TMZ@ZIF-8納米粒的制備、表征及體內(nèi)外抗腫瘤研究Δ

劉婷 ，王怡 ，李冰輝 ，何碩 ，夏江 ，朱婷 （.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 50076；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 大慶 69；.哈爾濱商業(yè)大學(xué)英才學(xué)院，哈爾濱 50028；4.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 50076）

腦膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)細胞瘤、膠質(zhì)瘤，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最難治愈的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的44.69%，其多呈浸潤性生長，手術(shù)不易全切，治療敏感性極差，5年生存率不足5%[1]。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是咪唑并四嗪類衍生物，在體內(nèi)經(jīng)快速非酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚曰衔?-（3-甲基三氮烯-1-）咪唑-4-酰胺[5-（3-methyltriazene-1-）imidazole-4-amide，MTIC]；MTIC主要作用于DNA鳥嘌呤的O6和N6位點，通過烷基化發(fā)揮細胞毒性作用[2]。TMZ是目前臨床治療腦膠質(zhì)瘤的一線化療藥物，具有針對性強、特異性高的優(yōu)點，療效顯著。然而，TMZ會產(chǎn)生惡心、嘔吐、溶血、過敏等不良反應(yīng)。因此，尋找合適的載體來負載TMZ，提高藥效、減少副作用成為當前研究的熱點。

腫瘤細胞內(nèi)糖酵解增強和缺氧特征所導(dǎo)致的乳酸、碳酸增多，是腫瘤部位微酸環(huán)境形成的原因之一；另外，腫瘤細胞內(nèi)的酸性細胞器，如溶酶體和內(nèi)涵體，具有更低的pH（pH5～6）[3]。因此，pH常作為內(nèi)源性刺激響應(yīng)信號用于腫瘤藥物控制釋放研究[3]。沸石咪唑骨架（zeolite imidazole framework，ZIF）是一種由鋅離子（Zn2+）和咪唑或其衍生物組成的金屬有機框架，是鋅基金屬有機骨架材料（Zn-metal-organic frameworks，Zn-MOFs）中應(yīng)用最廣泛的藥物載體。最具代表性的ZIF是ZIF-8，由Zn2+和2-甲基咪唑環(huán)上的N原子配位形成，其特點為高孔隙率、易改性、一定的熱和化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性、極大的生物相容性。ZIF-8對酸敏感，具有pH響應(yīng)釋放功能，因此其在藥物控制釋放方面有很好的表現(xiàn)。據(jù)研究報道，ZIF-8對pH敏感的原因是酸性條件可導(dǎo)致Zn+-咪唑離子配位鍵裂解，從而瓦解ZIF-8的骨架，釋放藥物；而在正常pH條件下（pH7.4），ZIF可以將藥物留置于孔隙內(nèi)，從而保護環(huán)境不受藥物毒副作用的影響[4]。

本研究采用ZIF-8納米粒（nanoparticles，NPs）負載TMZ（簡稱TMZ@ZIF-8 NPs）構(gòu)建藥物遞送系統(tǒng)，借助ZIF-8特有的穩(wěn)定多孔骨架結(jié)構(gòu)，高效包裹TMZ并轉(zhuǎn)移至病灶部位，以期提高TMZ對腦膠質(zhì)瘤的治療效果并降低TMZ的毒副作用。

1 材料

1.1 主要儀器

XS205DU型十萬分之一精密電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；pHS-2C型精密酸度計購自上海雷磁儀器廠；78-2型雙向磁力攪拌器購自常州國華電器有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；TG16W型微量高速離心機購自湖南湘儀離心機廠；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度儀購自英國Malvern公司；XW-80A型渦旋振蕩器、SCIENTZ-100FG/A型冷凍干燥機均購自寧波新芝生物科技股份有限公司；JEM-100CX Ⅱ型透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社；UV-1780型紫外可見分光光度計、SPD-20AV型高效液相色譜儀均購自島津儀器（蘇州）有限公司；8400S型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀購自北京銀河系醫(yī)療技術(shù)有限公司；HZQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱購自江蘇迅迪儀器科技有限公司；XFS-280A型高壓蒸汽滅菌鍋購自上海新豐醫(yī)療器械有限公司；Synergy HTX型多功能酶標儀購自上海三申醫(yī)療器械有限公司；DeltaVision型高分辨率活細胞成像系統(tǒng)購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；AE2000型倒置生物顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；ESCO型細胞培養(yǎng)箱購自深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備有限公司；SA-100型腦立體定位儀購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；IVIS Lumina LT Series Ⅲ型小動物活體成像系統(tǒng)購自美國Caliper Life Sciences公司。

1.2 主要藥品與試劑

TMZ（批號85622-9391，純度≥99.5%）購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；2-甲基咪唑（批號KL03，純度98%）購自上海旭碩生物科技有限公司；六水硝酸鋅（化學(xué)純）購自南京化學(xué)試劑股份有限公司；甲醇（色譜純）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號12100）購自北京索萊寶科技有限公司；青霉素-鏈霉素混合溶液（批號C0242）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（批號27250018）購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒（批號20221115）購自北京百瑞極生物科技有限公司；二甲亞砜（細胞培養(yǎng)級）購自德國Biofroxx公司；熒光染料羅丹明（rhodamine，Rho）（批號1710X221236）購自上海懋康生物科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自愛必信（上海）生物科技有限公司。

1.3 實驗動物和細胞

大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞株C6、人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2020-0011。本實驗通過哈爾濱商業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，倫理編號為HSDYXY-2023053。

2 方法

2.1 ZIF-8 NPs的制備及其工藝優(yōu)化

采用室溫溶液反應(yīng)法制備ZIF-8 NPs[5]。首先，將148.74 mg六水硝酸鋅溶解于5～20 mL無水甲醇至終濃度為0.025～0.10 mmol/mL。然后，將328.40 mg 2-甲基咪唑溶解于5～20 mL無水甲醇中至終濃度為0.20～0.80 mmol/mL。完全溶解后，將六水硝酸鋅溶液緩慢加入到2-甲基咪唑溶液中，六水硝酸鋅與2-甲基咪唑物質(zhì)的量比為1∶2、1∶4、1∶8。將溶液攪拌30～60 min并以10 000～14 000 r/min離心，收集沉淀物。沉淀物用無水甲醇和超純水洗滌3次以去除未反應(yīng)的試劑。最后，將產(chǎn)物分散到超純水中，得到ZIF-8 NPs。將其水分散溶液冷凍干燥獲得ZIF-8 NPs粉末。研究表明，ZIF-8 NPs的制備過程中影響粒徑的因素有：六水硝酸鋅濃度、2-甲基咪唑濃度、六水硝酸鋅與2-甲基咪唑物質(zhì)的量比、溶液混合時的加入方式、攪拌時間、離心速率[5]。本研究以上述6個影響因素為單因素考察內(nèi)容，以ZIF-8 NPs的粒徑為參考指標因素水平（表1）進行單因素試驗。接著根據(jù)前期預(yù)實驗及單因素考察結(jié)果，確定制備ZIF-8 NPs的溶劑為甲醇，溶液混合時以液下注入的方式加入，離心速率為12 000 r/min，利用正交試驗，構(gòu)建以ZIF-8 NPs粒徑大小為指標，以六水硝酸鋅濃度、2-甲基咪唑濃度、六水硝酸鋅與2-甲基咪唑物質(zhì)的量比和攪拌時間為因素的因素水平表與L9（34）設(shè)計表，用以篩選制備ZIF-8 NPs的最優(yōu)處方工藝。

2.2 TMZ@ZIF-8 NPs的制備

通過浸漬法完成TMZ的負載[6]。將未負載藥物的ZIF-8 NPs溶液加入到含有TMZ的甲醇溶液中，TMZ與ZIF-8 NPs物質(zhì)的量比為1∶3。混合后的溶液攪拌12 h，離心收集產(chǎn)物，用甲醇和超純水多次洗滌。最后，將產(chǎn)物分散到超純水中，經(jīng)冷凍干燥后，得到淺粉色粉末狀的TMZ@ZIF-8 NPs。

采用酸解法檢測TMZ@ZIF-8 NPs的載藥率（drugloading efficiency，LE）[7]。將TMZ@ZIF-8 NPs凍干粉2.0 mg與 0.1 mol/L的HCl溶液1 mL混合，超聲破壞5 min，然后用超純水清洗。采用紫外-可見分光光度法在329 nm波長處檢測從NPs中釋放的藥物濃度[8]，計算TMZ@ZIF-8 NPs中TMZ的LE（We/Wm×100%）。式中，We為包封于TMZ@ZIF-8 NPs內(nèi)的藥量，Wm為藥物遞送系統(tǒng)的總質(zhì)量。

2.3 體外溶出實驗

采用動態(tài)膜透析法研究TMZ@ZIF-8 NPs的釋放行為。由于TMZ在pH＞7的介質(zhì)中會迅速分解，故在模擬人體正常生理環(huán)境的介質(zhì)中[磷酸鹽緩沖液（PBS），pH7.4]，TMZ很難被定量檢測，故采用pH5.0的PBS模擬腫瘤區(qū)域微環(huán)境。將1 mL TMZ@ZIF-8 NPs懸浮液轉(zhuǎn)移至透析袋中（分子量截至3 000 Da），放入含有10 mL PBS（pH5.0）的EP管中，并轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩器（37 ℃，110 r/min）模擬體內(nèi)條件的TMZ釋放。然后，在指定的時間點（1、2、4、8、12、24、36、48、72 h）取出1.0 mL釋放介質(zhì)，并將1.0 mL新鮮介質(zhì)加回釋放介質(zhì)中。參考“2.2”項下紫外-可見分光光度法檢測釋放出的藥物濃度，計算藥物累積溶出速率（cumulative dissolution rate，CDR），繪制累積釋放百分比曲線。CDR（%）＝[Cn·V2/L+（Cn－1+……+C2+C1）·V1/L）]×100%。式中，Cn為各時間點取出后的樣品濃度，L為制劑標示量，V1為各時間點固定取樣體積，V2為溶出介質(zhì)體積。

2.4 材料的表征

采用激光粒度儀分析TMZ@ZIF-8 NPs、ZIF-8 NPs的粒徑、Zeta電位和多分散系數(shù)。采用透射電鏡在80 kV分析TMZ@ZIF-8 NPs的結(jié)構(gòu)特征。采用FTIR儀檢測ZIF-8 NPs、TMZ、TMZ@ZIF-8 NPs的官能團。

2.5 體外抗腫瘤活性實驗

2.5.1 細胞培養(yǎng)

大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期，將C6細胞接種至細胞培養(yǎng)板上，輕輕搖動培養(yǎng)板，然后移至培養(yǎng)箱中。

2.5.2 細胞毒性檢測

采用CCK-8法檢測。取“2.5.1”項下對數(shù)生長期的C6細胞，按5×103個/孔接種于96孔板，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。去除培養(yǎng)液，將細胞分為對照組和不同濃度的處理組，對照組加入200 μL的DMEM高糖培養(yǎng)基，處理組分別加入含不同濃度（5、10、20、50、100、200、400、800 μg/mL）TMZ、ZIF-8 NPs、TMZ@ZIF-8 NPs的新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基，孵育24、48、72 h后，去除舊細胞培養(yǎng)液。每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中再孵育4 h后，在酶標儀上檢測450 nm波長處的吸光度，計算相對細胞存活率。相對細胞存活率（%）＝處理組吸光度/對照組吸光度×100%。

2.5.3 細胞攝取檢測

（1）使用Rho代替TMZ加載到ZIF-8 NPs遞送系統(tǒng)中形成Rho@ZIF-8 NPs。取“2.5.1”項下對數(shù)生長期的C6細胞，按1×105個/孔接種至玻璃底培養(yǎng)皿中，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。去除培養(yǎng)液，然后用Hoechst染料對細胞核進行染色，避光孵育5 min，用PBS洗滌2次。細胞膜用Dio染料染色，避光孵育10 min，用PBS洗滌2次。最后，分別加入游離Rho和Rho@ZIF-8 NP（Rho含量相同）。在0.5、2、4 h時，采用高分辨率活細胞成像系統(tǒng)獲得細胞熒光強度圖像。

（2）采用流式細胞術(shù)獲得游離Rho和Rho@ZIF-8 NPs的攝取量。取“2.5.1”項下對數(shù)生長期的C6細胞，以2×105個/孔接種至12孔板中，每孔體積1 mL，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。棄去舊的培養(yǎng)液，分別加入游離Rho和Rho@ZIF-8 NPs（Rho含量相同）。孵育不同時間（0.5、2、4 h）后，PBS洗滌2次，用胰酶進行消化，最后得到的單細胞懸液分別收集到不同的離心管中，以2 000 r/min離心3 min后，去除上清液，沉淀細胞團用PBS重懸并轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細胞儀測定其熒光強度，通過熒光強度定量對比觀察細胞攝取情況。

2.5.4 細胞凋亡檢測

采用流式細胞術(shù)檢測。取“2.5.1”項下對數(shù)生長期的C6細胞，按2×105個/孔接種至12孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。去除培養(yǎng)液，參考“2.5.2”項下CCK-8法分組情況及其檢測結(jié)果，分別加入含ZIF-8 NPs、TMZ、TMZ@ZIF-8 NPs 25 μg/mL的新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 h。移出舊培養(yǎng)基并合并，用PBS沖洗，胰蛋白酶消化后，將單細胞懸液分別收集到不同的離心管中以2 000 r/min離心3 min，去除上清液。將沉淀的細胞塊重懸于冷PBS中，以2 000 r/min離心3 min，棄上清液。將沉淀重懸于結(jié)合緩沖液后轉(zhuǎn)移至流式細胞管中。加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL，室溫避光孵育15 min。檢測前5 min加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料。采用流式細胞儀檢測1 h內(nèi)細胞凋亡情況，細胞凋亡率（%）＝凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2.6 體內(nèi)抗腫瘤活性實驗

2.6.1 大鼠U87細胞腦部造模

取密度為80%～90%的U87細胞，消化細胞后加入EP管中，以2 000 r/min離心3 min，去除上清液后加入PBS離心，去除上清液后二次加入PBS離心，去除上清液后加入微量PBS，混勻，得細胞懸液。取10 μL細胞懸液，以10 μL臺盼藍+80 μL培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)。取10 μL染色的細胞懸液滴入細胞計數(shù)板，進行細胞計數(shù)。

大鼠麻醉后將其固定在腦立體定位儀上，剪去頭顱上皮，劃掉緊挨頭顱的薄膜，橫平豎直固定進樣針，接著安裝微量進樣泵及進樣針，下針深度2.5 mm，靜置5 min，開始按壓微量注射泵，進U87細胞懸液20 min，再次靜置10 min。觀察大鼠大腦腫瘤位置、大小、顏色、生長情況等，待腫瘤體積生長至150～200 mm3時，視為造模成功[9]，可進行后續(xù)實驗。

2.6.2 大鼠體內(nèi)TMZ@ZIF-8 NPs富集的觀察

將造模成功的大鼠隨機分為3組，分別為TMZ組、ZIF-8 NPs組、TMZ@ZIF-8 NPs組，每組10只。參考文獻[10―12]的方法，在制備ZIF-8 NPs過程中，加入熒光染料1，1′-二十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚三碳花青碘（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindotricarbocyanine，DiR）甲醇溶液即得ZIF-8 NPs-DiR、TMZ@ZIF-8 NPs-DiR；取TMZ溶解在適量甲醇中，加入DiR（DiR母液揮干后加入等體積甲醇），攪拌24 h，以12 000 r/min離心15 min，揮干，分散在0.9%生理鹽水中即得TMZDiR。其中TMZ-DiR組、TMZ@ZIF-8 NPs-DiR組注射TMZ含量為2.5 mg/kg，注射24 h后，將大鼠處死，采用小動物活體成像系統(tǒng)觀察藥物在大鼠體內(nèi)的富集情況。所有實驗至少重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料滿足正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較使用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 ZIF-8 NPs和TMZ@ZIF-8 NPs的制備及工藝優(yōu)化結(jié)果

單因素和正交試驗確定的ZIF-8 NPs的制備條件：六水硝酸鋅濃度為0.05 mmol/mL，2-甲基咪唑濃度為0.40 mmol/mL，六水硝酸鋅與2-甲基咪唑物質(zhì)的量比為1∶8，溶液混合時的加入方式為液下注入，攪拌時間為45 min，離心速率為12 000 r/min。最終制備出形態(tài)規(guī)整、分散均勻、粒徑大小適宜（約110 nm）的ZIF-8 NPs作為藥物遞送系統(tǒng)。成功合成的ZIF-8 NPs溶液為白色并伴有藍色乳光；TMZ@ZIF-8 NPs溶液為粉紅色。ZIF-8 NPs和TMZ@ZIF-8 NPs分散在溶液中均呈現(xiàn)均勻澄清的穩(wěn)定狀態(tài)，無渾濁、無分層、無沉降；材料由白色變?yōu)榉奂t色，表明TMZ負載成功。結(jié)果見圖1。

圖1 ZIF-8 NPs、TMZ@ZIF-8 NPs外觀圖片

3.2 TMZ@ZIF-8 NPs的LE測定結(jié)果

采用酸解法測得TMZ@ZIF-8 NPs的LE為（28.79±1.26）%。

3.3 體外溶出實驗結(jié)果

動態(tài)膜透析法結(jié)果顯示，TMZ@ZIF-8 NPs于酸性介質(zhì)中，前12 h，附著在ZIF-8 NPs表面的TMZ快速釋放；12 h后，ZIF-8 NPs的納米結(jié)構(gòu)逐漸崩解、溶蝕，內(nèi)部包裹的TMZ得以緩慢釋放。當釋放48 h時，TMZ的CDR為（71.57±3.27）%；當釋放72 h時，CDR為（72.36±3.62）%。結(jié)果見圖2。

圖2 TMZ@ZIF-8 NPs中TMZ的累積釋放曲線圖（n＝3）

3.4 材料的表征結(jié)果

（1）激光粒度儀分析結(jié)果顯示，ZIF-8 NPs的粒徑為（110.47±3.60） nm，多分散系數(shù)為0.12±0.02，Zeta電位為（20.93±2.05） mV。TMZ@ZIF-8 NPs的粒徑為（126.23±7.92） nm，多分散系數(shù)為0.13±0.03，Zeta電位為（28.46±1.94） mV。與ZIF-8 NPs相比，由于TMZ@ZIF-8 NPs負載了TMZ，粒徑增加，同時由于TMZ帶正電，使得負載后TMZ@ZIF-8 NPs的電位有所升高。結(jié)果見圖3A、B。（2）透射電鏡分析結(jié)果顯示，TMZ@ZIF-8 NPs呈正多邊形，尺寸較為均一，分散均勻，棱角較ZIF-8 NPs圓滑，表面附著顆粒感，進一步表明ZIF-8 NPs對TMZ負載成功。結(jié)果見圖3C。（3）TMZ、ZIF-8 NPs、TMZ@ZIF-8 NPs的FTIR分析結(jié)果顯示，3 415 cm－1處吸收峰為TMZ中游離－NH2的特征吸收峰，3 195 cm－1處吸收峰為締合－NH2的特征吸收峰，2 933 cm－1處吸收峰為咪唑環(huán)中C－H的特征吸收峰，1 671 cm－1處吸收峰為TMZ中C＝O的伸縮振動吸收峰，1 145 cm－1和990 cm－1處吸收峰為C－N的伸縮振動吸收峰，420 cm－1處吸收峰為Zn－N的伸縮振動吸收峰。與ZIF-8 NPs相比，TMZ@ZIF-8 NPs的FTIR顯示，3 195 cm－1處吸收峰為締合－NH2特征吸收峰、1 671 cm－1處C＝O伸縮振動吸收峰、1 145 cm－1和990 cm－1處C－N伸縮振動吸收峰的振動強度增加，可以佐證TMZ成功負載于ZIF-8 NPs中。結(jié)果見圖3D。

圖3 3種材料的表征圖

3.5 體外抗腫瘤活性實驗結(jié)果

3.5.1 細胞毒性檢測結(jié)果

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，ZIF-8 NPs組的細胞活性值一直保持在90%以上，此結(jié)果表明空白ZIF-8 NPs對細胞無毒性，是生物相容性良好的納米藥物遞送載體。TMZ與TMZ@ZIF-8 NPs均有良好的抑制C6細胞增殖的作用。TMZ@ZIF-8 NPs對C6細胞的增殖抑制作用較TMZ更強。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度ZIF-8 NPs、TMZ、TMZ@ZIF-8 NPs的相對細胞存活率結(jié)果（±s，n＝3，%）

表2 不同濃度ZIF-8 NPs、TMZ、TMZ@ZIF-8 NPs的相對細胞存活率結(jié)果（±s，n＝3，%）

濃度/（μg/mL）0 10 25 50 100 150 250 500 ZIF-8 NPs 99.73±1.95 97.67±6.43 97.04±2.49 94.48±3.06 93.49±1.43 92.86±1.34 92.04±3.76 91.86±2.45 TMZ 99.84±3.46 98.13±2.76 96.16±7.65 93.46±6.49 89.16±5.19 86.65±6.18 80.43±6.18 69.46±5.18 TMZ@ZIF-8 NPs 100±8.07 97.53±3.29 94.21±2.62 90.79±4.31 87.98±2.28 85.30±7.41 78.46±8.08 56.59±8.98

3.5.2 細胞攝取分析結(jié)果

（1）高分辨率活細胞顯微成像結(jié)果顯示，游離Rho與Rho@ZIF-8 NPs分別與C6細胞孵育0.5、2、4 h后，熒光強度均增強；但同等孵育時間下，Rho@ZIF-8 NPs顯示的熒光強度更強。這說明C6細胞對ZIF-8 NPs具有較高的攝取能力，在負載TMZ的情況下，能夠?qū)⒏嗟腡MZ攝取進入細胞，提高TMZ的抗腫瘤效果。結(jié)果見圖4。

圖4 C6細胞與游離Rho、Rho@ZIF-8 NPs孵育不同時間的顯微圖（Dio染色，×200）

（2）流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，圖5A、B中熒光強度波峰向右移，表明隨著孵育時間的延長，C6細胞對游離Rho與Rho@ZIF-8 NPs的攝取均增強，與高分辨率活細胞顯微成像結(jié)果一致。從圖5C可知，ZIF-8 NPs具有高攝取的特點，并且隨著作用時間的延長，攝取能力增強更加明顯。

圖5 游離Rho與Rho@ZIF-8 NPs在C6細胞中不同時間的熒光強度（n＝3）

3.5.3 細胞凋亡檢測結(jié)果

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照細胞凋亡率為4.79%，其中早期凋亡占1.97%；經(jīng)過ZIF-8 NPs處理后的細胞凋亡率為4.31%，其中早期凋亡占1.72%；經(jīng)過TMZ處理的細胞凋亡率為6.57%，其中早期凋亡占2.27%；經(jīng)過TMZ@ZIF-8 NPs處理后的細胞凋亡率為21.00%，其中早期凋亡占10.36%。可以看出，經(jīng)過ZIF-8 NPs處理后的細胞凋亡情況與對照組無較大差別，表明ZIF-8 NPs具有生物安全性。經(jīng)過TMZ@ZIF-8 NPs處理后細胞凋亡明顯增加。早期凋亡比例顯示，TMZ@ZIF-8 NPs較TMZ的致凋亡作用更顯著，ZIF-8 NPs負載TMZ后，TMZ@ZIF-8 NPs由于能夠通過內(nèi)吞作用進入C6細胞，隨后釋放TMZ，二者作用機制可能不同。結(jié)果見圖6。

圖6 C6細胞凋亡情況流式細胞分析結(jié)果

3.6 體內(nèi)抗腫瘤活性實驗結(jié)果

小動物活體成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，單獨的ZIF-8 NPs在大鼠腦部不富集，TMZ在腦部富集效果并不顯著，而TMZ@ZIF-8 NPs腦部富集效果顯著。觀察大鼠其他主要臟器熒光成像可以看出，TMZ在各主要臟器中富集濃度較大，而TMZ@ZIF-8 NPs在各臟器中富集并不顯著。結(jié)果見圖7。

圖7 大鼠腦部和其他主要臟器活體成像

4 討論

ZIF-8 NPs為近年來藥物（尤其是腫瘤藥物）載體的研究熱點。ZIF-8 NPs的合成方法可采用純水體系合成、有機體系合成甚至無溶劑合成[13―15]。本研究中，ZIF-8 NPs的合成溶劑采用的是無水甲醇。盡管這在溶劑殘留和環(huán)境保護方面存在風險，但是ZIF-8 NPs在有機溶劑體系中更容易形成，且載體的尺寸也更易于調(diào)控，在制備過程中也將甲醇完全揮發(fā)。雖然有研究報道了一種在水溶液中合成的ZIF材料的案例，較非水系統(tǒng)，這種方式的合成周期更短，所獲得的ZIF-8 NPs晶體尺寸為85 nm，并表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性[13]。但是，本課題組在純水體系中合成ZIF-8 NPs時，發(fā)現(xiàn)其合成路徑較為繁瑣，制得的載體也不符合藥物傳輸?shù)男阅芤蟆?/p>

根據(jù)文獻記載，TMZ@ZIF-8 NPs可采用“一鍋攪拌法”或“分步合成法”。“一鍋攪拌法”是在形成ZIF-8 NPs的同時將藥物包裹其中，這種方法操作簡單、方便、快速，更適用于包封大于ZIF-8 NPs孔徑的藥物[16]。但是課題組在實驗中發(fā)現(xiàn)，該方法存在不可避免的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、尺寸大小不可控等問題。所以本研究最終采用質(zhì)量更可控的“分步合成法”作為合成方法[17]。

在TMZ@ZIF-8 NPs載藥量的測量方法上，有文獻報道采用投入TMZ含量去掉離心上清液中TMZ的方法計算載藥量，但該方法無論是在轉(zhuǎn)移、離心等制備過程中，還是冷凍干燥粉末回收的損失中，均存在大量誤差[18]。因此，本實驗選用酸解破壞ZIF-8 NPs的方式釋放TMZ，檢測TMZ含量并計算LE[19]。本研究中TMZ@ZIF-8 NPs的LE并不算高，這可能與有機金屬框架的空間占位和載體孔徑與藥物的匹配度有關(guān)，其他藥物也表現(xiàn)出相似的LE情況，如合成的NZIF-8 NPs對慶大霉素的LE為19%[5]，布洛芬的LE為30%[20]等。

在評價TMZ@ZIF-8 NPs的體外累積釋放行為時，盡管因為TMZ在pH＞7時分解，無法模擬TMZ@ZIF-8 NPs在生理條件下的釋放行為。但有研究表明，ZIF-NPs在酸性條件下能夠以高度可控的方式釋放藥物，這是由于酸性環(huán)境會減弱骨架對藥物的限制，所以藥物釋放速度會隨著pH的降低而增加[21]。另有報道稱，負載在ZIF-8外殼上的藥物在腫瘤的酸性環(huán)境中被分解，引起藥物的爆發(fā)性釋放效應(yīng)；然后處于ZIF-8核心的藥物連續(xù)釋放，表現(xiàn)出序貫給藥的特征[22]。本研究的釋放行為符合這種特征，實驗結(jié)果的相對標準偏差均在5.00%內(nèi)，故該研究顯示了良好的重復(fù)性，清楚地表明在體外條件下TMZ@ZIF-8 NPs中TMZ的釋放行為。

單獨服用TMZ后，可能會出現(xiàn)皮膚不良反應(yīng)、骨髓毒性及生殖毒性[23]，通過ZIF-8 NPs搭載TMZ，利用ZIF-8 NPs對pH敏感，在腫瘤微酸環(huán)境中ZIF-8 NPs骨架瓦解，釋放TMZ，而在正常組織中ZIF-8 NPs置留藥物，以此提高TMZ的靶向功能，增加其在病灶的富集率，提高其有效利用率，減少對其他臟器的毒性。盡管TMZ@ZIF-8 NPs沒有獲得一個高載藥的效果，但是從細胞攝取實驗可看出TMZ@ZIF-8 NPs通過其他方式進行了藥效補償和提高，即游離的TMZ是通過被動擴散進入細胞中的，而ZIF-8 NPs可通過吞噬作用使更多的藥物進入靶細胞內(nèi)[24]。進入途徑推測為C6細胞的胞飲作用，這與文獻記載一致[25]。TMZ@ZIF-8 NPs屬于極性分子，不能通過細胞膜擴散進入細胞，而是通過細胞吞噬途徑進入細胞[26]。吞噬又分為胞吞作用和胞飲作用。與胞吞作用相比，胞飲作用更為普遍，更傾向于攝取小尺寸物質(zhì)，如100 nm及以下的納米載體[27]。TMZ@ZIF-8 NPs通過C6細胞的胞飲作用被攝取進入細胞后，與溶酶體融合，在酸性條件下分解，從而釋放藥物。相對地，在生理條件下ZIF-8 NPs作為屏蔽層使藥物免受機體分解，因此還可以彌補TMZ半衰期短的自身缺陷。

據(jù)報道，有研究員將抗癌藥物D-α-生育酚琥珀酸酯（D-α-tocopherol succinate，α-TOS）裝載入ZIF-8，然后將透明質(zhì)酸（hyaluronic acid ，HA）與ZIF-8耦合，得到HA/α-TOS@ZIF-8藥物遞送系統(tǒng)，HA/α-TOS@ZIF-8被癌細胞吞噬，在腫瘤微環(huán)境中的HA可以分解其外層，然后暴露的α-TOS@ZIF-8會在酸性條件下迅速降解，釋放出藥物α-TOS用于治療腫瘤[28]。因此，將TMZ負載于ZIF-8 NPs上形成TMZ@ZIF-8 NPs，有望成為一種有效的抗癌劑。

綜上所述，ZIF-8 NPs可有效負載TMZ，制備成功的TMZ@ZIF-8可提高TMZ攝取能力及抗腦膠質(zhì)瘤效果。