清上蠲痛湯標準湯劑揮發油的UPLC特征圖譜建立及成分分析Δ

范志穎 ，祝倩倩 ，王協和 ，翟燕娟 ，王慧敏 ，顧楊欣 ，周海琴 ，陸兔林 ，張科衛 #，李松 （.南京中醫藥大學藥學院，南京 003；.江陰天江藥業有限公司，江蘇 江陰 4434）

2018年國家中醫藥管理局發布了第一批《古代經典名方目錄》，清上蠲痛湯位列其中。清上蠲痛湯出自明代醫家龔廷賢《壽世保元》（卷六）“頭痛門”的第一方，由酒當歸、川芎、白芷、細辛、羌活、獨活、防風、菊花、蔓荊子、蒼術、酒黃芩、麥冬、甘草共13味藥材組成，生姜煎服，為治療頭痛的經典方劑，具有疏風散寒除濕、行氣活血、通絡止痛的作用。該方含揮發油類成分的藥材較多，且這些揮發油類成分具有鎮痛、抗炎、抗腦缺血等藥理作用[1]。如方中的酒當歸、川芎、白芷、細辛、羌活等藥材輕清上達，可疏風通絡、松透伏邪，與該方主治頭痛相符，故對清上蠲痛湯揮發油類成分進行探索和研究具有重要意義。

目前，關于清上蠲痛湯的研究多集中于臨床應用以及該方水煎液中水溶性成分的指紋圖譜、特征圖譜、煎煮工藝與質量控制等方面[2]。雖然有學者對該方中揮發油類成分進行了相關研究，但仍側重于方中的水溶性成分，對揮發油類成分的研究尚不夠全面。鑒于此，本研究擬建立清上蠲痛湯標準湯劑揮發油的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，并利用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）法和氣質聯用（GCMS）法分析和鑒定該方中的揮發油類成分，旨在為該方基準樣品標準的制定、后續制劑工藝的研究及質量標準的建立提供借鑒。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6530型串聯四極桿飛行時間質譜儀、8890A-7000D型GC-MS儀（美國Agilent公司），JJ500型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），ME204型萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，POMEX型揮發油提取器（北京北玻博美玻璃有限公司），Milli-Q?IQ7005型純水系統（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

甲基丁香酚對照品（批號111642-200301，純度＞98.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內酯A對照品（批號ST10580120，純度＞98.0%）、藁本內酯對照品（批號RS04251081，純度＞98.0%）均購自上海詩丹德生物技術有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

清上蠲痛湯所用藥材均購自道地產區或主產區。藥材基原、藥用部位、產地及采收加工均明確，藥材經江陰天江藥業有限公司藥材鑒定高級工程師唐波鑒定均為真品。采用隨機數字表法將15批清上蠲痛湯組方飲片進行組合，15批飲片批次產地信息見表1。

表1 15批清上蠲痛湯樣品組方飲片的批次產地信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters CORTECS C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～2 min，25%A→34%A；2～13 min，34%A；13～15 min，34%A→35%A；15～27 min，35%A；27～28 min，35%A→25%A；28～32 min，25%A）；柱溫為30 ℃；檢測波長為235 nm；流速為0.3 mL/min；進樣量為0.5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準湯劑

本研究根據清上蠲痛湯最佳煎煮工藝[2]，放大6倍進行標準湯劑的制備：取酒當歸22.38 g、川芎22.38 g、白芷22.38 g、細辛6.72 g、羌活22.38 g、獨活22.38 g、防風22.38 g、菊花11.22 g、蔓荊子11.22 g、麩炒蒼術22.38 g、酒黃芩33.60 g、麥冬22.38 g、甘草6.72 g，粉碎（過4目篩網），加水2 438 mL，浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，200目篩趁熱濾過；藥渣加水1 896 mL，煮沸后再煎煮15 min，200目篩趁熱濾過；合并2次濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液

（1）全方供試品溶液。將“2.2.1”項下制備的清上蠲痛湯標準湯劑趁熱轉移至5 000 mL圓底燒瓶中，加入玻璃珠數粒，連接揮發油提取裝置，自收集器上端加水使其充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶中，電熱套加熱并保持微沸狀態，回流4 h后冷卻；由提取器上端加入乙酸乙酯1 mL，收集乙酸乙酯層至2 mL量瓶中，用乙酸乙酯洗滌冷凝管及揮發油提取器內壁，洗液并入同一量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，即得清上蠲痛標準湯劑揮發油。從已收集的揮發油中精密吸取100 μL，置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得全方供試品溶液（即標準湯劑揮發油）。

（2）單味藥供試品溶液。分別按“2.2.1”項下稱樣量及方法制備單味藥標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法制備單味藥供試品溶液。

（3）陰性制劑供試品溶液。分別按“2.2.1”項下稱樣量及方法制備各單味藥的缺味陰性標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法制備成各缺味陰性制劑供試品溶液。

2.3 清上蠲痛湯標準湯劑揮發油UPLC特征圖譜的建立及分析

2.3.1 方法學考察

（1）精密度試驗。取清上蠲痛湯（編號S1）飲片，先按“2.2.1”項下方法制備標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法制備全方供試品溶液，最后按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次。以穩定性、分離度好的8號峰作為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間的RSD均＜0.05%、相對峰面積的RSD均＜0.02%（n＝6），表明方法精密度良好。

（2）重復性試驗。取清上蠲痛湯（編號S1）飲片，先按“2.2.1”項下方法制備標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法平行制備6份全方供試品溶液，最后按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以8號峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間的RSD均＜0.03%、相對峰面積的RSD均＜0.95%（n＝6），表明方法重復性良好。

（3）穩定性試驗。取清上蠲痛湯（編號S1）飲片，先按“2.2.1”項下方法制備標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法制備全方供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以8號峰為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間的RSD均＜0.17%、相對峰面積的RSD均＜2.95%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.2 UPLC特征圖譜建立及相似度評價

取15批清上蠲痛湯（編號S1～S15）飲片，先按“2.2.1”項下方法制備標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法制備全方供試品溶液，最后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以S2樣品的特征圖譜作為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，采用中位數法，進行多點校正和Mark峰匹配，得到15批樣品的特征圖譜及對照特征圖譜（R）；以對照特征圖譜（R）為參照，計算15批清上蠲痛湯樣品的相似度。結果顯示，共得到12個共有峰；15批樣品的相似度在0.949～0.997之間，相似度較高。結果見圖1。

圖1 15批清上蠲痛湯標準湯劑揮發油的UPLC疊加特征圖譜

2.3.3 共有峰的歸屬

取清上蠲痛湯（編號S2）飲片，按“2.2.1”項下方法制備標準湯劑，再按“2.2.2（1）”項下方法制備全方供試品溶液；取酒當歸、川芎、白芷、細辛、羌活、獨活、防風、菊花、蔓荊子、麩炒蒼術、生姜11味含揮發油類成分的飲片，按“2.2.2（2）”項下方法制備各單味藥供試品溶液，并按“2.2.2（3）”項下方法制備缺味的各陰性制劑供試品溶液。取上述3種溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。通過比對3種溶液的色譜圖發現，清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分的12個共有峰主要來源于當歸、川芎、羌活、細辛4味飲片。其中，1、4號峰來源于羌活，2、3、5、7、8號峰來源于細辛，1、4、10、11、12號峰來源于當歸，1、9、10、11、12號峰來源于川芎、羌活、細辛、當歸，詳見圖2；而白芷、獨活、防風、菊花、蔓荊子、蒼術、生姜在本色譜條件下未有相應色譜峰歸屬信息。

2.4 UPLC特征圖譜中共有峰的UPLC-Q-TOF/MS鑒定

2.4.1 檢測條件

色譜條件同“2.1”項。質譜檢測條件如下：離子源為電噴霧離子源（ESI）；干燥氣溫度為300 ℃；流量為8 mL/min；霧化器壓力為35 psi；正離子模式下毛細管電壓為4 000 V，毛細管出口電壓為175 V，錐孔電壓為65 V；采用高分辨模式進行數據采集，質荷比（m/z）為100～2 000；霧化壓力為5 psi。

2.4.2 共有峰鑒定

取“2.2.1（1）”項下全方供試品溶液（編號S2），采用UPLC-Q-TOF/MS法，按“2.4.1”項下條件進樣檢測，根據質譜檢測數據結合參考文獻和化學數據庫對清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分共有峰進行快速鑒定。結果見表2。

表2 清上蠲痛湯標準湯中揮發油類成分共有峰UPLCQ-TOF/MS鑒定結果

2.5 GC-MS法分析清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分

2.5.1 供試品溶液制備

取清上蠲痛湯（編號S2）飲片，按“2.2.2（1）”項下方法制備清上蠲痛湯標準湯劑揮發油。精密吸取揮發油100 μL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，加適量無水硫酸鈉脫水，即得。

2.5.2 檢測條件

色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣量為1 μL；分流比為10∶1；進樣口溫度為240 ℃；升溫程序為起始溫度70 ℃、保持1 min，以5 ℃/min升溫至150 ℃、保持1 min，再以5 ℃/min升溫至160 ℃、保持2 min，接著以2 ℃/min升溫至180 ℃、保持1 min，最后以12 ℃/min升溫至230 ℃、保持4 min；載氣為氦氣；進樣口溫度為240 ℃；離子源為電子轟擊離子源（EI）；電子能量為70 eV；接口溫度為230 ℃；掃描范圍為50～550 amu。

2.5.3 清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分的分析

取“2.5.1”項下供試品溶液，采用GC-MS法，按“2.5.2”項下條件進行分析，通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0化學工作站NIST17.L譜庫檢索，從清上蠲痛湯標準湯劑揮發油中共鑒定出23個成分，占總含量的82.66%。通過Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0化學工作站數據處理系統，按峰面積歸一化法計算這23個成分的相對百分含量。結果顯示，主要化學成分有3，4，5-三甲氧基甲苯、百秋李醇、Z-藁本內酯，分別占揮發油總量的9.19%、19.10%、21.10%。結果見表3。

表3 清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分的GC-MS鑒定結果

3 討論

3.1 處方量的選擇及標準湯劑揮發油的提取

清上蠲痛湯原處方單味藥量較少，揮發油難以提取，因此本研究將最佳煎煮工藝放大6倍，進行標準湯劑制備與揮發油收集。由于揮發油研究是針對清上蠲痛湯標準湯劑展開的，因此在制備全方供試品溶液時先制備標準湯劑，繼而趁熱提取水煎液中的揮發油。

3.2 定性分析方法的選擇

本研究采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》確定UPLC特征圖譜的共有峰，再通過UPLC-Q-TOF/MS法進行共有峰指認。由于在正離子模式條件下清上蠲痛湯標準湯劑中揮發油類成分的出峰數量較多、峰形好、基線較穩定、分離度好，因此最終選擇在正離子模式下檢測。筆者前期通過與對照品比對，指認出UPLC特征圖譜12個共有峰中的8號峰為甲基丁香酚、9號峰為洋川芎內酯A、11號峰為藁本內酯。為了更加全面地表征清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分，本研究采用UPLC法建立清上蠲痛湯標準湯劑揮發油特征圖譜，輔以GC-MS法對清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分進行定性分析。

3.3 色譜及樣品制備條件優化

3.3.1 UPLC色譜條件優化

本研究前期通過比較不同波長（235、245、255 nm）發現，檢測波長為235 nm時各化合物的響應值最大，色譜峰分離較好。此外，本研究還比較了甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-水6種不同流動相體系對色譜峰分離效果的影響，最終根據出峰數量及響應值情況等，選擇乙腈-水為本研究的流動相。

3.3.2 GC色譜條件優化及稀釋溶劑選擇

由于清上蠲痛湯中揮發油類成分比較復雜，因此本研究選擇程序升溫，以提高各揮發油類成分的分離度和分辨率。本研究前期比較了不同稀釋溶劑（乙酸乙酯、正己烷、甲醇）的分離效果，最終選擇了響應值最大、分離度最好的甲醇作為稀釋溶劑。此外，本研究還考察了HP-5 MS、DB WAX、DB1701這3種毛細管色譜柱的分離效果，最終選擇HP-5 MS毛細管色譜柱。

3.4 活性成分分析

本研究建立了UPLC特征圖譜，并采用UPLC-QTOF/MS法對15批清上蠲痛湯標準湯劑揮發油的12個共有峰進行了鑒定。由圖1可知，其主要化學成分有甲基丁香酚（8號峰）、E-藁本內酯（11號峰）、E-正丁烯基苯酞（12號峰）。其中甲基丁香酚具有抗炎、鎮痛、抑菌的作用[11]；E-藁本內酯具有抗炎、保護腦血管的作用[12]；E-正丁烯基苯酞作為苯酞類成分，具有神經保護作用[13]。在清上蠲痛湯標準湯劑揮發油類成分的GC-MS檢測中，發現其主要化學成分有3，4，5-三甲氧基甲苯、百秋李醇、Z-藁本內酯。其中，3，4，5-三甲氧基甲苯具有抗炎、鎮痛的藥理作用[14]，百秋李醇具有抗炎、抗菌、鎮靜、抗動脈粥樣硬化、調節免疫功能的生物活性[15]，Z-藁本內酯具有抗腦缺血、保護神經的作用[16]。

綜上所述，本研究選擇道地產區或主產區的代表性樣品隨機組方進行標準湯劑揮發油的研究，建立的UPLCQ-TOF/MS、GC-MS及UPLC特征圖譜定性分析方法較為全面地表征了清上蠲痛湯標準湯劑揮發油中的化學成分。通過分析可初步推測，甲基丁香酚、藁本內酯、E-正丁烯基苯酞、百秋李醇、3，4，5-三甲氧基甲苯可能是影響清上蠲痛湯揮發油臨床治療效果的主要活性成分。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突）