甲巰咪唑對甲狀腺功能亢進癥大鼠尿液代謝組學的影響研究Δ

盧旭 ，李玲 ，葉濤 ，彭佑鋒 ，何佳馨 ，張寧 #（.貴州中醫藥大學藥學院，貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，貴陽 55000；.貴州中醫藥大學第一附屬醫院康復科，貴陽 55000；.貴州省大方縣中醫醫院藥劑科，貴陽 55699）

甲狀腺功能亢進癥（簡稱“甲亢”）是由多種病因導致的甲狀腺功能增強、甲狀腺激素分泌過多，以甲狀腺腫大、多食易饑、體重減輕以及三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）分泌過多癥候群（包括高代謝癥候群及心血管、消化、骨骼肌肉系統癥狀）為主要臨床表現，可見脛前黏液水腫、指端粗厚等癥狀[1]。甲亢是全球內分泌與代謝病領域較常見的疾病之一，僅次于糖尿病，在我國的發病率呈逐年上升趨勢，給患者家庭和社會帶來沉重負擔[2]。

現代臨床治療甲亢主要以服用抗甲狀腺藥物和手術切除甲狀腺為主[3]。甲巰咪唑是我國臨床治療甲亢的一線藥物，可通過抑制T4合成的關鍵酶，即甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO），從而減少T4的生成，進而有效減輕患者癥狀并恢復其甲狀腺功能[4]，但甲巰咪唑治療甲亢的分子機制尚不明確。

代謝組學是系統生物學研究的重要方法，可鑒別生物體在特定刺激或某種因素影響下產生的潛在代謝物，并有助于確定代謝物及相關代謝通路的變化情況[5]。尿液可快速反映機體狀態，同時對機體的正常生理活動至關重要，加之其檢測簡單、無創，故已成為臨床常規的生物樣本，被廣泛用于非靶向代謝組學研究。基于此，本研究基于超高效液相色譜-飛行時間質譜（UPLC-TOFMS）技術，對甲巰咪唑干預后的甲亢大鼠進行尿液代謝組學分析，旨在從尿液角度揭示甲巰咪唑治療甲亢的作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有AcquityTMUPLC儀、Premier LCT XE型TOF-MS儀（美國Waters公司），KDC-160HR型高速冷凍離心機（科大創新股份有限公司），Milli-Q型超純水系統（美國Millipore公司），BT-3000型電子天平（啟東友洺衡器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

左甲狀腺素鈉片（批號H20140052，規格50 μg/片），甲巰咪唑片（批號010011428，規格10 mg/片）均購自德國Merck公司；T3檢測試劑盒（批號190815）、T4檢測試劑盒（批號190706）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）檢測試劑盒（批號190302）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）檢測試劑盒（批號190518）、游離四碘甲腺原氨酸（free tetraiodothyronine，FT4）檢測試劑盒（批號190621）均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共30只，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004。大鼠自由攝食飲水，飼養于溫度（22±1） ℃、相對濕度50%、每12 h光照/黑暗交替的環境下。本研究方案經江西中洪博元生物技術有限公司實驗動物倫理委員會批準后實施（批準號為2021062701）。

2 方法

2.1 甲巰咪唑改善甲亢的藥效學考察

2.1.1 動物分組、造模與給藥

將30只SD大鼠置于代謝籠中適應性喂養7 d后，按體重均衡原則分為對照組、模型組和甲巰咪唑組，每組10只。模型組和甲巰咪唑組大鼠每天按160 mg/kg（劑量為臨床等效劑量）灌胃左甲狀腺素鈉片混懸液，90 min后甲巰咪唑組大鼠按3.6 mg/kg（劑量為臨床等效劑量）灌胃甲巰咪唑片混懸液，對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，連續15 d。

2.1.2 大鼠基本情況變化考察

每天觀察大鼠的精神狀態、毛發色澤、飲食量、大便性狀和死亡等情況，并記錄其肛溫、體重變化。

2.1.3 大鼠血清生化指標檢測

末次給藥24 h后，各組大鼠腹主動脈取血，離心（3 500 r/min，15 min）得血清，嚴格按照相關試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中T3、T4、TSH、FT3、FT4水平。

2.2 大鼠尿液樣品的代謝組學分析

2.2.1 尿液樣本處理

于給藥第15天收集各組大鼠24 h尿液，用于代謝組學分析。尿液樣本于4 ℃下離心（12 000 r/min，10 min），取上清液至－80 ℃條件下儲存。檢測前，將凍融的尿液于4 ℃下離心（13 000 r/min，10 min），將上清液轉移至1.5 mL離心管中，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液進行UPLC-TOF-MS檢測。

2.2.2 色譜與質譜條件

以ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～15 min，2%A→100%A；15～17 min，100%A；17～18 min，100%A→2%A；18～20 min，2%A）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）進行正、負離子模式檢測，并采用LockSprayTM校正系統進行在線質量校正。脫溶劑氣溫度和離子源溫度分別為350.0、110.0 ℃；脫溶劑氣流量為750.0 L/h；毛細管電壓分別為1 300.0 V（ESI+）和1 500.0 V（ESI－）；錐孔電壓分別為60.0 V（ESI+）和70.0 V（ESI－）；離子能量電壓分別為35.0 V（ESI+）和34.0 V（ESI－）。

2.2.3 數據分析

將UPLC-TOF-MS分析所得數據導入Progenesis QI軟件，并在每個分析步驟中可視化原始數據。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）對數據進行分析，然后以差異倍數（fold change，FC）≥2、P≤0.05和變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1為條件，篩選潛在差異代謝物[6]，并采用MetaboAnalyst 5.0軟件繪制熱圖將數據可視化，然后結合人類代謝組學數據庫（HMDB，http：//www.hmdb.ca/）、京都基因和基因組百科全書（KEGG，https：//www.kegg.jp/）等對差異代謝物及其相關代謝通路進行分析。

2.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 26.0軟件進行分析處理。數據用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 藥效學實驗結果

3.1.1 大鼠基本情況變化

造模7 d后，模型組大鼠出現毛色黃暗而不順、脾氣暴躁、便多等癥狀；與對照組相比，該組大鼠體重顯著降低、肛溫顯著升高（P＜0.01），表明造模成功。甲巰咪唑片干預15 d后，與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠毛色柔順、便量減少，脾氣暴躁等癥狀也有所緩解，體重顯著升高、肛溫顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠體溫和體重變化（±s，n＝10）

表1 各組大鼠體溫和體重變化（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組甲巰咪唑組體重/g 191.48±8.86 157.51±7.59a 176.03±7.24b肛溫/℃35.57±0.45 38.46±0.41a 37.23±0.43b

3.1.2 大鼠血清生化指標檢測結果

與對照組相比，模型組大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4水平均顯著升高，TSH水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4水平均顯著降低，TSH水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠T3、T4、FT3、FT4和TSH的檢測結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠T3、T4、FT3、FT4和TSH的檢測結果（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組甲巰咪唑組T3/（ng/mL）0.62±0.08 0.78±0.09a 0.70±0.08b T4/（ng/mL）8.04±1.16 11.29±1.67a 8.95±1.23c FT3/（ng/mL）1.82±0.16 5.91±0.98a 4.32±0.84c FT4/（ng/mL）18.11±1.51 52.29±8.44a 35.24±6.97c TSH/（mIU/L）1.25±0.13 0.76±0.11a 0.92±0.12b

3.2 尿液代謝組學分析結果

3.2.1 PCA、OPLS-DA結果

PCA結果顯示，對照組、模型組和甲巰咪唑組大鼠的PCA散點均能分開，且組內樣品均能較好地聚集，說明各組間代謝物有明顯差異。進一步OPLS-DA發現，甲巰咪唑組有向對照組回調的趨勢，表明甲巰咪唑可改善甲亢大鼠機體異常代謝情況。結果見圖1和圖2。

圖1 正負離子模式下各組大鼠尿液的PCA圖

圖2 正負離子模式下各組大鼠尿液的OPLS-DA圖

3.2.2 差異代謝物的篩選

由圖3可知，與對照組相比，模型組大鼠尿液中有22個代謝物表達顯著下調，44個代謝物表達顯著上調，196個代謝物表達差異無統計學意義；與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠尿液中有3個代謝物表達顯著下調，23個代謝物表達顯著上調，30個代謝物表達差異無統計學意義。進一步分析發現，上述3組樣品取交集后，共有5個差異代謝物（見表3）。與對照組相比，模型組大鼠尿液中2-氧代-4-甲硫基丁酸和脫氧胞苷顯著下調，癸二酸、利膽酸3-O-葡萄糖醛酸和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達顯著上調（P＜0.01）；與模型組相比，甲巰咪唑組大鼠尿液中癸二酸、利膽酸3-O-葡萄糖醛酸和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01），2-氧代-4-甲硫基丁酸、脫氧胞苷表達均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01），結果見圖4、表4。

圖3 各組大鼠尿液中代謝物的火山圖

圖4 各組大鼠尿液中5個共有差異代謝物的相對強度分析熱圖

表3 5個共有差異代謝物的具體信息

表4 各組大鼠尿液中5個差異代謝物的表達情況（±s，n＝10）

表4 各組大鼠尿液中5個差異代謝物的表達情況（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組甲巰咪唑組癸二酸15 342.49±3 022.08 24 437.23±684.66a 17 865.03±469.05b利膽酸3-O-葡萄糖醛酸304.60±72.33 2 413.57±790.80a 1 043.51±243.49c 2-氧代-4-甲硫基丁酸574.53±162.31 46.58±7.79a 475.10±81.48c N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸666.53±115.94 1 324.61±330.27a 765.92±118.74c脫氧胞苷2 268.30±620.32 1 369.56±320.25a 1 601.84±107.14b

3.2.3 代謝通路的富集分析

5個共有差異代謝物結合HMDB、KEGG數據庫分析發現，甲巰咪唑改善甲亢大鼠代謝紊亂主要涉及戊糖和葡萄糖醛酸相互作用、賴氨酸降解、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及嘧啶代謝這4條代謝通路。結果見表5。

表5 差異代謝物涉及的代謝通路

4 討論

4.1 甲巰咪唑改善甲亢的藥效學變化

左甲狀腺素鈉片為化學合成的T4精制劑，其吸收穩定、作用時間長，在體內轉變成T3而活性增強，具有促進代謝、增加產熱和增強交感-腎上腺髓質系統感受性等作用，可很好地模擬甲亢的臨床表現[7―8]。因此，本研究采用左甲狀腺素鈉片建立甲亢模型。本研究結果顯示，灌服左甲狀腺素鈉片后，模型大鼠出現了典型的甲亢表現，且血清中T3、T4、FT3、FT4水平和肛溫均顯著升高，TSH水平和體重均顯著降低，與甲亢的生化指標變化一致。經甲巰咪唑干預后，模型大鼠血清中上述指標均顯著逆轉，甲亢癥狀明顯改善。

4.2 甲巰咪唑改善甲亢的代謝通路分析

本研究通過UPLC-TOF-MS技術對甲巰咪唑干預后的甲亢大鼠進行尿液代謝組學分析，結果顯示，甲巰咪唑對左甲狀腺素鈉片引起的脫氧胞苷和2-氧代-4-甲硫基丁酸下調，癸二酸、利膽酸3-O-葡萄糖醛酸和N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸上調，均具有顯著的逆轉作用，主要代謝通路涉及戊糖和葡萄糖醛酸相互作用、賴氨酸降解、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及嘧啶代謝。

4.2.1 作用于戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路

戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路用是糖代謝通路中的一部分，其可參與碳水化合物的代謝和能量產生[9]。研究表明，甲亢患者戊糖和葡萄糖醛酸代謝通路發生了變化，表現為戊糖和葡萄糖醛酸之間的轉化速率增加、戊糖的消耗增加、葡萄糖醛酸的產生增加[10―11]。利膽酸3-O-葡萄糖醛酸是由膽汁酸和葡萄糖醛酸結合形成的化合物，可參與戊糖和葡萄糖醛酸之間的相互轉化[12]。本研究結果發現，經甲巰咪唑干預后，甲亢大鼠尿液中利膽酸3-O-葡萄糖醛酸水平下調。由此推測，甲巰咪唑可能通過下調利膽酸3-O-葡萄糖醛酸水平，抑制戊糖和葡萄糖醛酸之間的相互轉化，從而間接抑制甲亢大鼠糖代謝，進而改善甲亢。

4.2.2 作用于賴氨酸降解通路

賴氨酸是一種人體必需的氨基酸，對蛋白質合成和細胞功能至關重要，其降解后可以產生能量和其他代謝產物，然后在甲狀腺激素合成過程中被利用[13―14]。研究表明，甲亢患者可能會出現賴氨酸降解增加的情況，從而導致賴氨酸穩態失衡[15]。N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸是賴氨酸的一種修飾形式，可調節蛋白質功能和細胞代謝，從而影響賴氨酸降解的速率[16]。在甲亢患者中，甲狀腺激素的過度分泌可能會上調N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達，進而影響賴氨酸的降解過程[17]。本研究結果發現，經甲巰咪唑干預后，甲亢大鼠尿液中N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸下調。由此推測，甲巰咪唑可能通過下調N6，N6，N6-三甲基-L-賴氨酸表達，抑制賴氨酸降解，從而減少甲狀腺激素的合成和釋放，進而改善甲亢。

4.2.3 作用于半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路

半胱氨酸和甲硫氨酸代謝是維持細胞內半胱氨酸和甲硫氨酸水平的重要途徑，甲亢患者過度分泌甲狀腺激素也會影響半胱氨酸和甲硫氨酸的代謝[18]。2-氧代-4-甲硫基丁酸是半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路中的中間產物，其可作為甲硫氨酸的前體，參與甲硫氨酸的合成[19]。甲巰咪唑作為抗甲亢藥物，主要通過抑制TPO來阻礙甲狀腺激素T4和T3的合成，半胱氨酸在甲狀腺激素合成過程中參與碘化反應，甲硫氨酸在甲狀腺激素合成過程中參與甲基化反應[20—21]，這提示甲巰咪唑可能會通過抑制半胱氨酸的碘化和甲硫氨酸的甲基化反應，影響甲狀腺激素的合成。本研究也發現，甲巰咪唑可顯著上調甲亢大鼠2-氧代-4-甲硫基丁酸的水平，故推測甲巰咪唑可通過抑制TPO來阻礙甲狀腺激素的合成，改善甲亢大鼠半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，促進甲硫氨酸的合成。這種上下游的銜接使得甲巰咪唑能夠有效地改善機體蛋白質合成和其他相關生物過程，進而防治甲亢。

4.2.4 作用于嘧啶代謝通路

嘧啶核苷酸是構成DNA和RNA的重要組成部分，因此嘧啶代謝對于維持細胞功能、傳遞遺傳信息至關重要[22]。甲狀腺激素可通過促進嘧啶核苷酸的合成和降解，從而影響嘧啶代謝的平衡[23]。脫氧胞苷是一種嘧啶核苷酸，可通過酶的催化作用轉化為脫氧胞苷酸，進而參與DNA的合成和修復過程[24]。研究發現，甲亢患者脫氧胞苷水平下調，這可能是由于甲狀腺激素過度分泌導致嘧啶代謝紊亂，進而影響脫氧胞苷的合成和降解[25]。本研究結果發現，經甲巰咪唑干預后，甲亢大鼠尿液中脫氧胞苷水平上調。由此推測，甲巰咪唑可能通過上調脫氧胞苷表達，調節甲亢大鼠嘧啶代謝紊亂，進而改善甲亢。

綜上所述，甲巰咪唑可能是通過調節戊糖和葡萄糖醛酸相互作用、賴氨酸降解、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及嘧啶代謝，從而發揮改善甲亢的作用。