基于NIRS技術的款冬花藥材質控指標定量分析模型的建立Δ

耿濤，蔣文慧，劉佳倫，蘭松平，王柳瓔，陳佩林，嚴寒靜，姬生國 （廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006）

款冬花（Farfarae Flos）為菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，主要分布在我國華北、西北、西南地區，主產于甘肅、陜西、河北、山西等地。本品始載于《神農本草經》，列為中品，有潤肺下氣、止咳化痰之功效，臨床多用于治療新久咳嗽、喘咳痰多等證[1]，是通宣理肺丸、百花定喘丸等中成藥的重要原料藥[2]。現代藥理學研究表明，款冬花及其提取物具有抗炎、抗腫瘤、抗結核、呼吸興奮及神經保護等藥理活性[3―4]。款冬酮是款冬花的主要活性成分之一，也是其質量評價的重要指標。2020年版《中國藥典》規定款冬花中款冬酮的含量不得少于0.070%，醇溶性浸出物含量不得少于20.0%，但對其水分及總灰分的含量沒有明確規定[1]。《香港中藥材標準》（第五期）對款冬花的水分和總灰分含量有明確規定，要求其水分不得超過11%，總灰分不得超過11%[5]。

以往的研究在對款冬花進行質量評價時，通常采用的是以高效液相色譜法測定款冬酮的含量，以烘干法、熱浸法等方法測定藥材中水分、浸出物及總灰分的含量，但上述方法在實際操作時通常具有程序繁瑣、消耗大量有機試劑、耗時耗力等缺陷。近紅外光譜（nearinfrared spectroscopy，NIRS）法作為一種綠色環保、便捷、高效的分析方法，可以改善上述試驗操作中的弊端，目前已廣泛應用于中藥材或中藥制劑的質量評價中[6―7]。本課題組十余年來一直從事NIRS應用于中藥材及中藥制劑的質量評價研究工作，已經對高良姜[8]、夏枯草[9]、何首烏[10]、陽春砂[11]、益智[12]、穿心蓮[13]、辛夷[14]等藥材進行了相關研究。本研究采用NIRS技術結合偏最小二乘（partial least squares，PLS）法建立了款冬花藥材質控指標定量分析模型，旨在為該藥材及其制劑的快速質量檢測提供可靠的技術和方法。

1 材料

1.1 主要儀器

TANGO型傅里葉變換NIRS儀購自布魯克（北京）科技有限公司；1120型高效液相色譜儀、AY120型十萬分之一天平購自日本島津公司；TQ-Analyst光譜分析軟件購自美國Thermo Fisher Scientific公司；DELTA-D150型數顯超聲清洗機購自上海旦鼎國際貿易有限公司；Q/ZT153-1998型電熱鼓風恒溫干燥器購自浙江正泰儀器儀表有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋購自上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

款冬酮對照品（批號MUST-21101304，純度≥98.89%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。實驗用藥材于2021年12月至2022年3月分別收集于陜西、甘肅、河北等種植基地，經廣東藥科大學中藥學院姬生國教授鑒定為菊科植物款冬T.farfaraL.的干燥花蕾。樣品來源信息見表1。藥材經低溫干燥后粉碎，過四號篩，置于自封袋中，保存在干燥器中備用。

表1 各批次款冬花藥材樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 款冬酮的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為水-甲醇（15∶85，V/V）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為220 nm；進樣量為20 μL。

2.1.2 款冬酮對照品溶液的制備

精密稱取款冬酮對照品5.88 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度為117.60 μg/mL的款冬酮對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取款冬花藥材粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 mL，稱定質量，超聲提取（功率200 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 系統適用性考察

取上述對照品溶液、供試品溶液及空白溶液（乙醇），按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結果顯示，供試品在與對照品溶液中款冬酮相同的出峰位置處有色譜峰出現；款冬酮色譜峰的峰形穩定，與供試品溶液中的其他色譜峰能達到基線分離，理論板數為12 075。

圖1 款冬酮含量測定的高效液相色譜圖

2.1.5 線性關系考察

取“2.1.2”項下款冬酮對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，得款冬酮質量濃度分別為5.88、11.76、23.52、47.04、70.56 μg/mL的系列線性溶液。取上述系列溶液和款冬酮對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以對照品溶液的質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸分析，得回歸方程為Y＝48 417.62X－25 352（r＝0.999 9）。結果表明，款冬酮的檢測質量濃度在5.88～117.60 μg/mL范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.1.6 精密度考察

取“2.1.2”項下款冬酮對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，款冬酮峰面積的RSD為0.51%（n＝6），說明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性考察

取編號S41的樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，款冬酮峰面積的RSD為0.50%（n＝6），說明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性考察

取編號S41的樣品6份，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品含量。結果顯示，樣品中款冬酮的平均含量為0.085 1%，RSD為0.63%（n＝6），說明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗

精密稱取編號S41的樣品（款冬酮含量為0.085 1%）0.5 g，共6份，精密加入含量約為樣品含量100%的對照品0.5 mg，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果顯示，款冬酮的平均加樣回收率為100.72%，RSD為0.97%（n＝6），說明該方法準確度良好。

2.1.10 樣品含量測定

取各批次樣品粉末，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，以外標法按干燥品計算樣品中款冬酮的含量，平行測定3次，取平均值。結果見表2。

表2 各批次款冬花藥材樣品中款冬酮的含量測定結果（n＝3，%）

2.2 水分、醇溶性浸出物及總灰分的含量測定

參照2020年版《中國藥典》（四部）通則0832水分測定法中的烘干法測定樣品中水分含量，以通則2201浸出物測定法下的熱浸法測定樣品中醇溶性浸出物含量，以通則2302灰分測定法測定樣品中總灰分含量。平行測定3次，取平均值。結果見表3。

表3 各批次款冬花藥材樣品中水分、醇溶性浸出物及總灰分含量測定結果（n＝3，%）

2.3 NIRS的采集

取約2/3樣品杯的樣品粉末，緩慢倒進石英樣品杯中，用震動工具輕輕敲打杯體邊緣，使樣品均勻分布。測樣前以空氣作空白對照，掃描扣除空氣背景干擾，并保持環境溫度在（24±0.5） ℃、相對濕度在20%～35%。采用積分球漫反射測樣，儀器參數設置為：分辨率8 cm－1，掃描64次，掃描范圍12 000～4 000 cm－1。每個測試樣品平行掃描5次，求平均值。款冬花樣品的NIRS圖見圖2。

圖2 款冬花藥材樣品的原始光譜圖和導數處理圖

2.4 樣品質控指標NIRS定量分析模型的建立

2.4.1 樣品集的劃分

根據表2、表3含量測定結果將各質控指標含量不合格的樣品及同一產地中含量差異較大的樣品剔除，根據各指標的含量分布情況，均勻選擇其中約4/5的樣品作為校正集，其余樣品作為驗證集。樣品集劃分情況見表4。

表4 樣品集中各質控指標的含量分布

2.4.2 光譜預處理和建模波段的選擇

NIRS的原始光譜數據信息通常包括無用的數據信息，如基線漂移和樣品破碎粒度、樣品顏色、儀器狀態等造成的噪聲。為了使構建的模型精確、穩定，進行光譜預處理至關重要。多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標準歸一化（standard normal variate，SNV）法、一階導數（first derivative）、二階導數（second derivative）、Savitzky-Golay平滑（Savitzky-Golay filter，SG）、導數濾波平滑（Norris derivative filter，ND）等均為常用的光譜預處理方法[15―16]。使用PLS法建立NIRS模型時，應以決定系數（R2）、校正集均方差（root mean square error of calibration，RMSEC）和預測均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）等評價參數用作評估模型質量的標準。當R2越接近1，RMSEC、RMSEP越小，且1＜RMSEP/RMSEC≤1.2時，模型越穩定，預測精準度越好[17―18]。綜合上述各評價參數以確立最優的校正模型，可得款冬花中款冬酮定量模型的最佳光譜預處理方法為MSC+second derivative+ND，水分定量模型的最佳光譜預處理方法為MSC+second derivative，醇溶性浸出物定量模型的最佳光譜預處理方法為SNV+first derivative，總灰分定量模型的最佳光譜預處理方法為SNV+SG。

由圖2可知，款冬花藥材樣品在9 000～6 000、6 000～4 000 cm－1波段的吸光度值變化明顯，包含了豐富的化學信息。為保證樣品光譜信息的全面應用，本研究根據樣品在NIRS區的吸光度值選取5個波段（11 200～4 000、9 000～4 000、6 000～4 000、9 000～6 000、11 200～6 000 cm－1）進行考察，并結合模型評價參數選擇建模區間。結果可得，為款冬花中款冬酮和醇溶性浸出物選擇9 000～4 000 cm－1的波段建模時，模型的評價參數最佳；為其水分和總灰分選擇11 200～4 000 cm－1的波段建模時，模型的評價參數最佳。

2.4.3 主因子數的選擇

采用PLS建模過程中，主因子數的選擇對模型的預測準確性有重要影響，取不同的主因子數建模時，模型的交叉驗證均方差（root mean square error of cross validation，RMSECV）值會有所不同，而RMSECV值越小，模型的預測精確度就越高[19]。本研究利用TQ Analyst軟件進行分析，通過交叉驗證確定模型的主因子數，結果顯示，款冬花中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分定量模型的最佳主因子數分別為10、2、7、13，對應的RMSECV值分別為0.003 68、0.551 01、1.207 02、0.211 37，詳見圖3。

圖3 款冬花藥材各質控指標的主因子數隨RMSECV值的變化圖

2.4.4 NIRS定量分析模型的建立

利用TQ Analyst軟件對款冬花藥材樣品的NIRS數據進行預處理，選擇最佳建模波段和最佳主因子數，分別建立款冬花質控指標款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分的NIRS定量分析模型。結果顯示，4個定量分析模型的R2分別為0.985 8、0.968 4、0.973 4、0.988 0；RMSEC分別為0.001 54、0.187、0.478、0.127；RMSEP分別為0.001 81、0.212、0.543、0.149；RMSEP/RMSEC分別為1.175 3、1.133 7、1.136 0、1.173 2，均在合理范圍內（1＜RMSEP/RMSEC≤1.2）。綜合各評價參數可知，所建立的款冬花藥材中4個質控指標定量分析模型的預測精度較好，模型穩定可靠。款冬花各質控指標真實值與NIRS模型預測值的相關性見圖4。

圖4 款冬花各質控指標真實值與預測值的相關性

2.4.5 模型的外部驗證與評價

為了驗證所建模型的預測準確性，本研究使用所建模型來測定建模中未涉及的驗證集樣品。用NIRS模型的預測值與實測值的比值表示預測回收率，計算驗證集樣品中各質控指標的平均預測回收率。驗證集樣品質控指標含量真實值與NIRS模型預測值的平均絕對誤差及平均預測回收率見表5。表5結果表明，所建NIRS模型對驗證集樣品的預測能力較強、預測結果準確。

表5 驗證集樣品各質控指標的驗證結果

3 討論

本研究測定了19個產地共130批款冬花藥材中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分4個質控指標的含量。其中，款冬酮的含量為0.051 4%～0.103 5%，均值為0.083 4%；產于河北省張家口市蔚縣、山西省長治市沁縣、山東省菏澤市和遼寧省本溪市的樣品中款冬酮含量較高，為0.094 0%～0.103 5%，均值為0.099 0%；產于新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州霍城縣和浙江省杭州市臨安區的樣品中款冬酮含量較低，為0.051 4%～0.064 0%，均值為0.057 2%，低于2020年版《中國藥典》規定。各批次樣品中醇溶性浸出物含量為20.17%～31.12%，均值為24.11%，均符合2020年版《中國藥典》規定。各批次樣品中水分含量為7.75%～10.93%，均值為9.65%；總灰分含量為7.68%～12.10%，均值為9.01%。參照《香港中藥材標準》（第五期）中款冬花藥材水分及總灰分的規定，所有樣品中的水分含量均符合要求；而產于甘肅省隴南市西和縣、甘肅省臨夏回族自治州和政縣的樣品中總灰分含量為11.34%～12.10%，均值為11.71%，不符合該規定。本研究結果表明，不同產地的款冬花藥材樣品，其質量存在一定差異，這可能是因為植物生長的土壤、氣候、生境等因素均會對藥材的質量產生影響；部分樣品的質控指標含量不符合相關標準，還可能因為藥材在采收、加工、炮制、運輸、儲藏等環節中存在不規范操作，導致有效成分損失和雜質含量增加。

NIRS不能直接對樣品含量進行測定，在建立分析模型時，必須使用傳統的分析方法來獲得樣品中待測成分的含量結果，然后結合PLS等化學計量學方法建立模型，最后才可以對未知樣品成分含量進行預測。由于NIRS主要反映的是樣品中化學成分C－H、O－H、N－H等含氫基團產生的吸收信息，因此可以應用NIRS對大部分中藥材進行分析，建立其質控指標的定量分析模型，然后將中藥材NIRS信息直接導入定量分析模型，即可快速預測其質控指標的含量。NIRS不適用于無法獲得大量樣本的樣品，因為在建模時，為保證所建模型穩定可靠，需要收集大量的樣品，以涵蓋不同樣品的特征。本研究收集了19個產地130批款冬花藥材樣品，能基本涵蓋不同產地款冬花藥材的NIRS特征及質控成分含量存在的差異。此外，還需要定期對所建立的NIRS分析模型進行校準，補充其他產地的樣品信息，以適應樣品可能存在的變化。

綜上所述，本研究利用NIRS技術結合PLS，通過選擇最佳光譜預處理方法、建模波段及主因子數，建立了19個產地130批款冬花藥材樣品中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分含量的NIRS定量分析模型。經參數評價和驗證集樣本驗證結果可知，所建立的NIRS模型對各質控指標的含量預測結果均較為準確，說明所建模型穩定性好、測定結果可靠，可以應用于款冬花藥材中款冬酮、水分、醇溶性浸出物和總灰分含量的快速批量預測，為款冬花藥材及其制劑的快速質量評價提供了新思路、新方法。