苗藥血人參提取物水凝膠的制備及促創面愈合體內外研究

宋選飛，楊 露，謝 歡，周 斌，劉 耀, 2, 3，徐 劍, 2, 3*，張永萍, 2, 3*

苗藥血人參提取物水凝膠的制備及促創面愈合體內外研究

宋選飛1，楊 露1，謝 歡1，周 斌1，劉 耀1, 2, 3，徐 劍1, 2, 3*，張永萍1, 2, 3*

1. 貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025 2. 貴州省民族藥經皮給藥制劑工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025 3. 國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025

制備一種載苗藥血人參提取物的聚乙烯醇（PVA）/木質素（Lig）/殼聚糖（CS）水凝膠并探究其促創面愈合機制。在單因素考察的基礎上，正交試驗優選處方工藝并對其進行質量評價和體外生物評價，通過建立大鼠全層皮膚損傷模型，評價其促創愈合效果。攜載提取物的PVA/Lig/CS水凝膠的最優處方和制備工藝為PVA用量7.0 g、CS用量4.0 g、Lig用量0.5 g、凍融循環次數4次，每次凍結6 h。該凝膠具有多孔網狀結構、良好的溶脹性、保濕性及一定的機械強度，同時具有良好的生物相容性、抑菌性以及有效抑制巨噬細胞細胞遷移，且抑制作用可能與時間呈正比。該水凝膠的體內藥效學研究顯示，其促創面愈合作用可能與減少創面組織炎性細胞浸潤，促進巨噬細胞向M2型極化、增加毛血細管生成和纖維組織形成有關。制備的載血人參提取物的PVA/Lig/CS水凝膠劑制備工藝簡單、穩定可行、具有良好的緩釋性能，且對全層皮膚損傷具較好的治療效果。

血人參提取物；PVA/Lig/CS水凝膠；創面愈合；體外生物評價；藥效學研究

皮膚組織作為保護器官免受感染和環境變化的屏障，具有至關重要的作用，但皮膚因各種物理、化學和微生物因子等因素引發的急、慢性創面常難以愈合[1]，甚至伴有大量腐肉、膿液和惡臭等，嚴重影響患者的生活質量。因此，對創面愈合過程進行干預，以加速創面愈合是皮膚創面治療的首要目標。目前，皮膚創傷修復藥物治療因其便攜性等廣受研究者關注。但大部分皮膚創面用藥，主要包括抗菌劑、干細胞療法、生長因子等[2]，常存在生物安全性低、易產生耐藥性、成本較高、穩定性較差等不足[3]。

血人參為豆科木藍屬植物茸毛木藍Lindl.的干燥根，是苗族民間常用藥[4-5]，應用歷史悠久，其乙醇提取物（ethanol extract，IS-EE）被證明具有抑制斑馬魚炎癥模型中巨噬細胞向急性創傷部位募集的作用[6]。因此，本研究擬制備一種載有苗藥血人參乙醇提取物PVA/ Lig/CS水凝膠（IS-EE PVA/Lig/CS hydrogel，IS-EE-H）作為創面敷料，該水凝膠是由木質素（lignin，Lig）、殼聚糖（chitosan，CS）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）組成的混合材料，旨在以木質素改善水凝膠的機械強度，以殼聚糖提高創面的抗菌性能及以聚乙烯醇維持創面周圍的潤濕環境，并利用混合水凝膠三維網絡結構作為IS-EE的藥物儲庫，使藥物從水凝膠中持續釋放，防止巨噬細胞向炎癥部位的過度遷移、聚集，加快皮膚創面愈合，以期為皮膚創面愈合提供新型敷料，并為皮膚創面愈合藥物的開發提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀、AUW120D型十萬分之一電子分析天平，日本島津制作所；Thermo Fisher Nicolet Is10-透射/ATR紅外、Thermo 3111型CO2細胞培養箱、MULTISKAN SKY 153型全自動酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CKX53型倒置相差顯微鏡，上海蠻吉光電科技有限公司；YXQ-LS-100SLL型高壓滅菌鍋，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；PHY-III型病理組織漂烘儀，常州市中威電子儀器有限公司；RS36型全自動染色機，常州派斯杰醫療設備有限公司；Inspect型掃描電子顯微鏡（SEM），美國FEI公司。

1.2 主要材料

血人參藥材，批號20210322，貴陽德昌祥藥業有限公司，經貴州中醫藥大學張永萍教授鑒定為豆科木藍屬植物茸毛木藍Lindl.的干燥根；對照品兒茶素，質量分數98.0%，批號170209，成都植標化純生物技術有限公司；對照品表兒茶素，質量分數99.7%，批號110878-201703，中國食品藥品檢定研究院；CCK-8（Cell Counting Kit-8細胞計數試劑）試劑盒，批號K1018，APExBIO Technology LLC；殼聚糖（批號RH300965）、木質素（批號RH238608），上海易恩化學技術有限公司；聚乙烯醇-124（PVA-124），批號181207，西隴科學股份有限公司；巨噬細胞（RAW264.7），中國典型培養物保藏中心；DMEM培養基，批號2318854，Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），批號820F036，Solarbio公司；重組牛堿性成纖維細胞生長因子，批號6920699338625，珠海億勝生物制藥有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號20220120）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6，批號20220120），南京建成生物工程研究所；卡那霉素（批號820Y0411）、二甲基亞砜（DMSO，批號710N0315），Solarbio公司。

1.3 實驗動物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量180～220 g，購自長沙天勤生物技術有限公司，合格證：SCXK（湘）2019-0015。動物實驗符合動物實驗倫理學要求，經貴州中醫藥大學動物倫理委員會審查后批準，編號20210174。

2 方法與結果

2.1 IS-EE的制備

稱取血人參藥材300 g，剪斷或切碎，加6倍量60%乙醇回流提取2 h，濾過，濾渣加4倍量60%乙醇回流提取1.5 h，濾過。合并2次濾液，減壓回收乙醇并濃縮至一定濃度，真空干燥至含水量＜5%，得IS-EE浸膏粉54 g[6]。

2.2 IS-EE體外分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為ComatexTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～40 min，8%～14%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；進樣10 μL。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素16.35 mg、表兒茶素14.24 mg分別置于10 mL量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀釋至10 mL，作為兒茶素和表兒茶素的儲備液。精密移取2 mL兒茶素儲備液和5 mL表兒茶素儲備液置于100 mL量瓶中并用甲醇稀釋至100 mL，得到含兒茶素32.70 μg/mL和表兒茶素71.20 μg/mL的混合對照品儲備液，4 ℃保存。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取IS-EE浸膏粉50.0 mg于10 mL量瓶中加入甲醇超聲使其完全溶解，稀釋至10 mL。

2.2.4 專屬性考察 取混合對照品溶液及IS-EE供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，色譜圖見圖1。在該色譜條件下，IS-EE供試品溶液和對照品溶液中兒茶素和表兒茶素的色譜峰具有相同的保留時間，且能實現完全分離。

圖1 空白甲醇(a)、混合對照品(b)、IS-EE樣品(c) 的HPLC圖

2.2.5 線性關系考察 精密吸取0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 mL“2.2.2”項下的混合對照品儲備液，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋，得到兒茶素系列質量濃度和表兒茶素系列質量濃度的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，測定其峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標（），待測成分峰面積為縱坐標（）進行線性回歸，得兒茶素的線性回歸方程為＝6 659.00－404.29，2＝0.999 9，線性范圍為2.04～32.74 μg/mL；表兒茶素的線性回歸方程為＝7 148.20－659.54，2＝1.000 0，線性范圍為4.50～71.20 μg/mL。由此可知，IS-EE中2種成分在線性范圍內線性關系良好。

2.2.6 精密度考察 精密吸取2.5 mL混合對照品儲備液，用甲醇定容至10 mL，并按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，重復6次，以隨行線性回歸方程計算其中兒茶素和表兒茶素的實測質量濃度，并計算其RSD值，結果其RSD分別為0.69%和1.07%，可知兒茶素和表兒茶素RSD值均符合要求，儀器精密度良好。

2.2.7 重復性考察 取同一批IS-EE樣品50.0 mg，精密稱定，平行6份，按“2.2.3”項下方法處理樣品制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，以隨行線性回歸方程計算其中兒茶素和表兒茶素的實測含量，并計算其RSD值，結果其RSD分別為2.11%和1.11%，可知其RSD值均符合要求，表明該方法重復性良好。

2.2.8 穩定性考察 取同一批IS-EE樣品50.0 mg，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件在制備后0、2、4、6、8、10、12 h時分別進樣分析，以隨行線性回歸方程計算其中兒茶素和表兒茶素的實測含量，并計算其RSD值，結果其RSD分別為2.12%和2.37%，可知其RSD值均符合要求，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.9 加樣回收率考察 稱取已測定指標成分含量的IS-EE樣品約25.0 mg，精密稱定，平行6份，按照所得2種成分含量分別加入其1.0倍量的對照品，按“2.2.3”項下方法處理樣品制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，以隨行線性回歸方程計算其中兒茶素和表兒茶素的實測含量，并計算2個指標成分的加樣回收率及其RSD值，結果兒茶素和表兒茶素的平均加樣回收率分別為103.87%和100.53%，RSD分別為2.86%和2.8.6%。

2.3 IS-EE-H的制備

稱取IS-EE浸膏粉0.5 g，精密稱定，以60%乙醇溶液7 mL溶解，加入PVA溶液（取8 g PVA加32 g超純水，90 ℃攪拌溶解）攪拌后與Lig溶液（取1 g Lig加9 g超純水，常溫攪拌溶解）混合，攪拌均勻后加入CS溶液（取CS 4 g加71 g 2%乙酸溶液，90 ℃攪拌溶解），得到的混合溶液進行離心（2 000 r/min、3 min）脫氣處理，采用凍融法（冷凍-解凍）在?20 ℃下物理交聯得IS-EE-H。

2.4 單因素考察IS-EE-H的處方工藝

本實驗采用凍融法制備PVA水凝膠，其機制主要為在冷凍狀態下，隨著凍融循環增加，水凍結、膨脹，推動PVA鏈與其他高分子材料鏈緊密接觸，形成高分子無規則狀的高密度區，促進氫鍵和晶體的形成[7]。為了考察凍融循環次數、凍結時間、不同基質比、木質素含量對水凝膠的影響，本研究選取的凍融循環次數分別為2、4、6次，凍結時間分別為6、12、24 h，PVA/Lig/CS比例（質量比）分別為8∶1∶2、7∶1∶3、6∶1∶4；Lig含量分別為0.5、1.0、1.5 g。除篩選因素改變外，將其他因素固定，即凍融循環次數和凍結時間分別為4次和6 h，PVA/Lig/CS比例為7∶1∶3，Lig含量為1.0 g。按照“2.3”項下方法制備水凝膠，評價各因素對水凝膠藥物釋放性能的影響。

2.4.1 凍融循環次數 不同凍融循環次數的水凝膠均在12 h后到達溶脹平衡狀態，經過4次循環后，水凝膠的溶脹率達到最佳，溶脹率為374.8%，當凍融循環增加至6次時水凝膠溶脹率幾乎不變，說明水凝膠凍融至4次時，其交聯程度可能已達到最大，此外凍融2次水凝膠中兒茶素和表兒茶素的累積釋放率最大，其次是凍融6次和凍融4次。

2.4.2 凍結時間 不同凍結時間的水凝膠均在12 h后達到溶脹平衡，其中凍結6 h的溶脹率（401.4%）最佳，較凍結12 h和24 h的平衡溶脹率（350.0%）高，同時凍結6 h和24 h時水凝膠中的兒茶素和表兒茶素的累積釋放率較12 h高，可達80%以上。研究表明，水凝膠溶脹率是衡量其吸收傷口滲出液能力的關鍵因素之一[8-9]，因此，本研究后續采用凍結6 h進行水凝膠的制備。

2.4.3 基質比 PVA/Lig/CS質量比（6∶1∶4）水凝膠溶脹率最大，可達至284.0%，其次是PVA/Lig/ CS質量比（7∶1∶3）水凝膠（265.6%）和PVA/Lig/ CS質量比（8∶1∶2）水凝膠（238.2%）。該結果表明，水凝膠處方中PVA和CS比值越小，水凝膠的溶脹度可能越大，其中CS對水凝膠的溶脹度可能起主導作用。水凝膠處方中PVA和CS比值越小，水凝膠的保濕性越小。PVA/Lig/CS質量比（6∶1∶4）水凝膠中兒茶素和表兒茶素的累積釋放率最大，分別為101.4%和85.4%，其次是PVA/Lig/CS質量比（8∶1∶2）水凝膠和PVA/Lig/CS質量比（7∶1∶3）水凝膠，2者的兒茶素累積釋放率分別為93.9%、77.7%，表兒茶素的累積釋放率分別為84.5%、64.8%。

2.4.4 木質素含量 在木質素含量分別為0.5、1.0、1.5 g的水凝膠處方中，PVA/Lig/CS質量比（7∶0.5∶3）水凝膠的溶脹率和保濕率最高，該結果表明木質素在水凝膠處方中的比例越小，水凝膠的溶脹率和保濕率可能越大。PVA/Lig/CS質量比（7∶1.5∶3）水凝膠兒茶素和表兒茶素的累積釋放率最大，其次是PVA/Lig/CS質量比（7∶1.0∶3）水凝膠和PVA/ Lig/CS質量比（7∶0.5∶3）水凝膠，該結果表明，水凝膠中木質素含量越大水凝膠的藥物釋放率可能越大。

2.5 正交試驗優化處方工藝

為了進一步篩選IS-EE-H的制備工藝和制備處方，本實驗采用了正交試驗設計法對其制備工藝和制備處方進行優化。單因素考察實驗結果顯示，PVA用量（A）、CS用量（B）、Lig用量（C）、凍融循環次數（D）均對水凝膠的溶脹率、藥物累積釋放率影響較大，對保濕度的影響相對較小，因此，正交試驗以水凝膠中兒茶素和表兒茶素的累積釋放率和溶脹率的綜合評分［綜合評分＝(兒茶素累積釋放率/兒茶素累積釋放率最大值)×0.35×100＋(表兒茶素累積釋放率/兒茶素累積釋放率最大值)×0.35×100＋(平衡溶脹度/平衡溶脹度最大值)×0.3×100］作為評價指標，按L9(34)因素水平表（表1）進行正交試驗。由實驗結果（表1、2）綜合分析確定IS-EE-H的制備工藝和制備處方為A2B3C1D2，即PVA用量7.0 g、CS用量4.0 g、Lig用量0.5 g和凍融循環次數4次。

2.6 IS-EE-H的表征

2.6.1 傅里葉紅外光譜分析 將PVA水凝膠、PVA/ Lig水凝膠、PVA/Lig/CS水凝膠和IS-EE-H冷凍干燥，干燥后的水凝膠分別使用傅里葉紅外光譜分析儀分析其紅外光譜（FTIR），分辨率為4 cm?1，掃描次數為16次，光譜范圍為4 000～500 cm?1。其結果如圖2所示。1 600～1 400 cm?1是木質素典型的芳香族骨架振動[10]，PVA/Lig水凝膠、PVA/Lig/CS水凝膠及IS-EE-H在1 419 cm?1和1 569 cm?1處表現出特征峰，且1 569 cm?1的峰強增加，表明木質素與PVA可能交聯成功。3 280 cm?1的強吸收峰是由于-OH拉伸振動[11]，PVA存在大量親水基團羥基，故PVA水凝膠、PVA/Lig水凝膠、PVA/Lig/CS水凝膠及IS-EE-H在3 280 cm?1均出現強吸收。研究表明，氫鍵形成時會使峰強增加同時將波段向低波數方向移動[12]。IS-EE-H在3 257 cm?1左右峰強增加，猜想IS-EE可能以氫鍵的形式包載于PVA/Lig/CS水凝膠中。

2.6.2 形態學表征 將PVA/Lig/CS水凝膠和IS- EE-H用相機記錄其形態，同時進行冷凍干燥，干燥后樣品折斷，暴露橫截面，噴金干燥后用SEM觀察其微觀形態。其結果如圖3-A和3-B所示，該凝膠成型性好且具有良好的彈性。在SEM下，PVA/ Lig/CS水凝膠呈三維多孔網狀結構（圖3-A），該結果可能歸因于木質素具有由多種活性基團（羥基、羧基和磺酸基團等）構成的特殊化學結構和空間構象，同時這些基團與PVA的羥基形成氫鍵，與殼聚糖的氨基形成離子鍵[13]。將PVA/Lig/CS水凝膠作為藥物儲庫對血人參提取物進行裝載后，形成的IS-EE-H仍保持一定數量的網狀結構，該結構使水分子容易滲透，是具有良好的溶脹性能的保障[14]，為其作為傷口敷料對傷口組織液、細胞代謝物等具有良好吸收效果提供理論依據。

表1 正交試驗設計與結果

表2 方差分析

圖2 PVA水凝膠(A)、PVA/Lig水凝膠(B)、PVA/Lig/CS水凝膠(C) 和IS-EE-H(D) 的FTIR圖

圖3 PVA/Lig/CS水凝膠(A) 和IS-EE-H (B) 的宏觀形態和微觀形態表征

2.6.3 溶脹性能 將水凝膠試樣真空干燥（48 h），稱定質量（質量記為0），加入50 mL超純水使其在常溫下充分膨脹，在時刻取出試樣，濾紙擦干表面水分，稱定質量（質量記為M），計算水凝膠的溶脹率。其溶脹率結果（圖4）顯示，PVA/Lig/CS水凝膠的平衡溶脹度為（436.820±9.623）%，IS- EE-H的平衡溶脹度為（168.32±2.53）%，IS-EE-H溶脹度下降的原因可能是IS-EE以氫鍵形式包載于PVA/Lig/CS水凝膠中，使水凝膠的交聯度增加，導致水凝膠水滲透率下降。

2.6.4 保濕性能 理想的創面敷料應具有優良的保濕性能，敷料提供的潤濕環境為表皮細胞的再生和趨化提供有利條件，保持細胞因子活性，促進創面快速愈合[15]。將水凝膠試樣真空干燥（48 h），稱定質量（質量記為0），加超純水（50 mL）使其在常溫下膨脹，充分溶脹后稱定質量（質量記為e）。將充分溶脹后的水凝膠置于恒溫箱（37 ℃）中，在時刻取出試樣，稱定質量（質量記為M），計算保濕度。PVA/Lig/CS水凝膠及IS-EE-H的保濕性結果（圖4）顯示，同一時間點PVA/Lig/CS水凝膠的保濕率較IS-EE-H高，IS-EE-H在短時間內具有一定的保濕性能。

2.6.5 釋放性能 藥物釋藥性能是考察水凝膠作為緩控釋制劑應用的一項重要指標。將水凝膠試樣置于PBS溶液（pH 5，20 mL）中，恒溫振蕩（37 ℃），分別在1、2、3、4、5、7、12、24、36、48 h取出釋放介質（10 mL），同時補充同等體積的空白釋放介質，將取出的釋放介質置于蒸發皿中干燥，待其完全蒸發后，加入甲醇溶液溶解殘留物質并定容至5 mL，0.22 μm有機膜濾過，取10 μL進樣分析，計算水凝膠試樣的累積釋放率。IS-EE-H的累積釋放率試驗結果（圖5）顯示，IS-EE-H中IS-EE的指標成分兒茶素和表兒茶素均在8 h后接近恒速釋放，此時二者的累積釋放率分別為90.9%、60.8%。采用Origin2019b軟件將兒茶素和表兒茶素的累積釋放數據與零級方程、一級方程和Higuchi平方根方程進行擬合[16]。結果顯示（表3），IS-EE-H中IS-EE指標成分兒茶素和表兒茶素的釋放規律均符合一級動力學，該結果說明PVA/Lig/CS水凝膠作為IS-EE的藥物儲庫可以對其具有緩釋作用。

圖4 PVA/Lig/CS水凝膠和IS-EE-H的溶脹率(A) 和保濕率(B) 結果(, n = 3)

2.6.6 流變學性能 將水凝膠置于平行板（直徑20.0 mm）上，以1.0 mm的固定間隙值進行頻率掃描分析。固定應變為1%，在0.01～10 Hz的頻率范圍，進行掃頻測試，實驗過程中溫度保持為25 ℃。測定的PVA/CS水凝膠、PVA/Lig/CS水凝膠、IS-EE-H的流變性能結果如圖6，其中儲能模量（′）表示水凝膠的彈性，損耗模量（″）表示黏度。結果顯示，3種類型的水凝膠均呈現出彈性行為和黏性行為，因儲能模量值較損耗模量值高，判斷3種類型水凝膠以彈性行為為主。同時，在PVA/CS水凝膠中添加Lig后，水凝膠的儲能模量和損耗模量均降低，且儲能模量值顯著降低，該結果表明Lig在水凝膠中可能具有增加水凝膠黏度的作用。當PVA/ Lig/CS水凝膠攜載IS-EE后，IS-EE-H的儲能模量顯著增加，產生該現象的原因可能是：IS-EE-H制備過程中，藥物與PVA混合后加入Lig混勻時，由于IS-EE的溶劑為60%乙醇，該乙醇可能充當一定潤濕劑的作用，使PVA、Lig和CS混合更加均勻，導致最終形成的凝膠彈性更好。

圖5 IS-EE-H中2種指標成分的累積釋放曲線(, n = 3)

表3 IS-EE-H中2種指標成分釋放數據的擬合情況

圖6 各水凝膠的流變學結果(, n = 3)

2.6.7 力學性能 為了進一步探究Lig在水凝膠中的作用，將PVA/CS水凝膠、PVA/Lig/CS水凝膠和IS-EE-H進行拉伸試驗，將水凝膠切成條狀（4.5 mm×1.5 mm×10 mm），采用萬能試驗機以50.0 mm/min的拉伸速率進行拉伸測試，記錄拉伸過程中水凝膠應變值和應力值。試驗結果（圖7）顯示，PVA/CS水凝膠斷裂時的應變（斷裂拉伸率）和抗拉強度分別為86.3%和8.0 kPa，PVA/CS水凝膠在變形過程中表現出明顯的應變硬化現象，產生該現象的原因可能是在PVA/CS結晶區內PVA/CS聚合物鏈表現出有限的延展性[13]。當水凝膠中引入Lig后，Lig可能增加了水凝膠的三維空間結構，使其在拉伸過程中自行變形吸引拉力，導致PVA/Lig/CS水凝膠斷裂時的應變和抗拉強度分別為308.3%和63.0 kPa。當PVA/Lig/CS水凝膠包載IS-EE后，IS-EE-H的斷裂伸長率反而降低至229.1%，抗拉強度升至90.0 kPa，產生該結果的原因可能是IS-EE以氫鍵形式包載于PVA/Lig/CS水凝膠中，使水凝膠具有較高的晶體密度，增加了IS-EE-H網絡的剛性，降低了網絡的柔韌[17]。

圖7 水凝膠力學性能實驗結果

2.7 IS-EE-H體外生物評價

2.7.1 細胞相容性試驗 將培養好的細胞（RAW 264.7）接種于96孔板中，1.5×104細胞/孔，分為空白組、DMSO組、IS-EE組、PVA/Lig/CS水凝膠組（PLC-H）和IS-EE-H組，重復3個復孔，培養（5% CO2、37 ℃）過夜。各組分別加入無血清DMEM配制的PBS、DMSO、IS-EE（兒茶素質量濃度分別為25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL，表兒茶素質量濃度分別為43.6、87.2、174.4、347.8 μg/mL）、PLC-H浸提液、IS-EE-H浸提液（兒茶素質量濃度分別為25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL，表兒茶素質量濃度分別為43.6、87.2、174.4、347.8 μg/mL），培養（5% CO2、37 ℃）24 h，吸去細胞上清液，每孔加入100 μL無血清DMEM和10 μL CCK-8溶液，輕輕混勻后孵育（5% CO2、37 ℃）2 h，通過酶標儀測定其在450 nm處的吸光度，計算細胞存活率［細胞存活率＝(實驗孔吸光度－空白孔吸光度)/(對照孔吸光度－空白孔吸光度)］。結果（表4）顯示，IS-EE的細胞存活率與質量濃度呈負相關，且與相對應濃度的DMSO對細胞存活率無明顯影響，該結果表明較高質量濃度的IS-EE可能對RAW264.7細胞具有抑制作用。將PLC-H攜載IS-EE后，在低質量濃度時，IS-EE-H的細胞存活率與其質量濃度呈正相關，細胞存活率均高于76.0%。在高質量濃度時，IS-EE-H的細胞存活率降低至73.5%，該結果與PLC-H實驗結果一致，說明低水平的PLC-H對細胞（RAW264.7）可能具有良好的增殖作用，高水平的PLC-H對RAW264.7細胞可能具有輕微的抑制作用。

表4 IS-EE-H的細胞生物相容性試驗結果(, n = 3)

2.7.2 細胞劃痕試驗 試驗前用記號筆在24孔板背后畫橫線。將培養好的細胞（RAW264.7）接種于24孔板中，1.0×105細胞/孔，分為空白組、IS-EE組、PLC-H組和IS-EE-H組，每組3個復孔，培養（5% CO2、37 ℃）過夜。棄去細胞上清，各組分別加入1 mL無血清DMEM配制的PBS，IS-EE（兒茶素50.0 μg/mL，表兒茶素87.2 μg/mL），PLC-H浸提液，IS-EE-H浸提液（兒茶素50.0 μg/mL，表兒茶素87.2 μg/mL），孵育2 h。采用槍頭（200 μL）在各組細胞正上方垂直孔板預處理的黑線劃痕，劃線完成后，使用無菌PBS清洗細胞2次，去除劃下的細胞，給予LPS（100.0 ng/mL）刺激，將細胞放入細胞培養箱中培養（5% CO2、37 ℃）。分別在不同時間點（8、12、24 h）取出，顯微鏡拍照記錄細胞的愈合情況，以Image J分析各實驗組的劃痕面積，計算傷口愈合率，傷口愈合率越小，說明RAW 264.7遷移率小。結果（表5）表明IS-EE可以抑制RAW264.7細胞遷移，且隨時間點增加抑制效果越明顯。將PLC-H對IS-EE進行包載后，IS-EE-H對RAW264.7細胞的抑制遷移現象更顯著。巨噬細胞是創面愈合炎癥期的主要炎癥細胞，因此，IS- EE-H可能對創面愈合炎癥期治療具有重要作用。

2.7.3 對炎癥因子的影響 將培養好的細胞（RAW 264.7）接種于24孔板中，1.0×105細胞/孔，分為空白組、IS-EE組、PVA/Lig/CS水凝膠組（PLC-H）和IS-EE-H組，每組3個復孔，培養（5% CO2、37℃）過夜。棄去細胞上清液，各組分別加入1.5 mL無血清DMEM配制的PBS，IS-EE（兒茶素50.0 μg/mL，表兒茶素87.2 μg/mL），PLC-H浸提液，IS-EE-H浸提液（兒茶素50.0 μg/mL，表兒茶素87.2 μg/mL），孵育2 h。吸出細胞上清，用PBS清洗細胞2次，給予LPS（100.0 ng/mL）刺激18 h，吸出細胞上清，按照ELISA試劑盒檢測其中IL-6和TNF-α的含量。試驗結果如表6所示，與空白組相比，IS-EE、PLC-H和IS-EE-H能顯著降低LPS誘導巨噬細胞TNF-α的產生。與空白組相比，IS-EE和IS-EE-H對LPS誘導巨噬細胞IL-6的產生表現出抑制作用，但該作用無統計學意義。該結果表明，IS-EE、PLC-H和IS-EE-H可能具有抑制炎癥反應發生的作用。

表5 不同時間點IS-EE-H的細胞劃痕愈合率(, n = 3)

同一時間點與空白組比較：**＜0.01***＜0.001；與8 h空白組比較：##＜0.01###＜0.001；與8 h IS-EE組比較：Δ＜0.05；與8 h PLC-H組比較：&＜0.05。

**< 0.01***< 0.001blank group at the same time point;##< 0.01###< 0.0018 h blank group;Δ< 0.058 h IS-EE group;&< 0.058 h PLC-H group.

2.7.4 抑菌試驗 采用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌通過CFUs試驗評價水凝膠的抑菌活性。用無菌PBS將細菌濃度調整為1.0×108cfu/mL，將PVA/Lig水凝膠浸提液、PVA/CS水凝膠浸提液、PLC-H浸提液、IS-EE（50.0 μg/mL）、IS-EE-H浸提液（IS-EE 50.0 μg/mL）和卡那霉素（kanamycin，50.0 μg/mL）分別與上述細菌懸液孵育（37 ℃）8 h，各混懸液逐步稀釋至 1×10?5濃度，后將其（30 μL）接種于LB培養皿中。在37 ℃下孵育過夜后，拍照記錄菌落數并計數。每組重復3次試驗。計算抑菌率［抑菌率＝(CFU空白組－CFU樣本組)/CFU空白組］。由試驗結果（表7）可知，在水凝膠中增加CS可以增強水凝膠的抗菌效果，且PVA/CS水凝膠、PLC-H、IS-EE-H、卡那霉素（50.0 μg/mL）對大腸桿菌的抑菌率有良好的抑菌效果，均大于99.0%。

表6 IS-EE-H的對細胞炎癥因子的影響結果(, n = 3)

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01blank group.

表7 IS-EE及其有無殼聚糖水凝膠的抑菌結果(, n = 3)

與PVA/Lig組比較：*＜0.05。

*< 0.05PVA/Lig group.

2.8 IS-EE-H體內藥效評價

2.8.1 全層皮膚損傷模型的建立 采用正常雄性SD大鼠（180～220 g）構建全層皮膚損傷模型。將SD大鼠80只隨機分為5組，每組16只，即模型組、陽性對照組（重組牛堿性成纖維細胞生長因子）、IS-EE組、空白凝膠（blank gel，B-G）組、IS-EE-H組。其中IS-EE給藥量為0.315 g/kg（生藥量），IS-EE質量濃度0.26 g/mL。造模前將大鼠麻醉并對其背部脫毛，脫毛后用95%醫用酒精消毒，隨后在每只大鼠的背部創建全層皮膚傷口（1.5 cm×1.5 cm）。造模后第1天開始給藥，隔1天給藥1次，共6次。其中模型組給予300 μL PBS，陽性對照組給予重組牛堿性成纖維細胞生長因子，其余各組分別給予相應藥物。

2.8.2 創面愈合率 采用Image J軟件分析3、7、14 d時各組動物創面的傷口面積，并以第1天傷口面積作為傷口初始面積，計算創面愈合率。由表8可知，與模型組相比，第3、7天時IS-EE-H和陽性藥組傷口面積明顯減小，以第3天尤為顯著，且兩者的創面愈合率分別是模型組的4.3倍和3.5倍，結果表明IS-EE-H具有良好的促創面愈合的作用，產生該作用可能與前面證實IS-EE-H具有良好的生物相容性、抗菌性、抑制炎癥細胞向創口過度聚集有關及抑制TNF-α生成有關。

表8 第3、7、14天各實驗組的創面愈合率(, n = 5)

與模型組比較：*＜0.05***＜0.001。

*< 0.05***< 0.001model group.

2.8.3 再生組織HE染色分析 經藥物干預后，對第3、7、14天的創面再生組織進行HE染色分析，實驗結果如圖8所示，經治療14 d后，與模型組相比，IS-EE-H和陽性藥物組的皮膚組織修復程度相對最好，主要表現在炎性細胞浸潤減少，毛血細管形成增加，纖維組織形成明顯等。IS-EE的皮膚組織修復程度較IS-EE-H和陽性藥物組差，B-G的皮膚組織修復程度相對次之。同時隨著治療時間增加，各組的皮膚創面組織修復效果越明顯。該結果表明，與B-G相比，IS-EE及IS-EE-H具有良好的創面修復作用。

2.8.4 再生組織CD86（B淋巴細胞活化抗原B7-2）和CD163（M130抗原）的表達 選擇表面生物標志物CD86和CD163，分別標記M1和M2巨噬細胞[18-19]，觀察IS-EE-H對創面愈合期間巨噬細胞極化的影響。如圖9所示，與模型組相比，各試驗組CD86的表達在第3、7天時明顯減少，其中第3天時模型組CD86的表達量分是IS-EE組、B-G和IS-EE-H的2.4、1.6、2.2倍，第7天時模型組CD86的表達量分是IS-EE組、B-G和IS-EE-H的4、2、1.5倍（表9）。與模型組相比，各試驗組第3天時CD163的表達無統計學意義，在第7天時，IS-EE-H組CD163的表達量是模型組2.1倍（表9）。該結果表明，在創面愈合前期，IS-EE、B-G和IS-EE-H均具有抑制M1型巨噬細胞向創面過度募集的作用。同時將B-G作為IS-EE緩釋藥物儲庫制備的IS-EE-H可能還具有促進促炎性巨噬細胞（M1型）向抗炎性巨噬細胞（M2型）極化的作用。

圖8 第3、7、14天時再生組織的H&E染色圖像(比例尺50 μm)

圖9 第3、7天時再生組織中CD86和CD163的免疫組化染色照片(比例尺40 μm)

表9 第3、7天各實驗組皮膚再生組織CD86和CD163的陽性面積占比(, n = 3)

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01model group.

2.8.5 再生組織CD31的表達 CD31是一種在早期血管生成中表達的跨膜蛋白[20]，本研究采用CD31免疫組化染色法評價創面的血管生成情況。如圖10-A所示，與模型組相比，IS-EE組和IS-EE-H組的CD31表達明顯，尤其是IS-EE-H組，其在第7、14天時CD31表達分別是模型組的2.5、3.2倍（表10），說明IS-EE組和IS-EE-H組的創面形成了更多成熟結構的毛細血管。該結果表明IS-EE和IS- EE-H可能通過增加創面再生組織中的血管生成促進創面修復。在傷口處理第14天時，B-G組CD31表達量也較模型組顯著，該結果表明，B-G具有一定的促創面愈合作用，該作用可能與其具有良好的保濕性能、生物相容性和抗菌性能有關。

圖10 第7、14天時再生組織中CD31免疫組化(比例尺40 μm, A) 和Masson染色圖片(比例尺50 μm, B)

2.8.6 再生組織膠原纖維沉淀情況 傷口部位膠原蛋白的形成，在傷口愈合重塑期修復受損皮膚組織和增強組織的抗拉強度方面發揮著重要作用[21]，本研究采用Masson三色染色法評價傷口愈合過程中膠原纖維沉積的情況。如圖10-B所示，在第7、14天，各組實驗組均出現了膠原纖維沉積（藍色區域）。與模型組相比，IS-EE組、IS-EE-H和陽性藥組膠原纖維沉積的現象更密集和顯著，以傷口處理后的第14天尤甚，通過定量分析纖維組織表達面積百分比（表11）知，IS-EE組、IS-EE-H膠原纖維組織表達面積百分比是模型組的2.0倍，陽性藥組膠原纖維組織表達面積百分比是模型組的2.4倍。該結果表明IS-EE和IS-EE-H對改善創面愈后質量具有良好作用，該作用可能與前述在創面愈合炎癥期抑制促炎型巨噬細胞向創面過度聚集有關。

表10 第7、14天各實驗組皮膚再生組織CD31的陽性面積占比(, n = 3)

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01。

*< 0.05**< 0.01model group.

3 討論

本研究在單因素考察的基礎上正交試驗設計篩選出最優的PLC-H，即PVA、CS和Lig的質量比為7∶4∶0.5，最優制備工藝為凍融循環次數4次，每次凍結6 h。將PLC-H攜載IS-EE后，IS-EE-H的多孔網狀結構及良好溶脹性能，更有利于傷口組織液和滲出物的吸收以及使藥物發揮緩釋作用。同時PLC-H合適的機械強度，更是為其作為創面敷料提供依據。

表11 第7、14天各實驗組再生皮膚纖維組織表達面積百分比(, n = 3)

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001。

*< 0.05**< 0.01***< 0.01model group.

體外生物評價結果顯示，IS-EE（兒茶素20.0～200.0 μg/mL）的細胞（RAW264.7）存活率與IS-EE濃度呈負相關，將PLC-H對IS-EE進行包載后，IS-EE-H對炎癥細胞（RAW264.7）的抑制遷移現象更顯著，同時IS-EE和IS-EE-H對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有良好的抑菌效果。體內藥效結果顯示，IS-EE-H具有良好的促創面愈合的作用，該作用可能是與其在創面愈合前期減少炎癥細胞浸潤、抑制巨噬細胞向創面過度趨化、促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，同時在創面愈合中后期促進血管生成、增加纖維組織形成等相關。

綜上所述，血人參因其優良的抗炎性能是目前創面愈合治療具有潛力的候選藥物，同時攜載IS-EE的PVA/Lig/CS水凝膠可調控創面愈合炎癥期巨噬細胞的遷移和極化，增殖期血管的生成及重塑期膠原纖維的表達，以改善創面愈后質量，但其具體調控機制及再生組織附屬器（毛囊、汗腺、皮脂腺等）的生成情況等有待進一步系統研究。

此外，本研究還存在其他不足。其一，IS-EE中的指標成分（兒茶素和表兒茶素）對pH敏感，在pH＞6時易降解，如后續將其制備為納米制劑該問題可能會得到有效解決，同時對溫度也較敏感，在制備過程中應加以注意。其二，采用PVA、Lig和CS以凍融法制備的高分子材料水凝膠雖然具備優良的機械性能、抗菌性能等，但其降解能力較薄弱是今后研究需要完善并解決的問題。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of a hydrogel ofextract from Miao medicine and promotion of wound healingandstudy

SONG Xuanfei1, YANG Lu1, XIE Huan1, ZHOU Bin1, LIU Yao1, 2, 3, XU Jian1, 2, 3, ZHANG Yongping1, 2, 3

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. Guizhou Ethnic Medicine Transdermal Drug Delivery Preparation Engineering Technology Research Center, Guiyang 550025, China 3. National Engineering Research Center of Miao’s Medicine, Guiyang 550025, China

To prepare of a polyvinyl alcohol (PVA)/lignin (Lig)/chitosan (CS) hydrogel containing extracts of(IS), a Miao medicine, and investigate its promoting wound healing mechanism.On the basis of single factor investigation, orthogonal test was performed to prefer the prescription process and to evaluate its quality andbiological evaluation, and its promoting wound healing effect was evaluated by establishing a rat whole skin injury model.The optimal prescription and preparation process of PVA/Lig/CS hydrogels carrying the extracts were 7.0 g of PVA, 4.0 g of CS, 0.5 g of Lig, and four freeze-thaw cycles of 6 h each. The gel has a porous mesh structure, good swelling property, moisture retention and some mechanical strength, as well as good biocompatibility, bacteriostatic properties and effective inhibition of macrophage cell migration, and the inhibition effect may be proportional to time. Thepharmacodynamic study of this hydrogel showed that its promoting wound healing effect may be related to the reduction of inflammatory cell infiltration in the wound tissue, promotion of macrophage polarisation towards the M2 type, and increase of capillary formation and fibrous tissue formation.The prepared PVA/Lig/CS hydrogel containing IS extract is simple, stable and feasible to prepare, has good slow-release properties, and has better therapeutic effect on all-over skin injury.

extract; PVA/Lig/CS hydrogel; wound healing;biological evaluation; pharmacodynamic study

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2933 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.008

2023-10-19

貴州省高等學校中藥民族藥（苗藥）新劑型新制劑工程研究中心（黔教技[2022]022）；國家苗藥工程技術研究中心能力提升（黔科合中引地[2023]006）；貴州省高層次創新型人才（黔科合平臺人才-GCC[2023]037）

宋選飛（1996—），女，碩士研究生，主要研究方向為中藥及民族藥藥物新制劑與新劑型。E-mail:xuanfeisong@126.com

通信作者：張永萍（1965—），女，教授，博士研究生導師。主要研究方向為中藥及民族藥新制劑、新劑型與新技術開發研究。E-mail: zgygpg@126.com

徐 劍（1977—），男，碩士，教授，研究方向為中藥制劑新技術與新劑型。E-mail: twt8489@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]