基于網絡藥理學對破格救心湯治療急性心力衰竭主要活性成分及潛在靶點分析

張 明 李光智 林道斌

廣州中醫(yī)藥大學附屬海南省中醫(yī)院心血管科一病區(qū)，海南海口 570203

急性心力衰竭（acute heart failure，AHF）是指急性發(fā)作的左心室功能障礙，導致心室充盈程度或射血能力受損的一組復雜臨床綜合征[1]，是本世紀心血管病學領域的兩大難題之一[2]。

破格救心湯（Poge Jiuxin Decoction，PJD）由名老中醫(yī)李可所創(chuàng)，是治療AHF的臨床經驗方[3]。多項臨床研究表明在AHF治療過程中在西藥的基礎上加用PJD，往往能取得更好的療效[4-6]。然而，由于PJD治療AHF的藥理作用機制尚未明確，這限制了該方的進一步推廣。

為探討PJD治療AHF的機制，給進一步的實驗室研究做好前期鋪墊，本研究采用網絡藥理學方法，分析PJD治療AHF的藥物-化合物-靶點機制。

1 材料與方法

1.1 PJD活性成分和藥物靶基因的篩選

由于PJD中高麗參或可以用人參及紅參替代，所以本研究決定根據本課題組前期臨床研究所使用的破格救心湯方藥（干姜、附子、麝香、山萸肉、紅參、炙甘草、磁石、生龍骨、生牡蠣），然后通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺，檢索上述藥物的活性成分和活性成分對應的基因。

1.2 AHF疾病基因的獲取與交集基因的篩選

本研究通過GeneCards數據庫尋找AHF的疾病基因并建立數據集，然后將疾病基因與1.1篩選出的活性成分對應的基因進行韋恩分析，獲取交集基因。這些交集基因可能是PJD治療AHF過程中所調控的基因。

1.3 交集基因中的核心基因篩選

通過STRING數據庫建立交集基因的蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡（參數設置：a.物種限制為人類；b.隱藏游離點；c.設定置信度＞0.7；d.其他保持默認設置），對交集基因進行分析，篩選出核心基因。再將交集基因的蛋白互作網絡數據導入Cytoscape軟件（版本3.9.0）。運用Cytoscape軟件中的插件分子復合物檢測工具（Molecular Complex Detection tool，MCODE）（版本1.5.1）對蛋白互作網絡中最顯著的模塊進行篩選和識別，其標準為MCODE評分＞5，截斷度=2，節(jié)點評分截斷度=0.2，k-score=2，最大深度=100。此外，本研究將差異基因PPI網絡中Degree≥10的基因定義為核心基因，然后用Cytoscape插件cytoHubba識別核心基因。

1.4 交集基因的細胞功能注釋分析與通路富集分析

利用R語言軟件中的Bioconductor、clusterProfiler等程序包對交集基因進行細胞功能注釋與通路富集分析，設置p value及q value均＜0.05為限制條件運行R語言腳本導出富集分析結果，再繪制柱狀圖展現細胞功能注釋分析得到的生物學進程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）以及細胞組分（cellular component，CC）結果；利用基因富集柱狀圖、通路信息圖展示通路富集分析結果。

1.5 分子對接

為了驗證活性成分與交集基因的作用關系，本研究還進行了分子對接驗證。首先從PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載篩選的蛋白結構文件，活性成分三維結構通過Pub Chem數據庫（https: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得。在AutoDock Tools 1.5.6軟件中對蛋白結構進行加氫去水處理，并保存為*pdbqt格式文件；然后將上述方法獲得的活性成分文件和蛋白結構文件導入到AutoDock Tools軟件中進行分子對接。

1.6 藥物-活性成分-關鍵基因網絡的建立

為了篩選PJD治療AHF的關鍵活性成分，本研究將1.3得到的關鍵靶基因與其對應的藥物活性成分，導入Cytoscape（版本3.9.0）軟件建立藥物-活性成分-靶點的相互作用網絡關系圖，并利用該軟件中的CytoNCA插件分析網絡節(jié)點的相關拓撲參數作進一步分析。

2 結果

2.1 PJD活性成分及藥物靶點的篩選結果

本研究共找到121種PJD活性成分以及395個對應的藥物靶基因。

2.2 疾病靶點及交集靶點的篩選結果

通過Gene Cards數據庫檢索到10 409個AHF疾病基因，與2.1獲取的藥物作用靶點進行韋恩分析，得到交集基因319個，為PJD治療AHF潛在靶基因（圖1）。

圖1 藥物靶點與AHF疾病靶點韋恩分析圖

2.3 PPI和模塊網絡的構建及核心基因的選擇

通過STRING數據庫得到了交集基因的PPI網絡模型，該模型共有節(jié)點318個，邊5425條（圖2A）。使用Cytoscape軟件分析蛋白互作網絡的拓撲結構，當Degree≥10時，從PPI網絡中鑒定出10個核心基因，分別為胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、禽肉瘤病毒17的假定轉化基因（Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit，JUN）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、雌激素受體α（estrogen receptor 1，ESR1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、低氧誘導因子-1A（hypoxia inducible factor-1A，HIF1A）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（aerine/threonine kinase-1，AKT1）（圖2B）。

圖2 PPI網絡圖

2.4 交集基因的細胞功能注釋及通路富集分析結果

運用R語言軟件對319個交集基因進行細胞功能注釋（P＜ 0.05）得到1871種細胞功能條目，其中BP 7037種、MF 1262種、CC 609種。通路富集分析（P＜ 0.05）獲得301條通路，富集基因最多的通路富集到了50個交集靶基因，富集基因最少的通路富集到了3個交集靶基因。

2.5 藥物-活性成分-關鍵基因網絡建立結果

本研究通過Cytoscape軟件建立藥物-活性成分-關鍵基因網絡。在該圖中有藥物節(jié)點6個，活性成分節(jié)點有66個，靶點節(jié)點10個。在圖中，方形代表關鍵基因，橢圓形代表活性成分，菱形節(jié)點代表藥物節(jié)點。本研究發(fā)現作用到關鍵基因個數最多的前5個活性成分分別是槲皮素、山柰酚、谷固醇、柚皮素、人參皂苷-Rh2，在關鍵基因中，與活性成分相作用最多的關鍵基因是ESR1。見圖3。且槲皮素與ESR1存在相互作用，所以本研究選擇這對活性成分-關鍵基因作為分子對接研究對象。

圖3 藥物-活性成分-關鍵基因網絡圖

2.6 分子對接

結果發(fā)現本研究選擇的槲皮素與ESR1的結合能≤-6.2 kcal/mol，當結合能＜-4.0 kcal/mol時，表明配體分子和受體結合良好[7]。見圖4。

圖4 分子對接圖

3 討論

本研究通過網絡藥理學的研究方法，發(fā)現破格救心湯治療AHF的主要活性成分為槲皮素、山柰酚、谷固醇、柚皮素、人參皂苷-Rh2等，主要調控的關鍵基因為CASP3、JUN、VEGFA、IL-1β、TP53、ESR1、IL-6、HIF1A、TNF和AKT1。這些活性成分及靶點大部分都經過臨床試驗或動物實驗驗證對AHF有治療效果。

槲皮素是黃酮類化合物。研究發(fā)現，槲皮素具有抑制細胞凋亡、改善細胞氧化應激、加強免疫力和抗炎等功能，攝入槲皮素能夠改善心力衰竭預后[8]。Sharma等[9]發(fā)現使用槲皮素干預心力衰竭大鼠模型后，可以促進核因子紅細胞系2相關因子2表達，從而增強抗氧化能力，達到改善大鼠心功能的目的。

關鍵基因方面，ESR1全稱為雌激素受體，研究表明雌激素受體對心臟重塑有抑制作用。如雌激素受體敲除的小鼠會出現心肌肥厚的現象，進一步的心肌組織病理學檢查后發(fā)現，雌激素受體下的心肌細胞結構紊亂，細胞間的連接出現異常[10]。此外，還有研究發(fā)現，雌激素受體可能會通過增強心肌細胞閏盤的穩(wěn)定性抑制AHF，因為心肌閏盤是心肌細胞的連接處，它的穩(wěn)定性是心肌收縮功能的基礎，而雌激素受體基因表達的增加可以增強心肌細胞閏盤的穩(wěn)定性[11]。IL-1β、IL-6、TNF都是炎癥相關因子，AHF發(fā)生后會促進這些炎癥因子的釋放，加重炎癥反應，而長時間的炎癥刺激不但會促進心肌細胞凋亡加重心功能的損傷，還會促進心肌成纖維細胞增殖加速心肌纖維化導致患者預后不良[12]。CASP3是細胞焦亡的啟動因子，激活的CASP3能夠切割線粒體的特定站點以釋放活動的N終端域，以及在質膜上穿孔以誘導細胞焦亡[13]。JUN的表達異常會促進心肌細胞凋亡，從而加速左室肥厚過程[14]。VEGFA會促進心肌成纖維細胞增殖，研究顯示敲除VEGFA的小鼠較正常小鼠更容易出現心力衰竭。進一步的研究表明，VEGFA具有促進心臟毛細血管生成的作用，過表達VEGFA會通過促進新生血管，改善心肌供血，從而抑制心力衰竭[15]。TP53位于染色體17q13上，編碼TP53蛋白質。過表達TP53會導致細胞生長停滯、細胞凋亡和細胞分化[16]。根據目前的研究結果，TP53對AHF的作用可能與其改善心臟重構有關[17]。HIF1A是由α亞基和β亞基構成的異源二聚體，HIF1A的表達上升會造成心肌細胞能量代謝異常，造成心肌收縮力下降[18]。AKT1具有抗心肌細胞凋亡的作用，過表達AKT1可提高心肌細胞抗凋亡能力從而緩解心臟重構[19]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的研究方法，找出了PJD治療AHF的活性成分及關鍵基因，這些活性成分與基因間的相互作用可能是PJD治療AHF的作用機制。網絡藥理學研究只是理論研究，研究結果需要進一步的實驗驗證，這將是進一步的研究目標。