27a5.31±0.28a乙型肝炎中度組76112.28±9.19ab134.44±32.09ab5.42±0.31a乙型肝炎重度組65232.18±50.28abc254.28±43.22abc5.46±0.29a肝癌組21408.36±87.29abcd427.15±101.33abcd5.88±0.52a F值52.45289.28132.028 P值＜0.001＜0.001＜0.001組別nAST（U/L）ALT（U/L）

2.2 5組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平比較

與健康組比較，乙型肝炎輕度組、乙型肝炎中度組、乙型肝炎重度組和肝癌組患者的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。乙型肝炎輕度組、乙型肝炎中度組、乙型肝炎重度組和肝癌組Caspase-9水平依次降低，各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。乙型肝炎輕度組、乙型肝炎重度組和肝癌組PBMC表面PD-1依次升高，各組差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；中度組PD-1和輕度組差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表3。

表3 5組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平比較（）

表3 5組PBMC表面PD-1、Caspase-9水平比較（）

注 與健康組比較，aP ＜ 0.05；與輕度組比較，bP ＜ 0.05；與中度組比較，cP ＜ 0.05；與重度組比較，dP ＜ 0.05；PBMC：外周血單個核細胞；PD-1：程序性死亡受體-1；Caspase-9：半胱氨酸天冬氨酸酶9

組別nPD-1（%）Caspase-9（pmol/L）健康組7025.27±8.218.61±5.22乙型肝炎輕度組8341.38±11.23a397.33±112.37a乙型肝炎中度組7643.47±13.01a312.69±90.71ab乙型肝炎重度組6552.81±13.22abc220.33±83.29abc肝癌組2166.42±15.17abcd152.06±55.37abcd F值62.719102.271 P值＜0.001＜0.001

2.3 肝功能指標和PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的相關性

AST、ALT、HBV-DNA與PBMC表面PD-1、Caspase-9水平存在著顯著關聯(lián)（P＜ 0.05），其中PBMC表面PD-1與AST、ALT呈正相關，與HBV-DNA呈負相關，而Caspase-9水平與AST、ALT呈負相關，與HBV-DNA呈正相關，見表4。

表4 肝功能指標和PBMC表面PD-1、Caspase-9水平的相關性

2.4 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平對重度乙型肝炎發(fā)展為肝癌的預測意義

以肝癌組患者作為陽性樣本，乙型肝炎重度組作為陰性樣本，繪制ROC曲線分析，結果顯示，PBMC表面PD-1、Caspase-9水平以及聯(lián)合檢測的預測價值均較高，其中聯(lián)合檢測的診斷價值最高且其敏感度和特異度均較好，見表5、圖1。

圖1 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平預測肝癌的ROC曲線

表5 PBMC表面PD-1、Caspase-9水平對重度乙型肝炎發(fā)展為肝癌的預測意義

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組比較，乙型肝炎輕度組、乙型肝炎中度組、乙型肝炎重度組患者和肝癌患者的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平都出現(xiàn)了顯著上升，PD-1是免疫抑制分子，與細胞凋亡有關，過往研究顯示，PD-1與配體結合能夠影響HBV特異性T細胞的活化及增殖，干擾細胞表面信號傳導，參與HBV感染過程[11-12]，在此過程中，受負向免疫的影響，肝臟組織出現(xiàn)炎癥損傷，PBMC表面PD-1表達會出現(xiàn)異常升高[13]，而Caspase-9在PBMC凋亡線粒體途徑中有著重要影響，能夠對細胞毒性死亡信號進行介導[14]，本研究中還發(fā)現(xiàn)，隨著病情的嚴重程度提高，Caspase-9水平逐步下降，可能是由于病情進展之下，肝臟功能惡化，組織出現(xiàn)萎縮病變，PBMC分泌Caspase-9的能力下降[15]。李承幸等[5]也指出隨著乙型肝炎病情的進展，Caspase-9水平出現(xiàn)下降趨勢，與本研究結果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)乙型肝炎患者肝功能指標都出現(xiàn)了顯著上升，AST和ALT為肝臟疾病的常用診斷指標，可以反映肝細胞的損傷，而過往研究指出HBV-DNA定量與肝臟組織學變化相關，與本研究結果相似[16]。本研究還發(fā)現(xiàn)PBMC表面PD-1與AST、ALT呈正相關，與HBV-DNA呈負相關，而Caspase-9水平與AST、ALT呈負相關，提示PBMC表面PD-1和Caspase-9水平可能對肝損傷進行預測，ROC曲線檢測后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測AUC值為0.911，說明其預測價值較好。

由于時間及人力等原因的限制，本次僅就一家醫(yī)院內的患者進行了研究，未來需要多地區(qū)多醫(yī)院的聯(lián)合研究對結果進行進一步證明，此外本研究雖然指出了PD-1、Caspase-9水平與乙型肝炎不同階段的相關性，但具體作用機制尚不明確，未來需要更深入的研究進行探討。

綜上所述，乙型肝炎患者不同階段的PBMC表面PD-1、Caspase-9水平有顯著差異，且兩者表達水平與肝功能指標存在相關性，進行PD-1、Caspase-9的聯(lián)合檢測可以對重度乙型肝炎發(fā)展為肝癌進行預測。