基于血清代謝組學探究山茱萸多糖對2型糖尿病大鼠的干預機制

崔永霞，尚子慧，侯亞迪，王利麗，孫孝亞，吳明俠*，陳隨清, 2*

基于血清代謝組學探究山茱萸多糖對2型糖尿病大鼠的干預機制

崔永霞1，尚子慧1，侯亞迪1，王利麗1，孫孝亞1，吳明俠1*，陳隨清1, 2*

1. 河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫藥大學豫藥全產業鏈研發河南省協同創新中心，河南 鄭州 450046

基于代謝組學探究山茱萸多糖干預2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠的作用機制。取10只SD雄性大鼠作為對照組，其余大鼠采用高糖高脂飼料結合ip鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導構建T2DM模型。造模成功的大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍（200 mg/kg）組和山茱萸多糖低、中、高劑量（75、150、300 mg/kg）組，各組大鼠每天上午ig藥物，連續給藥4周。末次給藥前大鼠禁食10 h，麻醉后腹主動脈取血并分離血清，同時取肝臟組織。采用試劑盒檢測大鼠血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝臟組織病理變化；采用超高效液相色譜-線性離子阱串聯靜電場軌道高分辨質譜（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS）技術檢測大鼠血清內源性代謝物水平，并結合主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析對差異代謝物進行篩選和鑒定，利用MetaboAnalyst平臺進行代謝通路分析。與模型組比較，山茱萸多糖給藥組大鼠體質量和血糖水平均降低，肝損傷明顯改善；血清中TC、TG、LDL-C、IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA水平和AST、ALT活性均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平和SOD活性顯著升高（＜0.05）。血清代謝組學共篩選出35個與T2DM相關的潛在生物標志物，山茱萸多糖給藥組可回調29個生物標志物，主要涉及苯丙氨酸的代謝和生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代謝、醚脂質代謝和丙酮酸代謝等22條代謝通路。山茱萸多糖能有效改善T2DM引起的糖脂代謝紊亂，減輕肝損傷，達到治療T2DM作用，可能與調節氨基酸代謝、糖代謝、脂質代謝等多條代謝通路有關。

山茱萸多糖；2型糖尿病；UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS；代謝組學；氨基酸代謝；糖代謝；脂質代謝

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代謝紊亂為特征的慢性疾病，主要由環境及遺傳因素引起，其主要發病機制為胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙[1-2]。中醫藥防治糖尿病的應用歷史已有數千年，尤其在T2DM及其并發癥的防控中獨具優勢[3]。中醫學將糖尿病歸屬于“消渴癥”范疇，其主要病機是陰液虧損、燥熱偏盛，臨床表現為陰氣虛弱、氣火旺盛、津傷燥結、瘀積氣血等。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，性酸、澀，微溫，歸肝、腎經，有滋補活絡、澀精固脫的功效。多糖是山茱萸的主要生物活性成分之一，其降血糖的活性關注度較高，但多局限于藥效指標的測定，未能全面闡述山茱萸多糖干預T2DM的作用機制。研究發現，山茱萸多糖對鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠具有降糖、調血脂的作用，可用于治療糖尿病及其并發癥，但其潛在作用機制尚未明確[4]。本研究采用高脂飼料結合ip STZ的方法誘導構建T2DM大鼠模型，通過檢測大鼠血糖、血脂、肝功能、炎癥及抗氧化水平結合肝臟病理形態學觀察，初步評價山茱萸多糖對T2DM大鼠的藥效作用；并利用UHPLC-MS技術進行血清代謝組學研究，揭示山茱萸多糖治療T2DM的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠，體質量110～130 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（浙）2019-0001。大鼠飼養于河南中醫藥大學實驗動物中心，溫度（25±2）℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替，大鼠自由進食飲水。動物實驗經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號DWLL202206094）。

1.2 藥材

山茱萸產自河南西峽，經河南中醫藥大學藥學院王利麗副教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，符合《中國藥典》2020年版規定。

1.3 藥品與試劑

高脂飼料（批號20220617）購自江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；STZ（批號S-0130-5G）購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片（國藥準字H20023370，批號ACD2130）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒（批號A111-1-1）、三酰甘油（triglyceride，TG）檢測試劑盒（批號A110-1-1）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒（批號A113-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測試劑盒（批號A112-1-1）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒（批號C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒（批號C010-2-1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號H002-1-2）、IL-6檢測試劑盒（批號H007-1-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號H052-1-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號A001-3）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號A003-1）購自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈、甲酸（色譜級）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀、LTQ-Orbitrap XL質譜儀、Varioskan LUX多功能酶標儀、SPD2020-230型真空濃縮儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；FSU-1200型冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）；IW-3021HR型高速離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；Milli-QPOD型超純水制備儀（美國Millipore公司）；羅氏卓越金采血糖儀（羅氏血糖健康醫護公司）。

2 方法

2.1 山茱萸多糖的制備

將適量山茱萸藥材在50～60 ℃烘箱中干燥2 h，粉碎成粗粉，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入8倍量95%乙醇，90 ℃加熱回流4 h，濾出殘渣，并揮去殘余乙醇。殘渣再加10倍量蒸餾水，90 ℃加熱回流4 h，濾過，濾液濃縮到1/4體積。取濃縮液，采用Sevag法除蛋白。將脫蛋白后的溶液，加入4倍量95%乙醇攪拌均勻，靜置12 h，濾過，收集沉淀物，冷凍干燥即得山茱萸多糖[5]。采用苯酚-硫酸法測定山茱萸多糖的含量，得山茱萸多糖質量分數大于60%。

2.2 T2DM大鼠模型的建立

70只SD雄性大鼠適應性飼養1周后，隨機選取10只作為對照組，給予普通飼料，其余60只作為造模組，連續4周給予高脂高糖飼料后，所有大鼠禁食不禁水12 h，造模組大鼠ip 30 mg/kgSTZ溶液，對照組大鼠ip等體積檸檬酸鹽緩沖液[6]。分別于注射后第3、6天，大鼠禁食不禁水8 h，尾尖采血測空腹血糖，以連續2次測定血糖值＞11.1 mmol/L同時伴有多飲、多食、多尿、體質量下降等癥狀，視為造模成功。

2.3 分組及給藥

造模成功的大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍（200 mg/kg）[7]組和山茱萸多糖低、中、高劑量（75、150、300 mg/kg）組。各給藥組大鼠每日上午ig相應藥物，對照組和模型組ig生理鹽水（10 mL/kg），1次/d，連續給藥4周。實驗期間，對照組給予普通飼料，其余各組給予高糖高脂飼料。每日觀察大鼠日常狀況。

2.4 檢測指標

2.4.1 體質量、血糖記錄 每周稱定并記錄大鼠體質量，并測定大鼠血糖值。末次給藥前禁食12 h，稱定各組大鼠體質量，測定大鼠空腹血糖值。

2.4.2 生化指標檢測 末次給藥后1 h麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min取上層血清分裝，置于?80 ℃保存備用。將?80 ℃凍存的血清樣品取出，4 ℃復溶，按照試劑盒說明書測定血清中血脂指標（TC、TG、LDL-C、HDL-C），肝功能指標（ALT、AST），炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），抗氧化指標（SOD、MDA）水平。

2.4.3 肝臟指數測定 迅速取出大鼠肝臟組織，冷生理鹽水漂洗，肝臟稱定質量后，部分組織固定于4%多聚甲醛中，計算肝臟指數。

肝臟指數＝肝臟質量/體質量

2.4.4 肝臟組織病理學觀察 各組大鼠肝臟組織經4%多聚甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋，切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

2.5 代謝組學分析

2.5.1 大鼠血清樣品的制備 將儲存于?80 ℃冰箱中的血清取出，4 ℃解凍。精密吸取每個血清樣品各100 μL置于1.5 mL離心管中，加入900 μL甲醇-乙腈（1∶1）于混懸振蕩器上，2 000 r/min渦旋5 min，4 ℃、13 600 r/min離心10 min，取上清液900 μL，置于真空濃縮儀干燥4 h，取出，加入50 μL 80%甲醇復溶，渦旋5 min，4 ℃、13 600 r/min離心10 min，取上清液，待測。

2.5.2 質控樣本的制備 每組抽取2個血清樣本，分別吸取100 μL置于同一離心管中，渦旋混勻，按照“2.5.1”項下方法處理，用于血清代謝組學樣品測定系統穩定性的考察。

2.5.3 色譜及質譜條件

（1）色譜條件：Poroshell 120 SB-Aq預柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），Poroshell 120 SB-Aq預柱（5 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，2% B；5～7 min，2%～60% B；7～12 min，60%～100% B；12～15 min，100% B；15～17 min，100%～2% B；17～20 min，2% B；柱溫35 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量1 μL。

（2）質譜條件：采用ESI電噴霧離子源，掃描模式Full Mass，分辨率為50 000；掃描模式Dependent-MS2，分辨率為60 000，碰撞能量為25%，掃描范圍均為/50～1 000。正離子模式：鞘氣體積流量40 arb；輔助氣體積流量10 arb；離子噴射電壓4.2 kV；離子傳輸管溫度300 ℃；毛細管電壓23 V；管鏡電壓90 V。負離子模式：鞘氣體積流量40 arb；輔助氣體積流量10 arb；離子噴射電壓3.5 kV；離子傳輸管溫度300 ℃；毛細管電壓?35 V；管鏡電壓?78.2 V。

2.5.4 系統穩定性考察 系統穩定性采用質控樣本進行評價。序列進樣前先連續進6針質控樣本以平衡系統，然后每6針樣品運行1針質控樣本，考察系統穩定性。

2.5.5 數據處理及分析 將原始數據導入MSDIAL軟件進行預處理，包括峰識別、峰提取、保留時間對齊、缺失值填充、歸一化以及背景扣除等，得到質荷比、保留時間、分組信息以及歸一化峰面積的數據矩陣。將數據矩陣導入SIMCA-P 14.1進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。根據差異變量權重值（variable important in projection，VIP）大于1.0、組間變化倍數（fold change，FC）＜0.8或＞1.2且＜0.05篩選差異性代謝物。根據HMDB、Mzcloud、PubChem、MassBank數據庫鑒定差異代謝物，比較質譜的質荷比或者精確相對分子質量，誤差限0.01，將鑒定得到的差異代謝物導入MetaboAnalyst 5.0在線網址（https://www. metaboanalyst.ca/）中進行代謝通路富集分析。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 大鼠一般狀態觀察

實驗過程中觀察大鼠，發現對照組大鼠精神狀態良好、毛發正常、活動自如、飲食飲水正常且體質量持續增加；造模后模型組大鼠精神逐漸萎靡、毛發逐漸暗黃，失去光澤，活動量減少，進食飲水量明顯增加，尿量增加且體質量下降。給藥干預后，大鼠上述狀態得到明顯改善。

3.2 山茱萸多糖對T2DM大鼠體質量和血糖的影響

如圖1所示，造模后，與對照組比較，模型組大鼠體質量有下降趨勢，血糖顯著升高（＜0.01）；連續給藥4周后，與模型組比較，各給藥組大鼠體質量升高，血糖有所下降，但均無顯著性差異。

3.3 山茱萸多糖對T2DM大鼠血脂和肝功能的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平及AST、ALT活性均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.05），肝臟指數顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組TC、TG水平和ALT活性均顯著降低（＜0.05、0.01）；二甲雙胍組和山茱萸多糖中、高劑量組LDL-C水平和肝臟指數均顯著降低（＜0.05、0.01）；山茱萸多糖低劑量組HDL-C水平顯著升高（＜0.05）；二甲雙胍組和山茱萸多糖低、高劑量組AST活性顯著降低（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：##P＜0.01；NC-對照組；MOD-模型組；MET-二甲雙胍組；L-CFP-山茱萸低劑量組；M-CFP-山茱萸中劑量組；H-CFP-山茱萸高劑量組，下圖同。

表1 山茱萸多糖對T2DM大鼠血脂和肝功能的影響(, n = 6)

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，表2同。

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as Table 2.

3.4 山茱萸多糖對T2DM大鼠炎癥因子及氧化應激指標的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD活性顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平顯著降低（＜0.05、0.01），SOD水平顯著升高（＜0.05）；山茱萸多糖低劑量組血清中IL-1β、TNF-α和MDA水平顯著降低（＜0.05）；山茱萸多糖中劑量組IL-1β水平顯著降低（＜0.01）；山茱萸多糖高劑量組IL-6、IL-1β和MDA水平顯著降低（＜0.05），SOD活性顯著升高（＜0.05）。

3.5 山茱萸多糖對T2DM大鼠肝臟組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組大鼠肝小葉組織結構完整，肝細胞形態正常，輪廓清晰，肝索呈放射狀分布。模型組大鼠肝小葉和肝索結構被破壞，肝細胞排列散亂，細胞內存在大量脂滴空泡，可見炎癥細胞浸潤。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠肝組織結構有明顯改善，肝細胞排列趨向整齊；山茱萸多糖各劑量組大鼠肝組織上述病變情況均得到不同程度的改善。

3.6 大鼠血清代謝組學分析

3.6.1 代謝圖譜 采用UPLC-MS進行血清樣品的分離和數據采集，各組樣品在正、負離子模式下的總離子流圖見圖3。各組樣品總離子流圖基本相似，但各組峰形及峰面積存在一定差異，表明大鼠體內部分代謝物發生變化。

表2 山茱萸多糖對T2DM大鼠炎癥因子及氧化應激指標的影響(, n = 6)

圖2 山茱萸多糖對T2DM大鼠肝臟組織病理變化的影響(HE, ×20)

圖3 血清樣本在正(A)、負(B) 離子模式下的總離子流圖

3.6.2 多元統計分析 PCA是一種無監督性的模型分析方法，它可以根據數據的相似性對其進行歸類，能夠更真實地反映組間差異，識別組內變異。各組大鼠的血清PCA圖見圖4。在正、負離子模式下，質控樣本均聚集良好，說明系統穩定，數據可靠。各組樣本在95%的置信區間內均可以較好地聚為一類，且各組之間有明顯的離散。

為了更直觀反映各組間的差異，進一步進行有監督模式的OPLS-DA。OPLS-DA得分圖（圖5）顯示，對照組和模型組呈現明顯分離趨勢，說明T2DM大鼠血清代謝輪廓發生了顯著變化；山茱萸多糖各給藥組遠離模型組，逐漸向對照組趨近，說明山茱萸多糖給藥組干預的T2DM大鼠血清代謝物有向正常水平恢復的趨勢，表明山茱萸多糖對T2DM大鼠機體代謝有一定的正向調控作用。OPLS-DA模型中，2和2用于表示數據對模型的解釋能力，正離子模式下2＝0.487，2＝0.721，2＝0.592；負離子模式下2＝0.551，2＝0.869，2＝0.544，均說明模型有良好的預測能力。對OPLS-DA模型進行200次置換檢驗，所有的2值均低于右側原點，且2的回歸線在縱坐標上的截距小于0，可認為模型沒有出現過擬合。

QC-質控樣本。

A、B-正離子模式；C、D-負離子模式。

3.6.3 差異代謝物的篩選和鑒定 基于OPLS-DA模型，以VIP＞1.0、FC＜0.8或＞1.2且＜0.05為條件篩選差異代謝物，并繪制火山圖，見圖6。通過檢索HMDB等數據庫結合二級碎片離子信息對差異代謝物進行鑒定。最終得到血清中有35個與T2DM風險相關的生物標志物，其中正離子模式下有18個，負離子模式下有17個，結果見表3。對比山茱萸多糖給藥組與模型組中生物標志物的含量，發現山茱萸低劑量組可顯著回調17種，與模型組有26個共同代謝物；山茱萸中劑量組可顯著回調14種，與模型組有28個共同代謝物；山茱萸高劑量組可顯著回調17種，與模型組有29個共同代謝物。為了更直觀地比較生物標志物在各組的含量變化，將樣品含量轉化成可視化的熱圖見圖7。水平軸和垂直軸分別代表樣本與生物標志物，顏色深淺反映變量值，紅色表示物質相對含量上調，藍色表示物質相對含量下調。

3.6.4 代謝通路分析 將T2DM大鼠血清生物標志物，以及山茱萸多糖各給藥組可回調的生物標志物，分別導入MetaboAnalyst 5.0網站進行相關的代謝通路分析。選取Impact＞0.1的代謝通路進行分析，見圖8，T2DM大鼠血清中苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代謝、醚脂質代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、丙酮酸代謝、色氨酸代謝和糖酵解/糖異生等23條代謝通路發生紊亂，山茱萸多糖能改善其中22條代謝通路。

A～D-正離子模式；E～H-負離子模式。

表3 T2DM大鼠血清生物標志物

↑表示上調，↓表示下調；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01；L-CFP-山茱萸低劑量組；M-CFP-山茱萸中劑量組；H-CFP-山茱萸高劑量組。

↑ means up-regulated, ↓ means down-regulated;*< 0.05**< 0.01model group; L-CFP-polysaccharides low-dose group; M-CFP-polysaccharides medium-dose group; H-CFP-polysaccharides high-dose group.

4 討論

高血糖、血脂異常和慢性低度炎癥反應是T2DM進展的重要因素[8]。糖尿病患者在臨床上初期表現為“三多一少”，后期會逐步發展成為血脂紊亂；糖脂代謝紊亂會導致大量脂質堆積在肝臟，從而使肝臟細胞內產生氧化應激反應和炎癥反應，引起肝臟損傷；同時，炎癥反應可以通過各種轉錄因子介導的分子途徑、氧化應激反應等激活各種促炎癥介質，這些介質通過血液或旁分泌作用干擾胰島素信號通路的傳導，從而誘導胰島素抵抗，導致糖尿病及脂質代謝紊亂的發生[9-10]。而肝臟受損和胰島素抵抗可進一步加重糖脂代謝紊亂，當糖脂升高，胰島素分泌不足時，又可誘導氧化應激的產生，加速糖尿病的發展惡化，二者相互影響，導致惡性循環[11]，因此改善糖脂代謝紊亂對于治療T2DM有重要意義。本研究結果顯示，給藥前T2DM大鼠進食飲水量和尿量明顯增多，體質量下降，血糖升高。給予藥物干預后，上述癥狀均有不同程度的改善；同時檢測大鼠血清中相關生化指標，結果顯示山茱萸多糖能顯著降低TC、TG、LDL-C、AST、ALT、IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA水平，升高HDL-C水平，提高SOD活性；通過觀察肝臟病理切片，發現T2DM大鼠存在肝損傷情況，給藥干預后，大鼠肝臟的病理形態有所改善。表明山茱萸多糖可以通過降低T2DM大鼠的血糖血脂水平和體內炎癥反應，抑制氧化應激反應，以及改善肝損傷情況，進而調控大鼠體內糖脂代謝紊亂，減輕胰島素抵抗來發揮降糖作用。

圖7 各組大鼠血清生物標志物聚類分析熱圖

A-與T2DM相關通路；B-山茱萸多糖干預的通路。

為進一步探究山茱萸多糖治療T2DM的作用機制，本研究采用非靶向代謝組學方法，用UHPLC-MS技術檢測對照組、模型組、二甲雙胍組和山茱萸多糖低、中、高劑量組大鼠血清內源性代謝物的變化。與對照組比較，模型組大鼠體內-苯丙氨酸、-色氨酸、牛磺酸、馬尿酸、溶血磷脂酰膽堿（-18∶0/0∶0）、丙酮酸、抗壞血酸、-古洛糖酸-γ-內酯等35個代謝物發生顯著性改變；給予山茱萸多糖干預后，其代謝產物有明顯回調趨勢，主要涉及到氨基酸代謝、糖代謝、脂質代謝等代謝途徑。

氨基酸是T2DM的潛在生物標志物，T2DM的發生與血漿芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）水平呈正相關，胰島素抵抗可導致體內芳香氨基酸水平升高[12-13]。苯丙氨酸和色氨酸均是人體必需氨基酸，苯丙氨酸的代謝特征可預測糖尿病的發展，高濃度的苯丙氨酸會破壞胰島素信號傳導，抑制葡萄糖攝取，降低糖尿病患者的胰島素敏感性[14]。色氨酸作為抗自由基活性最強的氨基酸[15]，是犬尿氨酸途徑的來源，犬尿氨酸通路參與免疫激活和炎癥調節，與肥胖和胰島素抵抗有關。此外，色氨酸還被腸道菌群分解代謝，產生多種吲哚衍生物[16]。研究發現色氨酸代謝物能抑制胰島素原合成及胰島素的釋放，降低T2DM的發生風險[17]。本研究實驗結果顯示，T2DM大鼠血清的-苯丙氨酸和-色氨酸水平顯著升高，色氨酸的吲哚代謝物3-吲哚丙酸含量降低；給予山茱萸多糖干預后，代謝物均有回調趨勢，表明山茱萸多糖可能通過調節氨基酸代謝發揮抗T2DM作用。

脂質代謝異常通常表現為與高血脂相關的脂質異常升高。溶血磷脂酰膽堿（-18∶0/0∶0）是甘油磷脂的代謝產物，研究發現脂質中間產物與糖尿病并發的炎癥、氧化應激等密切相關[18]。牛磺酸是一種條件必需氨基酸，不參與蛋白質合成，大量研究表明牛磺酸可以從抗氧化、抗炎、保護胰島β細胞、促進胰島素分泌、改善胰島素抵抗等多方面發揮降血糖作[19]。佟季航[20]發現牛磺酸能夠改善肥胖T2DM大鼠糖脂代謝，減輕肝臟的脂肪變性，緩解大鼠肝臟的氧化應激和炎癥反應。曹志龍等[21]發現牛磺酸可能通過降低細胞內活性氧水平、提升抗氧化酶的活性，從而減輕氧化應激損傷和胰島素抵抗。本研究結果顯示，T2DM大鼠血清中溶血磷脂酰膽堿（-18∶0/0∶0）水平顯著升高，牛磺酸含量顯著降低；山茱萸多糖干預后，代謝物水平均有回調趨勢，且大鼠血清中LDL-C顯著回調，肝組織切片結果顯示脂肪浸潤得到了明顯改善，說明山茱萸多糖對T2DM的脂質代謝紊亂具有調節作用。

丙酮酸是糖酵解的最終產物，可以通過線粒體丙酮酸轉運載體（mitochondrial pyruvate carrier，MPC）進入線粒體，是線粒體氧化代謝的燃料。MPC介導的丙酮酸代謝在T2DM的病理生理過程中發揮重要作用。Zhu等[22]發現在新冠病毒感染肥胖小鼠模型中，MPC抑制劑可降低血糖血脂水平、減輕肺組織炎癥反應。抗壞血酸主要在肝細胞中合成，它能夠通過戊糖磷酸途徑在不同細胞中到達糖酵解/糖異生途徑，是糖酵解/糖異生的底物。Shen等[23]發現Akkermansia能通過調節抗壞血酸和醛酸代謝途徑降低糖尿病腎病大鼠的血糖，減輕炎癥和氧化應激反應。實驗結果顯示山茱萸多糖能顯著降低T2DM大鼠血清中丙酮酸和抗壞血酸代謝物含量，說明山茱萸多糖能通過調節糖代謝改善T2DM。

代謝組學具有系統性、動態性的特點，與中藥的“整體觀”“辯證觀”相吻合，被廣泛應用于中藥的作用機制研究[24]。本研究首次利用UHPLC-MS的非靶向代謝組學方法對山茱萸多糖治療T2DM大鼠的作用機制進行研究，結果表明山茱萸多糖可能通過調節氨基酸代謝、糖代謝、脂質代謝等代謝途徑，從而改善糖脂代謝紊亂及肝損傷情況，達到治療T2DM的作用，為后續山茱萸多糖的臨床開發與應用提供了實驗參考依據。

本研究雖然已篩選出與T2DM相關的生物標志物及代謝通路，但T2DM病因復雜，僅采用非靶向血清代謝組學得出的結果缺乏特征性和專屬性，難以全面闡釋山茱萸多糖抗T2DM的作用機制，在后續的研究過程中，可以利用靶向代謝組學及腸道菌群深入探究山茱萸多糖干預T2DM的確切機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 田文國, 劉毅, 蓋曉紅, 等. 地黃治療2型糖尿病作用機制的研究進展 [J]. 中草藥, 2022, 53(23): 7575-7584.

[2] Pan X F, Chen Z Z, Wang T J,. Plasma metabolomic signatures of obesity and risk of type 2 diabetes [J]., 2022, 30(11): 2294-2306.

[3] 胡佳卉, 錢會南, 白雪芳, 等. 不同中成藥聯合二甲雙胍治療2型糖尿病有效性的網狀Meta分析 [J]. 中醫雜志, 2020, 61(24): 2163-2173.

[4] Wang D Y, Li C X, Fan W C,. Hypoglycemic and hypolipidemic effects of a polysaccharide fromin streptozotocin-induced diabetic rats [J]., 2019, 133: 420-427.

[5] 朱麗芳, 陳露. 山茱萸多糖的提取和多糖降解研究進展 [J]. 現代鹽化工, 2022, 49(5): 7-9.

[6] 李金菊, 吳迪, 方朝暉. 桑葉紅茶片對2型糖尿病模型大鼠糖脂代謝及炎癥因子的影響[J]. 中醫藥臨床雜志, 2022, 34(4): 707-711.

[7] 鄧龍飛, 張建偉, 劉海燕, 等. 地麥活性糖改善II型糖尿病大鼠藥效學研究 [J]. 遼寧中醫藥大學學報, 2021, 23(9): 41-46.

[8] Krause M, de Vito G. Type 1 and type 2 diabetes mellitus: Commonalities, differences and the importance of exercise and nutrition [J]., 2023, 15(19): 4279.

[9] 阮鴻嬌, 葛婷, 胡萬祥, 等. 線粒體動力學、炎癥與2型糖尿病[J]. 承德醫學院學報, 2021, 38(3): 234-239.

[10] Degirmenci I, Ozbayer C, Kebapci M N,. Common variants of genes encoding TLR4 and TLR4 pathway members TIRAP and IRAK1 are effective on MCP1, IL6, IL1β, and TNFα levels in type 2 diabetes and insulin resistance [J]., 2019, 68(9): 801-814.

[11] 曾夢瑩. 牛磺酸干預對2型DM大鼠糖脂代謝及氧化應激的調節作用研究[D]. 新疆: 新疆醫科大學, 2019.

[12] Jin Q, Ma R C W. Metabolomics in diabetes and diabetic complications: Insights from epidemiological studies [J]., 2021, 10(11): 2832.

[13] Li H S, Fang Q Y, Nie Q X,. Hypoglycemic and hypolipidemic mechanism of tea polysaccharides on type 2 diabetic rats via gut microbiota and metabolism alteration [J]., 2020, 68(37): 10015-10028.

[14] 郭慧琴. 燕麥β-葡聚糖改善糖尿病及糖尿病腎病作用機制研究 [D]. 太原: 山西大學, 2023.

[15] Rombauts A, Abelenda-Alonso G, Cuervo G,. Role of the inflammatory response in community-acquired pneumonia: Clinical implications [J]., 2022, 20(10): 1261-1274.

[16] Qi Q B, Li J, Yu B,. Host and gut microbial tryptophan metabolism and type 2 diabetes: An integrative analysis of host genetics, diet, gut microbiome and circulating metabolites in cohort studies [J]., 2022, 71(6): 1095-1105.

[17] Vangipurapu J, Fernandes Silva L, Kuulasmaa T,. Microbiota-related metabolites and the risk of type 2 diabetes [J]., 2020, 43(6): 1319-1325.

[18] 時正媛, 李京峰, 寶麗, 等. 金芪降糖片治療2型糖尿病大鼠的血清代謝組學研究 [J]. 世界中醫藥, 2022, 17(8): 1081-1085.

[19] 趙玉星, 郭俊霞, 陳文. 牛磺酸改善糖代謝的量效分析 [J]. 食品工業科技, 2017, 38(21): 295-301.

[20] 佟季航. 牛磺酸和牛磺膽酸對肥胖II型糖尿病大鼠肝臟氧化應激和炎癥反應的影響[D]. 沈陽: 沈陽農業大學, 2023.

[21] 曹志龍, 李德龍, 陳冰婷, 等. 牛磺酸對胰島素抵抗HepG2細胞氧化應激的保護作用及機制研究 [J]. 現代醫藥衛生, 2021, 37(13): 2157-2160.

[22] Zhu B B, Wei X Q, Narasimhan H,. Inhibition of the mitochondrial pyruvate carrier simultaneously mitigates hyperinflammation and hyperglycemia in COVID-19 [J]., 2023, 8(82): eadf0348.

[23] Shen Z, Cui T, Liu Y,.andameliorate diabetic kidney disease via the “gut-kidney axis” [J]., 2023, 121: 155129.

[24] 張雨馨, 陳碧瑩, 王麗明, 等. 代謝組學在中藥作用機制研究中的應用 [J]. 中南藥學, 2023, 21(7): 1712-1719.

Mechanism of intervention of Corni Fructus polysaccharides in type 2 diabetes mellitus rats based on serum metabolomics

CUI Yongxia1, SHANG Zihui1, HOU Yadi1, WANG Lili1, SUN Xiaoya1, WU Mingxia1, CHEN Suiqing1, 2

1. College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Collaborative Innovation Center of Research and Development on the Whole Industry Chain of Yu-Yao, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To explore the mechanism of intervention of Shanzhuyu () polysaccharides in type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats based on metabolomics.A total of 10 male SD rats were selected as the control group, while the remaining rats were induced to construct a T2DM model using a high sugar and high-fat diet combined with streptozocin (STZ). The successfully modeled rats were randomly divided into model group, metformin (200 mg/kg) group, andpolysaccharides low-, medium-, and high-dose (75, 150, 300 mg/kg) groups, rats in each group were given drugs in the morning for four consecutive weeks. Before the last administration, the rats were fasted for 10 h. After anesthesia, blood was collected from the abdominal aorta and serum was separated, while liver tissue was taken. Kit was used to detect levels of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), malondialdehyde (MDA) and activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), superoxide dismutase (SOD). Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of liver tissue. Ultra-high performance liquid chromatography linear ion trap orbital trap tandem mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS) technology was used to detect the level of endogenous metabolites in serum of rats, and principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis were used to screen and identify differential metabolites. MetaboAnalyst platform was used for metabolic pathway analysis.Compared with model group, the body weight and blood glucose levels of rats inpolysaccharides administration group were reduced, and the liver injury was significantly improved. The levels of TC, TG, LDL-C, IL-6, IL-1β, TNF-α, MDA and activities of AST, ALT in serum were decreased (< 0.05, 0.01), HDL-C level and SOD activity were increased (< 0.05). A total of 35 potential biomarkers related to T2DM were screened by serum metabolomics, and 29 biomarkers were regulated inpolysaccharides administration group, which mainly involved 22 metabolic pathways including phenylalanine metabolism and biosynthesis, taurine and hypotaurine metabolism, ether lipid metabolism and pyruvate metabolism.polysaccharides can effectively improve the glucose and lipid metabolism disorders caused by T2DM, alleviate liver damage, and achieve the effect of treating T2DM, which may be related to the regulation of amino acid metabolism, glucose metabolism, lipid metabolism and other metabolic pathways.

polysaccharides; type 2 diabetes mellitus; UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS; metabolomics; amino acid metabolism; glucose metabolism; lipid metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2024)09 - 2976 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.012

2023-12-22

河南省重大科技專項（221100310400）；河南省科技攻關項目（242102310524）；鄭州市科技協同創新項目（2023XTCX053）；河南中醫藥大學博士科研基金項目（BSJJ2022-04）

崔永霞，副教授，從事中藥質量控制及藥效物質基礎研究。E-mail: 1020076356@qq.com

通信作者：吳明俠，副教授，從事中藥質量控制及藥效物質基礎研究。E-mail: mxwu711@163.com

陳隨清，教授，博士生導師，從事中藥品種整理與質量標準研究工作。E-mail: suiqingchen0371@163.com

[責任編輯 李亞楠]