血根堿對腰椎間盤突出癥大鼠炎性疼痛的改善作用及機制Δ

阮禎 ，何生華 ，龔雪花 ，喬松 ，王超 （.武漢市中醫醫院推拿科，武漢 40000；.武漢市第七醫院中南路街第一社區衛生服務中心，武漢 40060；.湖北省中西醫結合醫院康復醫學中心推拿科，武漢 4000）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是一種常見的臨床脊柱疾病，是由于各種原因導致腰椎間盤纖維環部分或完全破裂，髓核組織從破裂口向后突出，刺激或壓迫神經根和馬尾神經的臨床綜合征[1]。LDH具有腰痛、麻木、下肢疲勞等多種臨床表現，嚴重影響患者的生活質量和工作能力。研究表明，LDH的發病機制與機械性神經根壓迫和炎癥有關，LDH髓核病變導致背根神經節（dorsal root ganglia，DRG）炎癥反應增強，會引起持續性疼痛反應[2]。目前，LDH的治療方案主要是保守治療和手術治療，但是大多數保守治療可能出現癥狀無改善的情況，而手術治療存在一定副作用。因此，迫切需要治療效果更好的新藥來治療LDH引起的神經性疼痛。

血根堿（sanguinarine，SG）是從血根草和其他罌粟藍堇屬植物的根中提取的生物堿，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用[3]。已有研究表明，SG可通過抑制小膠質細胞和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路的激活來減輕神經性疼痛[4]。因此，本課題組推測SG對LDH大鼠炎性疼痛有改善作用。研究表明，各種炎癥刺激會導致免疫細胞中MAPK、胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）的磷酸化激活，激活的MAPK可促進核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活，進而促進腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的產生。有報道指出，激活LDH大鼠脊髓組織中MAPK/ERK/NF-κB信號通路可促進炎癥反應，進而導致神經性疼痛[5]。此外，有研究表明，SG可通過抑制慢性縮窄損傷大鼠脊髓組織中p38 MAPK激活的神經炎癥來減輕神經性疼痛[6]。但SG是否可通過抑制MAPK/ERK/NF-κB信號通路激活，減輕LDH大鼠炎性疼痛尚不明確。基于此，本研究基于MAPK/ERK/NF-κB信號通路，探討SG對LDH大鼠炎性疼痛的改善作用及機制，旨在為SG應用于LDH的治療提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

1.2 主要試劑與儀器

SG標準品（批號230604，純度≥98%）購自武漢艾美捷科技有限公司；Anisomycin（MAPK激活劑，批號221115，純度≥99%）購自美國MCE公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號221209）購自上海一研生物科技有限公司；TNF-α、神經肽Y（neuropeptide Y，NPY）的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為230204、230412）均購自上海信裕生物科技有限公司；5羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、IL-1β的ELISA試劑盒（批號分別為220908、220814）均購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔源離子鈣接頭蛋白1（ionized-calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）、膠質原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、p38 MAPK、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、ERK1/2、磷酸化NF-κB p65（p-NFκB p65）、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和GAPDH抗體（批號分別為221103、221216、230105、230403、230212、230310、230306、221109、221004、230304、230211）均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（批號230106）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 主要儀器

本研究所用主要儀器有Multiskan GO型全自動酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司）、DM IL LED型熒光顯微鏡（德國Leica公司）、Ugo Basile型足底熱痛儀（上海玉研科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

隨機選取10只大鼠作為對照組，剩余大鼠參照文獻[7]構建LDH模型，具體操作如下：麻醉大鼠，將背部和腹部脫毛，在距肛門約1 cm的尾根處切一個3～3.5 cm長的切口，從第二和第三椎骨之間的尾椎間盤中取出髓核。在背側切開內側縱切口，依次剝離皮膚、皮下組織和腰背筋膜，沿旋突左側將骶棘肌剝離并分離，切斷左側L4至L5椎板、關節突和部分椎弓根，暴露左側神經根以及L4、L5相應的DRG，將自體髓核放入硬膜外腔，縫合傷口。對照組大鼠暴露神經根，切除尾椎髓核，不進行移植。術后3 d靜脈注射青霉素防止感染。當造模大鼠出現精神萎靡、行走緩慢、后肢跛行等行為時表明造模成功[8]。將造模成功的大鼠分為模型組和SG低、中、高劑量組以及SG高劑量+Anisomycin組，每組10只。SG低、中、高劑量組大鼠分別于腹腔注射1.00、2.50、6.25 mg/kg SG[3]，SG高劑量+Anisomycin組大鼠在腹腔注射6.25 mg/kg SG的同時腹腔注射Anisomycin 5 mg/kg[9]，對照組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續7 d。

2.2 大鼠一般情況及神經功能變化觀察

末次給藥結束后，觀察各組大鼠一般情況，包括毛發、飲食、體重、運動情況等，并參考文獻[10]對其神經功能進行評分：0級（2分），正常；1級（4分），步態基本正常，足趾異常；2級（6分），左后肢無力，輕度跛行；3級（8分），左后肢無力，跛行明顯；4級（10分），站立不穩，左后肢活動；5級（12分），左后肢癱瘓，不能自主活動。

2.3 大鼠疼痛閾值檢測

機械性痛覺過敏測定：“2.2”項下實驗結束后通過Von Frey纖維絲測試大鼠右足機械痛閾。將大鼠固定于安靜環境，施加足夠的力將Von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后爪表面6～8 s，若出現爪子迅速縮回、舔爪子或嚎叫即為陽性反應，將該力記為機械刺激縮足反射閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。每次測試間隔時間大約2 min，重復3次，取平均值。

熱痛覺過敏測定：上述實驗結束后采用熱痛儀測試大鼠后爪足底的熱敏感性，若大鼠出現縮足情況即為陽性反應，將開始刺激到出現陽性反應的時間記為熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。熱刺激時間為10～15 s，上限為20 s，以防止組織損傷。每次測試間隔5 min，重復3次，取平均值。

2.4 樣本取材

痛覺實驗結束后，麻醉處死大鼠，心臟取血，離心取上清，保存于－20 ℃用于TNF-α、IL-1β、5-HT、NPY檢測。取血完成后，解剖大鼠，將椎旁肌與腰椎節段分離，切除椎間盤纖維環，暴露L4～L6節段髓核組織；收集DRG組織，一部分固定于4%多聚甲醛中，其余部分冷凍并保存在－80 °C。

2.5 大鼠DRG組織的病理學形態觀察

將DRG組織于4 °C條件下固定于4%多聚甲醛中48 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切成4 μm薄片；取部分切片（剩余部分用于免疫熒光實驗）進行HE染色后，置于顯微鏡下觀察DRG組織的病理變化。

“等等，把逃兵送師部，我到想聽聽他為什么要當逃兵，也想聽聽他是怎么躲過鬼子毒氣彈的。”趙錫田做了個停止的動作。

2.6 大鼠血清中炎癥因子和疼痛因子水平的檢測

采用ELISA法進行檢測。取－20 ℃保存的大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和疼痛因子5-HT、NPY的水平。

2.7 大鼠脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞活化情況的觀察

采用免疫熒光法進行觀察。取“2.5”項下剩余切片，以PBS洗滌后，透化30 min；以7%驢血清封閉1 h后，與一抗Iba-1（稀釋度為1∶500）、GFAP（稀釋度為1∶500）在4 °C孵育過夜；洗滌后與二抗（稀釋度為1∶400）在室溫下孵育45 min，以DAPI處理切片后，在熒光顯微鏡下觀察切片并采集圖像，采用Image Pro Plus軟件分析Iba-1、GFAP蛋白（鏡下均呈綠色熒光）的熒光強度。Iba-1蛋白熒光強度越高，表明脊髓小膠質細胞活化程度越高；GFAP蛋白熒光強度越高，表明星形膠質細胞活化程度越高。

2.8 大鼠DRG組織中MAPK/ERK/NF-κB信號通路相關蛋白和炎癥相關蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取各組大鼠DRG組織適量，經裂解液裂解后，取30 μg蛋白樣品進行變性處理，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜；以5%脫脂牛奶封閉，在4 °C條件下加入p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、GAPDH（稀釋度均為1∶1 000）一抗孵育過夜；洗膜后，在室溫下加入二抗（稀釋度為1∶2 000）孵育60 min。采用凝膠成像儀顯影，并使用ImagePro Plus軟件分析蛋白條帶灰度值，以p-p38 MAPK與p38 MAPK、p-ERK1/2與ERK1/2、p-NF-κB p65與NF-κB p65的灰度值比值表示p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，以TNF-α、IL-1β與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示兩者的表達水平。

2.9 統計學方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，數據采用±s表示。多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 SG對大鼠一般情況及神經功能的影響

對照組大鼠行為正常，毛發光滑，飲食與行為狀態良好；模型組大鼠精神萎靡，毛發雜亂，食欲不振，體重下降，后肢運動障礙；SG各劑量組大鼠精神、食欲好轉以及后肢運動障礙緩解，體重升高；SG高劑量+Anisomycin組大鼠的精神、運動狀況較SG高劑量組下降。對照組、模型組、SG低劑量組、SG中劑量組、SG高劑量組、SG高劑量+Anisomycin組大鼠神經功能評分分別為（2.01±0.24）、（9.03±1.08）、（5.93±0.62）、（4.75±0.49）、（2.84±0.31）、（6.55±0.68）分。與對照組相比，模型組大鼠神經功能評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SG各劑量組大鼠神經功能評分均顯著降低（P＜0.05）；與SG高劑量組相比，SG高劑量+Anisomycin組大鼠神經功能評分顯著升高（P＜0.05）。

3.2 SG對大鼠疼痛閾值的影響

與對照組相比，模型組大鼠PWMT、PWTL均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，SG低、中、高劑量組PWMT、PWTL均顯著升高（P＜0.05）；與SG高劑量組相比，SG高劑量+Anisomycin組PWMT、PWTL均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠疼痛閾值比較（±s，n＝10）

表1 各組大鼠疼痛閾值比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與SG高劑量組比較，P＜0.05。

PWTL/s 14.83±1.52 6.94±0.72a 8.25±0.88b 10.43±1.52b 12.47±1.35b 7.29±0.83c組別對照組模型組SG低劑量組SG中劑量組SG高劑量組SG高劑量+Anisomycin組PWMT/g 32.65±3.48 10.86±1.27a 18.04±2.15b 24.28±2.63b 29.07±3.15b 15.74±1.61c

3.3 SG對大鼠DRG組織病理變化的影響

對照組大鼠DRG椎間盤神經元細胞結構正常，細胞核完整。模型組大鼠DRG椎間盤神經元細胞排列紊亂，細胞腫脹，界限模糊，核仁染色不均。與模型組比較，SG各劑量組大鼠DRG椎間盤神經元細胞結構改善，細胞腫脹減輕，界限清晰，核仁染色均勻。與SG高劑量組比較，SG高劑量+Anisomycin組大鼠DRG椎間盤神經元細胞結構紊亂。結果見圖1。

圖1 各組大鼠DRG組織病理變化情況（HE染色）

3.4 SG對大鼠血清中炎癥因子和疼痛因子水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平均顯著升高，5-HT水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，SG各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平均顯著降低，5-HT水平均顯著升高（P＜0.05）；與SG高劑量組相比，SG高劑量+Anisomycin組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平均顯著升高，5-HT水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠炎性因子和疼痛因子水平比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠炎性因子和疼痛因子水平比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與SG高劑量組比較，P＜0.05。

NPY/（ng/L）108.36±11.42 186.25±19.38a 168.33±17.46b 142.29±15.71b 119.08±12.84b 171.46±18.63c組別對照組模型組SG低劑量組SG中劑量組SG高劑量組SG高劑量+Anisomycin組TNF-α/（pg/mL）57.23±6.07 182.47±19.36a 131.57±13.27b 98.64±10.57b 69.48±7.39b 142.38±15.83c IL-1β/（pg/mL）32.54±3.48 91.05±9.32a 72.88±7.46b 54.27±5.58b 39.41±4.06b 85.73±8.72c 5-HT/（ng/L）7.09±0.84 4.29±0.46a 4.98±0.52b 5.73±0.59b 6.59±0.57b 4.71±0.48c

3.5 SG對大鼠脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞活化的影響

與對照組相比，模型組大鼠脊髓小膠質細胞中Iba-1、星形膠質細胞中GFAP的陽性表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SG各劑量組大鼠Iba-1、GFAP的陽性表達均顯著降低（P＜0.05）；與SG高劑量組相比，SG高劑量+Anisomycin組大鼠Iba-1、GFAP的陽性表達均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2（SG低劑量組圖略）、表3。

圖2 各組大鼠Iba-1、GFAP蛋白熒光染色結果

表3 各組大鼠DRG組織中Iba-1、GFAP蛋白熒光強度比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠DRG組織中Iba-1、GFAP蛋白熒光強度比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與SG高劑量組比較，P＜0.05。

GFAP熒光強度1.08±0.12 4.37±0.46a 3.37±0.39b 2.43±0.29b 1.56±0.21b 3.85±0.39c組別對照組模型組SG低劑量組SG中劑量組SG高劑量組SG高劑量+Anisomycin組Iba-1熒光強度1.00±0.10 3.72±0.38a 2.97±0.32b 2.25±0.27b 1.58±0.17b 3.08±0.32c

3.6 SG對大鼠DRG組織中MAPK/ERK/NF-κB信號通路相關蛋白及炎癥相關蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠DRG組織中p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB p65蛋白磷酸化水平和TNF-α、IL-1β蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SG各劑量組大鼠DRG組織中上述指標水平均顯著降低（P＜0.05）；與SG高劑量組相比，SG高劑量+Anisomycin組大鼠DRG組織中上述指標水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3、表4。

圖3 各組大鼠DRG組織中相關蛋白表達的電泳圖

表4 各組大鼠DRG組織中相關蛋白表達比較（±s，n＝10）

表4 各組大鼠DRG組織中相關蛋白表達比較（±s，n＝10）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與SG高劑量組比較，P＜0.05。

p-p38 MAPK/p38 MAPK 0.42±0.05 0.93±0.10a 0.78±0.08b 0.60±0.07b 0.49±0.05b 0.81±0.09c p-ERK1/2/ERK1/2 0.31±0.03 0.96±0.10a 0.71±0.07b 0.58±0.06b 0.42±0.05b 0.81±0.09c p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.22±0.03 0.89±0.09a 0.69±0.07b 0.48±0.06b 0.31±0.04b 0.72±0.08c IL-1β 0.58±0.06 0.92±0.11a 0.80±0.08b 0.75±0.09b 0.61±0.09b 0.88±0.11c組別對照組模型組SG低劑量組SG中劑量組SG高劑量組SG高劑量+Anisomycin組TNF-α 0.38±0.06 1.07±0.10a 0.72±0.08b 0.64±0.05b 0.44±0.08b 0.82±0.10c

4 討論

LDH是一種常見的慢性疾病，是引起下腰痛和神經痛的主要原因。學者普遍認為機械壓迫神經根是慢性疼痛的主要原因，但近期有研究表明，髓核引起的促炎因子釋放是引起神經疼痛的重要病理機制[11]。LDH的治療選擇包括保守治療和手術，但僅有10%～20%的患者適合手術治療，因此，非手術治療仍是大多數LDH患者的最佳選擇[12]。目前，臨床治療LDH的藥物易引起不良反應，且效果不佳，因此尋找新的治療方法對改善LDH的炎性疼痛至關重要。

DRG作為感覺傳入的初級神經元，在疼痛的產生和傳遞中起重要作用。本研究通過自體髓核抑制構建LDH大鼠模型，發現模型大鼠出現后肢運動障礙、椎間盤變性以及DRG組織中神經元細胞損傷，PWMT、PWTL顯著降低，表明LDH模型構建成功，大鼠疼痛閾值降低，出現痛覺反應。小膠質細胞作為中樞神經系統的常駐巨噬細胞，在免疫反應中起著重要作用，活化的小膠質細胞可釋放TNF-α、IL-1β，從而加重疼痛[13]。小膠質細胞和星形膠質細胞分別在疼痛發展的早期和中期被激活，Iba-1、GFAP分別為小膠質細胞和星形膠質細胞的特異性細胞標志物[14]。5-HT、NPY為疼痛因子，其中5-HT存在于神經系統，具有鎮痛作用；抑制血清中NPY的表達，可減輕LDH患者的疼痛反應[15]。本研究發現，模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平和Iba-1、GFAP陽性表達均升高，5-HT水平降低，表明模型大鼠出現炎性疼痛反應。經SG干預后，大鼠一般情況及神經功能改善，血清中TNF-α、IL-1β、NPY水平和Iba-1、GFAP陽性表達均降低，PWMT、PWTL、5-HT水平均升高，表明SG可能通過抑制DRG組織中小膠質細胞活化，減少炎癥因子釋放，提高大鼠疼痛閾值，進而減輕LDH大鼠炎性疼痛。

神經損傷引起的異常疼痛取決于MAPK信號通路的激活，在小膠質細胞活化的早期階段，MAPK在促炎因子下啟動，激活其信號分子p38 MAPK、ERK等，其中ERK主要分布在星形膠質細胞和神經元中，p38 MAPK主要分布在小膠質細胞中[16]。NF-κB是MAPK的另一個下游轉錄因子，其發生磷酸化后，導致核轉位增加，進一步促進TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放[17]。因此，抑制小膠質細胞的活化和MAPK/ERK/NF-κB信號通路的激活可以緩解周圍神經損傷引起的痛覺過敏。本研究結果顯示，經SG干預后，大鼠DRG組織中p38 MAPK、ERK1/2、NF-κB p65蛋白磷酸化水平和TNF-α、IL-1β蛋白表達水平均降低，表明SG可能具有抑制MAPK/ERK/NF-κB信號通路的作用。為了進一步驗證SG是否通過抑制MAPK/ERK/NF-κB信號通路發揮作用，本研究在SG干預的基礎上同時加入MAPK激活劑Anisomycin，結果發現，SG對模型大鼠的改善作用受到抑制，提示SG可能通過抑制MAPK/ERK/NF-κB信號通路，改善模型大鼠炎性疼痛。

綜上所述，SG可通過抑制LDH大鼠DRG組織中小膠質細胞活化，減少炎癥因子釋放，提高疼痛閾值，從而改善炎性疼痛，其作用機制可能與抑制MAPK/ERK/NFκB信號通路有關。