附子理中丸大蜜丸、水蜜丸和濃縮丸3種劑型的化學特征關鍵質量屬性辨識研究

楊莎莎，林 夏，郝怡雯，周 航，張 月，高子希，謝福玉，張 星，傅超美，張 臻

附子理中丸大蜜丸、水蜜丸和濃縮丸3種劑型的化學特征關鍵質量屬性辨識研究

楊莎莎，林 夏#，郝怡雯，周 航，張 月，高子希，謝福玉，張 星，傅超美*，張 臻*

成都中醫藥大學藥學院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

建立附子理中丸（Fuzi Lizhong Pills，FLP）處方的大蜜丸（Dami Pills，FLP-D）、水蜜丸（Shuimi Pills，FLP-S）及濃縮丸（Nongsuo Pills，FLP-N）的HPLC指紋圖譜，同時測定7種藥效成分含量，尋找FLP處方與劑型關聯的化學特征關鍵質量屬性。采用分層抽樣法結合研究實際，隨機抽取市售FLP-D 30批，FLP-S 12批，FLP-N 12批，建立以上54批FLP的HPLC指紋圖譜，并同時測定甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚7種有效成分含量；利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法對FLP-D、FLP-S和FLP-N各自的HPLC指紋圖譜特征峰及7種有效成分進行分析。FLP-D、FLP-S和FLP-N的HPLC指紋圖譜分別標定出20、25、20個特征峰，通過PCA和PLS-DA，篩選出14個差異性標志物，其中8、9、12、17、18、25號峰來自甘草，29、32號峰來自干姜，22號峰來自白術。含量測定結果表明，甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I在FLP-D、FLP-S和FLP-N中的含量差異顯著，其中6-姜酚為變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1.0的差異性標志物。建立的HPLC指紋圖譜與多成分同時測定方法能有效評價FLP-D、FLP-S和FLP-N的化學成分差異；識別出的14個差異性標志物可作為區分FLP-D、FLP-S和FLP-N的潛在化學特征關鍵質量屬性；甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、白術內酯III、白術內酯I可作為區分FLP-D與FLP-N或區分FLP-S與FLP-N的化學特征關鍵質量屬性，6-姜酚可作為同時區分FLP-D、FLP-S和FLP-N 3種不同劑型的化學特征關鍵質量屬性。為進一步完善FLP系列制劑的質量標準提供了參考，同時為解決同方異劑中藥的質控指標同質化問題提供了新思路。

附子理中丸；HPLC；指紋圖譜；甘草苷；苯甲酰新烏頭原堿；黨參炔苷；6-姜酚；白術內酯III；白術內酯I；10-姜酚；劑型差異；化學特征關鍵質量屬性；主成分分析；偏最小二乘法-判別分析；差異性標志物

中醫藥是中華民族幾千年的臨床經驗與智慧的結晶，是中華文明的瑰寶。隨著制劑技術的快速發展，中藥方劑被不斷開發成丸劑、片劑、口服液等多種劑型，相同方劑具備多樣劑型（同方異劑）的現象越來越常見，《中國藥典》2020年版一部中有245首方劑形成了623個同方異劑中成藥品種[1]。但由于中藥的化學成分眾多，藥效物質基礎復雜，使得同方異劑中藥的質控指標趨于同質化，同一方劑中藥的劑型不同但質量標準類似，這種忽略不同劑型的制劑工藝特征背景下的質控標準不能全面反映藥品的質量特征，不利于中藥的現代開發與臨床應用。

不同劑型中藥的制備工藝不同，現代研究表明，制劑工藝影響化學成分的屬性、有無、多寡與相對比例等，從而影響中藥的質量與療效[2]。關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs）是反映產品質量的特征參數，化學特征CQAs主要關注與制劑質量密切相關的化學成分，是反映藥物安全性與有效性的重要標準[3]。白鋼等[4]提出應以中醫藥理論為指導，選取能體現中藥臨床優勢和產品特色的CQAs特征參數，為中藥復方的高質量發展提供科學依據與方法借鑒。因此，辨識能夠充分體現同方異劑中藥劑型特色的化學特征CQAs，有利于解決同方異劑中藥存在的質控指標同質化問題，從而推動中藥的高質量發展。

附子理中丸（Fuzi Lizhong Pills，FLP）出自第一部官方制劑規范《太平惠民和劑局方》，由附子、黨參、干姜、白術、甘草5味中藥組成，全方配伍得宜，堪稱溫中健脾、溫腎助陽之經典名方[5]。目前全國共有176個廠家生產的約262種FLP，主要有FLP大蜜丸（Dami Pills，FLP-D）、FLP水蜜丸（Shuimi Pills，FLP-S）和FLP濃縮丸（Nongsuo pill，FLP-N）3種上市劑型。FLP-D與FLP-S收載于《中國藥典》2020年版一部，FLP-N收載于《衛生部藥品標準中成藥成方制劑第七冊》，3者制劑工藝不同，質控指標卻同質化且單一，其臨床定位也完全一致，FLP-D與FLP-S僅選擇甘草苷作為含量測定指標成分，FLP-N無任何含量測定指標。中藥復方通過多種成分相互作用發揮藥效[6]，僅用單一成分同時作為3種劑型的含量測定指標，既不符合中藥復方療效發揮的特點，也不能體現3種丸劑不同的劑型特征。且有研究表明[7]，附子理中蜜丸與濃縮丸含有的6-姜酚、白術內酯I等9種體外藥效成分含量存在明顯差異。可見，FLP作為“同方異劑”中藥的代表之一，其臨床定位與質控指標同質化問題亟待解決。

基于此，本研究根據目前FLP-D、FLP-S和FLP-N市售品種生產廠家的不同占比（10∶3∶2）同時結合指紋圖譜研究中樣本的譜圖數量需10批及以上的實際需要，采用分層抽樣法隨機抽取來自10、4、4個廠家，每個廠家各3批次的市售FLP-D樣品30批，FLP-S樣品12批，FLP-N樣品12批；采用HPLC方法，建立FLP-D、FLP-S和FLP-N 3種不同劑型的指紋圖譜，并同時測定甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚7種有效成分含量；結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等分析方法，對比研究3種不同劑型FLP所含化學成分的差異，辨識其與劑型相關的化學特征CQAs，為進一步完善FLP的質量標準、保證其臨床合理應用提供參考，為解決同方異劑中藥質控指標同質化問題提供新思路。

1 儀器與材料

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；XM-P221H型超聲波處理器，小美超聲儀器（昆山）有限公司；ARSS4CN型十萬分之一分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

對照品甘草苷（批號AF21030904）購自成都埃法科技有限公司；對照品苯甲酰新烏頭原堿（批號MUST-22102410）、10-姜酚（批號MUST-22073004），均購自成都曼斯特生物科技有限公司；對照品白術內酯I（批號RFS-B03302201010）、白術內酯III（批號RFS-B03502201004）、黨參炔苷（批號RFS-D02602204021）和6-姜酚（批號RFS-J01902111009）均購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；各對照品質量分數均≥98.00%。水為純化水；乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。附子、干姜、白術、甘草、黨參飲片均購自四川國強中藥飲片有限公司，經成都中醫藥大學裴瑾教授鑒定，分別為毛茛科烏頭屬植物烏頭Debx.的子根炮制加工品，姜科姜屬植物姜Rosc.的干燥根莖，菊科蒼術屬植物白術Koidz.的干燥根莖的炮制加工品，豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，桔梗科黨參屬植物黨參(Franch.) Nannf.的干燥根。

為保證抽取樣本具有良好的代表性與盡可能小的抽樣誤差，本研究采用分層抽樣法中的比例分配法，根據3種劑型FLP的生產廠家占比（FLP-D∶FLP-S∶FLP-N＝10∶3∶2），同時結合指紋圖譜研究中樣本的HPLC譜圖數量需10批及以上的實際需要，隨機抽取來自10、4、4個廠家，每個廠家各3批次的FLP-D、FLP-S和FLP-N的30、12、12批次的市售FLP樣品。樣品信息見表1。

表1 54批FLP的樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，0～15%乙腈；2～10 min，15%～20%乙腈；10～17 min，20%～35%乙腈；17～22 min，35%～40%乙腈；22～32 min，40%～50%乙腈；32～42 min，50%乙腈；42～52 min，50%～70%乙腈；52～70 min，70%乙腈；體積流量為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長235 nm；進樣體積10 μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚對照品，精密稱定，加入適量含0.05%鹽酸的甲醇溶液，制成含甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚各成分質量濃度分別為1.37、0.25、0.24、0.78、0.24、0.16、0.20 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 結合文獻方法[8-9]與本研究前期對提取方法的考察結果，分別取3種不同劑型的市售FLP（大蜜丸6 g，水蜜丸4 g，濃縮丸8丸，3種丸劑的生藥量相等），置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，25 ℃下超聲（250 W）提取45 min，放冷，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 單味藥材樣品溶液的制備 分別取附子、黨參、白術、干姜、甘草藥材適量，粉碎，過6號篩，按照“2.2.2”項下方法，制備單味藥材樣品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 參照《中國藥典》2020年版一部項下FLP制法，分別制備缺附子、黨參、白術、干姜、甘草的大蜜丸與水蜜丸，參照《衛生部藥品標準中藥成方制劑第七冊》FLP制法，制備缺附子、黨參、白術、干姜、甘草的濃縮丸。按照“2.2.2”項下方法，制備各陰性樣品溶液。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續測定6次，以13號峰6-姜酚為參照峰，計算得各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批市售FLP（D30），按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.1”項下色譜條件進行分析，以13號峰6-姜酚為參照峰，計算得各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件在制備后0、4、8、12、6、20、24 h進樣分析，以13號峰6-姜酚為參照峰，計算得各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 3種劑型FLP的HPLC指紋圖譜建立 將54批FLP樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2012版，分別設定D30、S8、N7為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度設為0.1 min，進行多點校正和Mark峰匹配，分別得到FLP-D、FLP-S與FLP-N的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（圖1）。FLP-D共標定了20個特征峰（圖1-A），經與混合對照品的色譜結果進行比較分析，鑒定出其中6個色譜峰，分別為4號峰甘草苷、5號峰黨參炔苷、13號峰6-姜酚、15號峰白術內酯III、26號峰白術內酯I、28號峰10-姜酚；FLP-S共標定了25個特征峰（圖1-B），經與混合對照品的色譜結果進行比較分析，鑒定出其中5個色譜峰，分別為4號峰甘草苷、5號峰黨參炔苷、13號峰6-姜酚、15號峰白術內酯III、28號峰10-姜酚；FLP-N共標定了20個特征峰（圖1-C），經與混合對照品的色譜結果進行比較分析，鑒定出其中4個色譜峰，分別為4號峰甘草苷、5號峰黨參炔苷、13號峰6-姜酚、15號峰白術內酯III。

2.4 不同劑型FLP的HPLC指紋圖譜差異性分析

2.4.1 聚類分析 將FLP-D、FLP-S與FLP-N 3種劑型各自的指紋圖譜中的特征峰峰面積作為變量，導入SIMCA 14.1分析軟件，進行聚類分析。結果如圖2所示，當組間距離為4時，54批樣品聚為4類，S1～S7、S9～S12聚為一類，D1～30聚為一類，N1～N12聚為一類，S8聚為一類，以上結果說明FLP-D、FLP-S與FLP-N各自聚為一類，不同類別之間的化學成分的相對含量有較大差異。

2.4.2 PCA 采用SIMCA 14.1分析軟件對FLP-D、FLP-S以及FLP-N 3種劑型的特征峰進行PCA，結果見圖3。由PCA得分圖可知，FLP-D、FLP-S和FLP-N能夠較好地分開，說明不同劑型FLP的化學成分存在較大差異。

2.4.3 PLS-DA 為進一步分析FLP-D、FLP-S以及FLP-N所含化學成分的差異，采用有監督的PLS-DA模型進行分析。以FLP-D、FLP-S以及FLP-N 3種劑型的特征峰數據為變量，利用SIMCA14.1軟件對FLP-D、FLP-S與FLP-N進行PLS-DA。結果如圖4-a～c所示，可知FLP-D、FLP-S與FLP-N存在一定差異，能夠分為3類。由變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）圖（圖4-c）可知，VIP＞1.0的差異化合物有14個，說明3種不同劑型FLP所含的化學成分相差較大。

2.4.4 3種劑型FLP的差異峰歸屬 制備缺附子、缺干姜、缺黨參、缺白術以及缺甘草陰性樣品溶液及單味藥材樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結合各色譜峰的保留時間，通過對比分析，對PLS-DA中識別出的14個差異成分進行峰歸屬，色譜圖對比結果如圖5所示。差異峰中的第8、9、12、17、18、25號峰來自甘草，第29、32號峰來自干姜，第22號峰來自白術，第2、20、26、27、31號峰未識別出藥材來源。

2.5 多成分含量測定

2.5.1 系統適應性考察 按照“2.1”項下色譜條件對混合對照品溶液、FLP供試品溶液和陰性樣品溶液進樣分析，結果表明樣品中各成分的分離度較好，陰性無干擾，HPLC色譜圖見圖6。

圖1 FLP-D (D1～D30, A)、FLP-S (S1～S12, B) 和FLP-N (N1～N12, C) 樣品的HPLC指紋圖譜及其對照指紋圖譜(DR,SR,NR)

圖2 FLP-D (D1～D30)、FLP-S (S1～S12) 和FLP-N (N1～N12) 樣品聚類分析圖

圖3 FLP-D (D1～D30)、FLP-S (S1～S12) 和FLP-N (N1～N12) 樣品的PCA統計分析圖

2.5.2 線性關系考察 取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，采用二倍稀釋法，分別稀釋0、2、4、8、16、32、64、128倍，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。以各成分質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（）建立標準曲線，進行線性回歸，得7個成分的回歸方程與線性范圍，結果分別為甘草苷＝366.9＋1.993 7，2＝0.999 4，線性范圍4.68～600.00 μg/mL；苯甲酰新烏頭原堿＝206.1＋0.258 6，2＝0.999 7，線性范圍0.78～100.00 μg/mL；黨參炔苷＝58.518＋0.045 6，2＝0.999 8，線性范圍0.86～110.00 μg/mL；6-姜酚＝140.8＋0.468 8，2＝0.999 4，線性范圍2.66～340.00 μg/mL；白術內酯III＝262.6＋0.236 3，2＝0.999 5，線性范圍0.86～110.00 μg/mL；白術內酯I＝134.93＋0.070 7，2＝0.999 5，線性范圍0.55～70.00 μg/mL；10-姜酚＝125.02＋0.086 9，2＝0.999 6，線性范圍0.70～90.00 μg/mL。

a-PLS-DA得分矩陣；b-PLS-DA載荷散點圖；c-PLS-DA的VIP值。

圖5 FLP-D (a)、FLP-S (b) 和FLP-N (c) 樣品指紋圖譜的差異峰歸屬色譜圖

1-甘草苷；2-苯甲酰新烏頭原堿；3-黨參炔苷；4-6-姜酚；5-白術內酯III；6-白術內酯I；7-10姜酚。

2.5.3 精密度試驗 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續測定6次，記錄峰面積。計算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.07%、0.44%、2.41%、0.28%、0.55%、0.10%、0.36%，結果表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批市售FLP（D30），按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。計算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚質量分數的RSD分別為2.20%、0.51%、1.39%、0.52%、2.10%、0.70%、0.33%，結果表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取同一批市售FLP（D30）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件在制備后0、4、8、12、16、20、24 h進樣分析，記錄峰面積。計算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.78%、0.50%、0.88%、1.17%、0.72%、1.06%、1.13%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取已測定指標成分含量的同一批市售FLP（D30）6份，每份3.0 g，分別按樣品中各成分含量的100%水平，每份加入各對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。計算得甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚的平均加樣回收率分別為95.60%、99.47%、104.08%、101.64%、98.63%、103.40%、103.78%，RSD分別為2.94%、1.31%、1.26%、1.25%、0.64%、2.84%、0.17%，結果表明該方法的回收率符合要求。

2.5.7 樣品含量測定 54批FLP樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，通過標準曲線計算各批次樣品中甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、6-姜酚、白術內酯III、白術內酯I、10-姜酚的質量分數，結果見表3。甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、白術內酯III、白術內酯I的質量分數為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N，6-姜酚和10-姜酚的質量分數為FLP-S＞FLP-N＞FLP-D。采用SPSS 26.0對FLP-D、FLP-S和FLP-N中的指標成分含量進行單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），＜0.05即為差異具有統計學意義，結果如表4所示，FLP-S中的6-姜酚的含量顯著高于FLP-D；FLP-S中的甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、6-姜酚、白術內酯III及白術內酯I的含量均顯著高于FLP-N；FLP-D中的甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、白術內酯III與白術內酯I的含量均顯著高于FLP-N；黨參炔苷、10-姜酚在FLP-D、FLP-S及FLP-N中的含量無顯著差異。進一步將以上數據導入SIMCA 14.1軟件進行PLS-DA，結果如表5所示，VIP＞1.0的差異化合物有1個，為6-姜酚。

3 討論

3.1 FLP-D、FLP-S和FLP-N的成分差異性分析

3.1.1 HPLC指紋圖譜差異性分析 在FLP-D、FLP-S和FLP-N的指紋圖譜差異性研究中發現：（1）3種劑型特征峰數量為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N；（2）除各自特有成分外，大部分成分的相對含量為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N。以上結果初步表明，FLP-S所含成分的種類與相對含量在3種劑型中最多，FLP-N最少。其原因可能是：一方面，大蜜丸與水蜜丸均為藥材原粉入藥，而濃縮丸中的部分藥材經過滲濾煎煮，提取總量相較于原粉入藥時相對含量較低；另一方面，蜂蜜黏合性較強，會延緩蜜丸的釋藥速度[10]。蜂蜜中含有3/4的糖類[11]，這些糖類化合物含有大量的羧基、羥基等親水基團，具有很強的吸濕性[12-13]，使得蜜丸在溶解時存在“吸水-浸潤-溶解”的反復過程，形成親水性屏障作用的浸膏層，會限制水分子向內滲透與藥物向外擴散，導致蜜丸釋藥緩慢[14]。FLP-D的煉蜜添加量是水蜜丸的近3倍，因此，在相同的提取方法下，本研究在相同時間點取樣，檢測到的FLP-D的成分溶出少于FLP-S。

表3 54批FLP樣品含量測定結果

“?”表示該成分未在樣品中檢出。

“?” means this component is not detected in samples.

表4 FLP-D、FLP-S和FLP-N樣品中的指標成分含量比較()

與FLP-D比較：*＜0.05**＜0.01；與FLP-S比較：##＜0.01。

*< 0.05**< 0.01FLP-D;##< 0.01FLP-S.

表5 FLP-D、FLP-S和FLP-N樣品中各指標成分含量VIP值

PLS-DA共識別出14個差異化合物（VIP＞1.0），第2、8、27、32號峰為FLP-S特有，第17、20、26、31號峰為FLP-D特有，第29號峰為FLP-N特有。以上結果說明，不同劑型FLP所含化學成分存在明顯不同，以上成分可作為區分FLP-D、FLP-S和FLP-N的劑型關聯的潛在化學特征CQAs。14個差異化合物的峰歸屬結果發現，第29、32號峰來自干姜，第22號峰來自白術，第8、9、12、17、18、25號峰來自甘草。FLP以溫陽祛寒、益氣健脾之功效見長，方中干姜、白術為臣藥，發揮溫運中陽、健脾燥濕的功效，甘草起到補中扶正、調和諸藥的作用[15-16]。化學成分是復方發揮療效的物質基礎，3種劑型FLP存在的明顯化學成分差異說明FLP-S、FLP-D與FLP-N在溫運中陽、健脾燥濕、益氣補中等方面的功效發揮可能存在差異，雖然有研究[7,17]表明不同劑型FLP的體內外藥效成分確有不同，但目前并未見相關的藥理藥效實驗研究報道。此外，本研究主要通過比對標準品化合物與樣品中化合物的保留時間確定樣品中的化學成分，仍需進一步通過LC-MS方法對以上化合物進行檢測鑒定。

3.1.2 指標成分確定 本研究參照《中國藥典》2020年版一部中，對FLP處方中單味藥材的含量測定指標，同時結合相關文獻報道，選擇與復方功效密切相關的化學成分進行定量分析。附子中的單酯型生物堿是其發揮藥效的主要成分之一，具有抗炎鎮痛、免疫調節等作用[18-19]；黨參所含成分黨參炔苷是其主要藥效成分，具有健脾、免疫調節等藥理作用，可作為黨參的指標成分[20]；白術中的白術內酯I、III等內酯類成分是其發揮抗炎、治療泄瀉的活性成分[21]；6-姜酚、10-姜酚是干姜中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎等藥理作用，與其回陽通脈功效的發揮密切相關[22-23]；甘草所含黃酮類成分甘草苷等是其發揮藥效的主要成分[24]。在本研究中，附子所含烏頭堿、新烏頭堿未被HPLC檢出，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿在樣品中難以分離。因此，綜合選擇苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、白術內酯I、白術內酯III、6-姜酚、10-姜酚、甘草苷7種藥效相關成分進行定量分析。

3.1.3 多成分含量測定差異性分析 多成分含量測定差異研究分別對FLP-D、FLP-S和FLP-N中的7個藥效相關指標成分同時進行了含量測定。結果發現（表4），甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、黨參炔苷、白術內酯III和白術內酯I的質量分數為FLP-S＞FLP-D＞FLP-N，6-姜酚和10-姜酚的質量分數為FLP-S＞FLP-N＞FLP-D。由此可見，水蜜丸中7個指標成分的質量分數均高于大蜜丸，這進一步說明了煉蜜的添加量對蜜丸藥效成分的質量分數具有重要影響。且有學者研究表明[25]，煉蜜用量對附子理中丸蜜丸中生物堿、甘草酸、白術內酯III等21個活性成分的藥代動力學有重要影響。因此，煉蜜用量及煉蜜所含化學成分或可成為區分不同蜜丸的潛在CQAs。

單因素方差分析發現5種藥效成分在不同劑型中的含量差異顯著，其中甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿、白術內酯III、白術內酯I在2種附子理中蜜丸和濃縮丸中的含量具有顯著差異（＜0.05），可作為區分FLP-D與FLP-N或區分FLP-S與FLP-N的化學特征CQAs；6-姜酚為3種劑型的差異化合物（VIP＞1.0），可作為同時區分FLP-D、FLP-S和FLP-N 3種劑型的化學特征CQAs。黨參炔苷、10-姜酚2種藥效成分在不同劑型中的含量無顯著差異。黨參炔苷作為臣藥黨參的主要活性成分之一，與其健脾的傳統功效密切相關[20]；10-姜酚是代表方中臣藥干姜的傳統藥性的主要成分之一，具有保護脾胃、回陽通脈等作用[23]。黨參炔苷與10-姜酚2種藥效成分作為FLP-D、FLP-S及FLP-N的共性成分，在一定程度上說明了3種FLP在臨床功效與適應癥等方面具有共性，但其用于治療具體疾病的藥效是否有異同仍需進一步研究。

此外，本實驗也對君藥附子中的烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿5種生物堿進行了測定，烏頭堿與新烏頭堿未在樣品中檢出，苯甲酰烏頭原堿與苯甲酰次烏頭原堿在樣品中與其他雜峰混合，難以分離，因此最終選擇分離度較好的苯甲酰新烏頭原堿進行含量測定。結合本課題組的前期研究與參考文獻[17,26-27]，發現烏頭堿與新烏頭堿能被質譜檢測，但含量很低，約為0.1～4.0 μg/g，因此，推測在本研究中未檢出原因可能是其在樣品中含量過低，無法達到最低檢測限度。值得注意的是，目前該方的含量測定指標并沒有對君藥附子相關成分進行規定，僅有烏頭堿限量作為檢查項之一，這既不能很好地體現本方療效，也不利于FLP的臨床有效運用。本研究發現苯甲酰新烏頭原堿在FLP-D與FLP-N，FLP-S與FLP-N中含量差異顯著，因此可考慮將苯甲酰新烏頭原堿等雙酯型生物堿列入含量測定指標，作為區分不同劑型FLP的化學特征CQAs。

3.2 同方異劑中藥含量測定指標存在的問題

目前大多數同方異劑的中藥成方制劑的含量測定規定主要為：（1）大部分制劑含量測定指標同質化，表現為大部分同方異劑制劑使用相同指標，且指標成分僅針對中藥材，與劑型關聯度不大，無法體現劑型特征，如附子理中制劑（FLP-D、FLP-S）、祛風止痛制劑（祛風止痛濃縮丸、祛風止痛片、祛風止痛膠囊）等；（2）部分制劑含量測定指標單一，該類中藥制劑僅使用非君藥的單一成分作為含測指標，不符合中藥復方藥效發揮的特點，如：附子理中丸（大蜜丸、水蜜丸）含測指標為佐使藥甘草的成分甘草苷，八珍丸（水蜜丸、大蜜丸、濃縮丸）含測指標為佐藥白芍的成分芍藥苷；（3）少部分制劑無任何含量測定指標：如龍膽瀉肝丸（小蜜丸、大蜜丸）、香附丸（大蜜丸、水蜜丸）、FLP-N等。可見，同方異劑中藥的質量控制普遍存在問題。

劑型因素通過影響藥物本身所含成分的種類與含量進而影響藥效發揮，大量研究表明[28-31]，同方異劑制劑所含化學成分的種類、含量及其體外溶出、體內吸收等過程與最終藥效均存在明顯不同。有研究[32]發現止嗽散沖劑顆粒與湯劑治療喘息型支氣管炎的臨床療效不同，沖劑中有效成分含量更高可能是其療效更好的原因之一。有學者對不同劑型六味地黃丸的物質組釋放動力學進行可視化表征，發現濃縮丸釋放最快且最完全，小蜜丸和水蜜丸次之，大蜜丸釋放速度最慢、釋藥量小[33]。

銀翹散源自《溫病條辨》，是清熱解毒的代表方劑，但將原方散劑改為丸劑、片劑、膠囊劑時，其釋藥速度變緩，且長時間加熱使有效成分損失，無法達到原方療效[34]。由此可見，同方異劑中藥所含化學成分的種類、含量以及釋藥速度和程度存在差異，且最終影響方劑療效，不使用指標成分、使用單一指標成分，或使用完全相同成分對同方異劑中成藥進行質量控制，均無法體現不同劑型的制劑特征，缺乏合理性。

綜上，本研究通過采用“中藥指紋圖譜結合多指標成分含量測定”的方法，對同方異劑中藥所含化學成分進行對比研究，能夠從定性與定量兩方面分析不同劑型的主要化學成分，同時關注重要藥效成分，辨識與劑型密切關聯的化學特征CQAs，充分體現了同方異劑中藥的劑型特色，為解決同方異劑中藥的質控指標單一、無法體現劑型特征的同質化問題提供了一種參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020.

[2] 李學林, 張珊珊, 劉瑞新. 試論制劑因素對中藥藥性的影響 [J]. 中醫研究, 2014, 27(12): 66-70.

[3] 楊莎莎, 林夏, 黃友, 等. 經典名方關鍵質量屬性及影響因素分析 [J]. 中草藥, 2023, 54(4): 1274-1284.

[4] 白鋼, 張鐵軍, 劉昌孝. 基于監管科學的中藥質量評價方法的整合研究思路和發展方向 [J]. 中草藥, 2022, 53(20): 6313-6318.

[5] 林夏, 黃友, 楊莎莎, 等. 高通量測序技術研究附子理中丸對脾陽虛IBS-D大鼠腸道菌群的影響 [J]. 南京中醫藥大學學報, 2021, 37(3): 388-395.

[6] 陳修平, 尋克麗, 王一濤. 中藥復方藥效物質基礎的系統藥理學評價 [J]. 中草藥, 2010, 41(1): 1-5.

[7] 甘嘉荷. 不同劑型附子理中丸化學成分與入血成分對比研究 [D]. 北京: 中國中醫科學院, 2018.

[8] 陳雪芬, 徐鵬鶴, 歐曉陽. HPLC法同時測定附子理中丸中甘草苷、甘草酸銨白術內酯II和白術內酯III的含量 [J]. 中國中醫藥科技, 2022, 29(1): 41-44.

[9] 武紅娜, 潘海霞, 趙慶林, 等. 附子理中丸質量標準的改進與提升研究 [J]. 中國現代應用藥學, 2020, 37(17): 2098-2102.

[10] 謝余, 李奇娟, 王文俊, 等. 木香類藥物“制劑過程-藥效”綜合分析與展望 [J]. 中藥材, 2019, 42(5): 1198-1203.

[11] 吳國泰, 武玉鵬, 牛亭惠, 等. 蜂蜜的化學、藥理及應用研究概況 [J]. 蜜蜂雜志, 2017, 37(1): 3-6.

[12] 肖瓊, 沈平, 朱蓮華. 中藥固體制劑防潮技術與輔料應用的研究 [J]. 中成藥, 2007, 29(2): 208-211.

[13] Mizrahy S, Peer D. Polysaccharides as building blocks for nanotherapeutics [J]., 2012, 41(7): 2623-2640.

[14] 劉立偉, 董毅智, 李玉坤, 等. 傳統丸劑歷史沿革、科學內涵及丸劑二次開發的發展構想 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2022, 45(6): 571-577.

[15] 趙萱, 陳云慧, 鄭明月, 等. 基于數據挖掘的含人參-附子藥對方劑的組方規律分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(4): 1083-1091.

[16] 武紅娜. 附子理中丸基本信息及臨床應用進展 [J]. 臨床合理用藥雜志, 2020, 13(1): 179-180.

[17] 宋志前, 甘嘉荷, 董運茁, 等. 附子理中丸中制附子的6種生物堿成分含量測定 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2017, 23(10): 55-60

[18] Zhou G H, Tang L Y, Zhou X D,. A review on phytochemistry and pharmacological activities of the processed lateral root ofDebeaux [J]., 2015, 160: 173-193.

[19] 唐梅, 趙立春, 徐敏, 等. 附子化學成分和藥理作用研究進展 [J]. 廣西植物, 2017, 37(12): 1614-1627.

[20] 邊惠琴, 武曉玉, 夏鵬飛, 等. 黨參的研究進展及質量標志物的預測分析 [J]. 華西藥學雜志, 2022, 37(3): 337-344.

[21] 左軍, 張金龍, 胡曉陽. 白術化學成分及現代藥理作用研究進展 [J]. 遼寧中醫藥大學學報, 2021, 23(10): 6-9.

[22] Tian W N, Wang H N, Zhu Y,. Intervention effects of delivery vehicles on the therapeutic efficacy of 6-gingerol on colitis [J]., 2022, 349: 51-66.

[23] 徐桐, 叢竹鳳, 賀夢媛, 等. 干姜的研究進展及質量標志物分析 [J]. 山東中醫雜志, 2022, 41(5): 569-575.

[24] Jiang M Y, Zhao S J, Yang S S,. An “essential herbal medicine” -licorice: A review of phytochemicals and its effects in combination preparations [J]., 2020, 249: 112439.

[25] 甘嘉荷, 王淳, 宋志前, 等. 煉蜜用量對附子理中丸中9種生物堿類成分藥代動力學的影響 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2018, 24(3): 90-96.

[26] Zhang Z, Jiang M Y, Wei X Y,. Rapid discovery of chemical constituents and absorbed components in rat serum after oral administration of Fuzi-Lizhong pill based on high-throughput HPLC-Q-TOF/MS analysis [J]., 2019, 14: 6.

[27] 宋志前, 王淳, 甘嘉荷, 等. 附子理中丸3種劑型中16個活性成分日服用總量的比較 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(19): 17-24.

[28] 孫國祥, 楊婷婷. 用高效液相色譜指紋圖譜定量評價4種不同劑型六味地黃丸質量和工藝差異 [J]. 中南藥學, 2010, 8(2): 148-154.

[29] 令紅艷. 不同板藍根制劑腺苷含量測定及其抗炎作用比較 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(11): 143-145.

[30] 楊華杰, 魏惠珍, 呂尚, 等. 基于化學模式識別和網絡藥理學的六味地黃丸中標志物的預測 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2021, 32(9): 1345-1352.

[31] 趙洪芝, 孟憲生, 葉挺祥, 等. 六味地黃丸的HPLC指紋圖譜和模式識別研究 [J]. 中草藥, 2010, 41(1): 48-51.

[32] 王鎮. 不同劑型止嗽散治療喘息型支氣管炎療效分析 [J]. 實用中醫藥雜志, 2017, 33(8): 876-877.

[33] 葉英響, 陳燁, 翁夏蒙, 等. 不同類型六味地黃丸的物質組釋放動力學特征及其可視化表征 [J]. 中草藥, 2017, 48(21): 4425-4431.

[34] 楊明, 張婧, 宋民憲, 等. 銀翹散原方改劑問題的分析及建議 [J]. 中成藥, 2012, 34(8): 1621-1624.

Identification of critical quality attributes with chemical characteristics of three dosage forms of Fuzi Lizhong Dami Pills, Shuimi Pills and Nongsuo Pills

YANG Shasha, LIN Xia, HAO Yiwen, ZHOU Hang, ZHANG Yue, GAO Zixi, XIE Fuyu, ZHANG Xing, FU Chaomei, ZHANG Zhen

State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To find the chemical critical quality attributes (CQAs) associated with the dosage form characteristics of Fuzi Lizhong Pills (FLP, 附子理中丸) by establishing HPLC fingerprints of Dami Pills (FLP-D), Shuimi Pills (FLP-S) and Nongsuo Pills (FLP-N) and determining contents of seven effective components.According to the stratified sampling method and research requirement, 30 batches of FLP-D, 12 batches of FLP-S and 12 batches of FLP-N were randomly selected from the market. The HPLC HPLC fingerprints of 54 batches of FLP were establishe. The contents of seven effective components, including liquiritin, benzoylmesaconine, lobetyolin, 6-gingerol, atractylenolide III, atractylenolide I, and 10-gingerol were simultaneously determined. Principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) were used to analyze the HPLC fingerprint characteristic peaks of FLP-D, FLP-S and FLP-N and seven active components.There were 20 characteristic peaks in the fingerprints of FLP-D, 25 characteristic peaks in FLP-S, and 20 characteristic peaks in FLP-N. A total of 14 differential markers were determined by PCA and PLS-DA. Among them, peaks 8, 9, 12, 17, 18 and 25 originated from Gancao (et), peaks 29 and 32 originated from Ganjiang (), and peak 22 originated from Baizhu (). The contents of liquiritin, benzoylmesaconine, 6-gingerol, atractylenolide III and atractylenolide I in FLP-D, FLP-S and FLP-N were significantly different. The compound 6-gingerol was a differential marker with variable importance in projection (VIP) value > 1.0.The established HPLC fingerprint and multi-component simultaneous determination method can effectively evaluate the chemical composition differences of FLP-D, FLP-S and FLP-N. The identified14 differential markers could be the potential CQAs of FLP-D, FLP-S and FLP-N. Liquiritin, benzoylmesaconine, atractylenolide III and atractylenolide I could be used as CQAs to distinguish FLP-D and FLP-N, or FLP-S and FLP-N. 6-gingerol could be used as CQAs for differentiating FLP-D, FLP-S and FLP-N simultaneously. Our research provides a reference for further enhancing the quality standards of FLP, and presents a novel idea to address the homogeneity issue in quality control for traditional Chinese medicine with the same prescription but different dosage forms.

Fuzi Lizhong Pills; HPLC; fingerprint; liquiritin; benzoylmesaconine; lobetyolin; 6-gingerol; atractylenolide III; atractylenolide I; 10-gingerol; dosage form differences; chemical critical quality attributes; PCA; PLS-DA; differential markers

R283.6

A

0253 - 2670(2024)09 - 2955 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.010

2023-10-26

四川省科技計劃重點研發項目（2020YFS0567）；四川省科技廳四川省科技計劃項目（2021YJ0251）；四川省中醫藥管理局科學技術研究專項（2023MS600）；成都中醫藥大學杏林學者青基人才專項（QJRC2022027）

楊莎莎，女，碩士研究生，研究方向為中藥新制劑和新劑型研究。E-mail: 1973246652@qq.com

林 夏，女，博士研究生，研究方向為中藥新制劑和新劑型研究。E-mail: 3328116305@qq.com

通信作者：張 臻，女，副教授，主要從事中藥制劑新技術新劑型、中藥復方功效與作用機制研究。E-mail: zhangzhendr@126.com

傅超美，男，教授，從事中藥新制劑和新劑型研究。E-mail: chaomeifu@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]