葫蘆素B預防小鼠膿毒癥急性肺損傷的作用及機制Δ

陳壽珊，李方芳，劉福艷，付超，湯正珍 （遵義市第一人民醫院兒童重癥醫學科，貴州 遵義 563000）

膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應綜合征，因炎癥細胞過度分泌炎癥介質和細胞因子，導致免疫功能障礙和組織器官功能受損[1]。肺組織是膿毒癥患者最先損傷的靶器官之一，因此膿毒癥通常會導致急性肺損傷（acute lung injury，ALI），以下簡稱為膿毒癥ALI[2―3]。膿毒癥ALI是一種失控的炎癥反應，可導致大量炎癥細胞浸潤肺組織；一方面，其可啟動腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）級聯反應，在肺部聚集大量中性粒細胞，促進其他炎癥因子釋放，引起肺損傷；另一方面，中性粒細胞釋放彈性蛋白酶，促使大量中性粒細胞進入肺組織，引起肺水腫、蛋白質滲漏，加重肺損傷[4]。目前治療膿毒癥ALI的關鍵是快速有效地控制或減少肺的過度炎癥反應[5]。糖皮質激素是治療膿毒癥ALI的常用藥物，雖然治療效果明顯，但也具有嚴重副作用。

葫蘆素B（cucurbitacin B，CB）是從葫蘆科等植物中分離得到的一種四環三萜類化合物，具有改善中樞神經系統疾病、抗腫瘤、預防糖尿病、抗炎、抗氧化等藥理作用[6]。相關研究報道，CB對脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應具有明顯的抑制作用[7]。因此，筆者推測CB對膿毒癥ALI可能也具有抑制作用。基于此，本研究建立膿毒癥ALI動物模型，探討CB對膿毒癥ALI的預防作用及機制，以期為膿毒癥ALI的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑

CB對照品（批號2022-0442，純度＞98%）購自維琪生物科技（上海）有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；脂多糖（批號#202307）購自美國Sigma公司；鼠源白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-6受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、信號轉導及轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、GAPDH一抗和辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠免疫球蛋白G二抗（批號分別為#3771、#3230、#9145、#9133、#3629、#3917、#5174、#58802）均購自美國CST公司；地塞米松對照品（批號D829854，純度99%）購自上海麥克林生化科技有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為E-ELN-M0044c、E-ELN-M0037c、E-ELN-M0049c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的檢測試劑盒（批號分別為A001-1、A003-1、A044-1-1）均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 主要儀器

本研究所用主要儀器有BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、D3024型臺式高速微量離心機（美國Scilogex公司）、RT-6000型酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）、GZX-9070 MBE型數顯鼓風干燥箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、Tanon 5200型曝光儀（上海天能科技有限公司）、DYC型系列電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、RES3050型動物呼吸機（河北賽維醫療科技有限公司）。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為C57BL6小鼠，雄性（排除雌性小鼠的雌激素抗炎作用），6周齡，體重16～18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號為SCXK（滬）2022-009。所有動物實驗均按照遵義醫科大學動物中心研究委員會指南操作，倫理批號為（2021）-2-24。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將小鼠分為對照組、模型組、地塞米松組（陽性對照，2 mg/kg，劑量參考文獻[8]設置）和CB低、高劑量組（25、50 mg/kg，劑量參考文獻[9]設置），每組20只。各藥物組小鼠腹腔注射相應藥物，對照組與模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續3 d。末次給藥24 h后，除對照組小鼠外，其余各組小鼠參照文獻[10]方法，采用腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）的方法構建膿毒癥ALI模型，當造模小鼠相比對照組小鼠中性粒細胞數顯著升高同時肺功能顯著降低時，表明造模成功。造模結束后，對照組小鼠無死亡，地塞米松組死亡6只，模型組和CB低劑量組均死亡12只，CB高劑量組死亡9只，最終每組選取8只小鼠進行后續實驗。

2.2 小鼠肺功能檢測

腹腔注射脂多糖24 h后，采用RES3050型動物呼吸機及AniKes2005軟件共同測量小鼠肺總阻力、肺出氣阻力、肺動態順應性、呼吸峰值流速和最大通氣量。

2.3 小鼠血常規指標檢測

肺功能檢測后，以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，摘除眼球采血，迅速吸取45 μL全血，與5 μL抗凝劑充分混勻（剩余全血靜置離心后取上層血清備用），采用血常規檢測儀檢測小鼠全血中白細胞總數、中性粒細胞數、淋巴細胞數。

2.4 小鼠肺組織干濕比測定

采血結束后，在冰上摘除小鼠右肺（左肺同時取出備用），分離氣管和食管，獲取右肺葉，并立即測定小鼠肺組織濕重（記為d）。隨后，將肺組織在60 ℃下干燥72 h以去除所有水分，測定肺組織干重（記為w），并計算肺組織干濕比（w/d×100%）。

2.5 小鼠肺組織病理學形態觀察

取“2.4”項下小鼠左肺部分組織固定于4%甲醛溶液中72 h，經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切成4 μm厚的組織切片，取部分切片（剩余部分用于免疫組化實驗）進行HE染色。采用顯微鏡觀察小鼠肺組織病理變化，并拍照。

2.6 小鼠血清中炎癥因子、氧化應激指標水平以及肺組織中MPO水平檢測

采用ELISA法檢測。取“2.3”“2.4”項下小鼠適量血清樣品或左肺組織，根據試劑盒說明書方法，檢測小鼠血清中炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）、氧化應激指標（SOD和MDA）水平以及肺組織中MPO水平。

2.7 小鼠肺組織中p-STAT3陽性表達檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.5”項下小鼠肺組織切片在60 ℃下烘烤1 h，以二甲苯去除石蠟，經梯度乙醇脫水、抗原修復后，以3%牛血清白蛋白封閉，加入p-STAT3一抗（稀釋度為1∶500）孵育過夜；加入相應二抗孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每次3 min；以蘇木精染色，經梯度乙醇和二甲苯脫水后，以中性樹脂密封。采用光學顯微鏡觀察肺組織中p-STAT3蛋白表達情況，每只切片隨機選取1個視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image J軟件測定每個視野中的光密度值，光密度值越大，蛋白陽性表達水平越高。

2.8 小鼠肺組織中IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達水平檢測

采用Western blot法檢測。取各組小鼠肺組織適量，裂解后提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。將蛋白進行變性處理，然后取適量蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將其轉移至PVDF膜上。采用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000），孵育過夜；以TBST洗膜，然后加入相應二抗（稀釋度為1∶500），孵育30 min；以TBST洗膜，采用增強化學發光試劑顯影。采用凝膠成像儀分析蛋白條帶灰度值，以IL-6、IL-6R與內參（GAPDH）的灰度值比值表示其表達水平，以p-JAK2與JAK2、p-STAT3與STAT3的灰度值比值表示JAK2、STAT3的磷酸化水平。

2.9 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據表示為±s。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 CB對膿毒癥ALI小鼠肺功能的影響

與對照組比較，模型組小鼠肺總阻力、肺出氣阻力均顯著升高（P＜0.01），肺動態順應性、呼吸峰值流速、最大通氣量均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組和CB各劑量組小鼠上述指標均顯著逆轉（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠肺功能比較（±s，n＝8）

表1 各組小鼠肺功能比較（±s，n＝8）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組地塞米松組CB低劑量組CB高劑量組最大通氣量/（L/min）107.43±3.56 97.56±3.27a 104.35±3.29 b 103.82±2.67b 106.56±3.13b肺總阻力/（kPa/L）51.34±2.78 97.45±2.66a 57.77±2.56b 62.41±2.27b 54.67±2.39b肺出氣阻力/（kPa/L）58.65±4.32 98.63±4.21a 65.32±3.27 b 73.89±3.98b 68.65±3.29b肺動態順應性/（L/kPa）18.43±0.78 9.43±0.69a 13.69±0.65 b 12.12±0.63b 12.46±0.62b呼吸峰值流速/（mL/s）109.76±4.32 99.27±4.26a 105.42±4.21 b 102.67±4.81b 108.48±4.21b

3.2 CB對膿毒癥ALI小鼠血常規指標和肺組織干濕比的影響

與對照組比較，模型組小鼠全血中白細胞總數、中性粒細胞數、淋巴細胞數、肺組織干濕比均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組和CB各劑量組小鼠上述指標均顯著逆轉（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組小鼠血常規指標和肺組織干濕比比較（±s，n＝8）

表2 各組小鼠血常規指標和肺組織干濕比比較（±s，n＝8）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

對照組模型組地塞米松組CB低劑量組CB高劑量組3.27±1.24 7.89±1.04a 4.56±1.12b 5.47±1.22b 4.78±1.09b 2.21±0.83 5.49±0.86a 3.45±0.94b 4.08±0.75b 3.76±0.64b 1.04±0.05 1.87±0.04a 1.28±0.06b 1.49±0.04b 1.41±0.04b 1.54±0.48 5.67±0.87 a 3.29±0.76 b 3.94±0.68 b 4.15±0.62 b

3.3 CB對膿毒癥ALI小鼠肺組織病理學形態的影響

對照組小鼠肺組織形態規則，肺泡結構清晰完整。模型組小鼠肺組織出現肺泡塌陷、肺泡壁和肺泡間隔增厚以及炎癥細胞浸潤。與模型組比較，地塞米松組和CB各劑量組小鼠肺組織病理損傷減輕。結果見圖1。

圖1 CB對膿毒癥ALI小鼠肺組織病理學形態影響的顯微圖（HE染色）

3.4 CB對膿毒癥ALI小鼠血清中炎癥因子、氧化應激指標水平以及肺組織中MPO水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA水平和肺組織中MPO水平均顯著升高（P＜0.01），血清中SOD水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，地塞米松組和CB各劑量組小鼠上述指標水平均顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組小鼠血清中炎癥因子、氧化應激指標水平以及肺組織中MPO水平的比較（±s，n＝8）

表3 各組小鼠血清中炎癥因子、氧化應激指標水平以及肺組織中MPO水平的比較（±s，n＝8）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與對照組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組地塞米松組CB低劑量組CB高劑量組肺組織中MPO/（U/mL）4.79±0.72 14.38±2.15a 8.68±0.89c 9.78±0.95c 8.23±0.74c血清中指標IL-1β/（pg/mL）28.45±3.85 58.52±3.67a 34.67±3.32c 42.64±3.77c 40.37±3.09c SOD/（U/mL）20.45±2.45 12.43±4.78b 16.43±3.29d 19.21±3.11c 18.14±2.84c MDA/（nmol/L）28.31±4.12 67.37±8.53a 37.54±4.18c 30.21±4.38c 42.26±3.77c TNF-α/（pg/mL）132.65±24.54 452.41±67.43a 268.31±34.52c 326.34±38.56c 278.42±42.56c IL-6/（pg/mL）47.56±7.82 179.34±17.32a 76.67±8.52 c 113.58±8.16 c 82.69±7.31c

3.5 CB對膿毒癥ALI小鼠肺組織中p-STAT3蛋白陽性表達的影響

與對照組（光密度值為0.368±0.032）比較，模型組小鼠肺組織中p-STAT3蛋白陽性表達水平（光密度值為0.853±0.041）顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組和CB低、高劑量組小鼠肺組織中p-STAT3蛋白陽性表達水平（光密度值分別為0.431±0.027、0.585±0.024、0.513±0.022）均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中p-STAT3蛋白陽性表達的顯微圖

3.6 CB對膿毒癥ALI小鼠肺組織中IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組小鼠肺組織中IL-6和IL-6R蛋白表達水平和JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組和CB各劑量組小鼠肺組織中上述指標水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖3、表4。

圖3 各組小鼠肺組織中IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達的電泳圖

表4 各組小鼠肺組織中IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達水平比較（±s，n＝8）

表4 各組小鼠肺組織中IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達水平比較（±s，n＝8）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別對照組模型組地塞米松組CB低劑量組CB高劑量組p-STAT3/ STAT3 0.24±0.05 0.71±0.06a 0.44±0.06b 0.49±0.05b 0.46±0.04b IL-6/GAPDH 0.21±0.07 0.78±0.08a 0.42±0.06b 0.57±0.05b 0.46±0.06b IL-6R/GAPDH 0.42±0.09 0.86±0.09a 0.57±0.06b 0.53±0.08b 0.48±0.07b p-JAK2/JAK2 0.21±0.04 0.76±0.07a 0.36±0.05b 0.46±0.05b 0.42±0.04b

4 討論

相關研究發現，氧化應激失衡可引發機體炎癥或細胞死亡，與膿毒癥ALI的發病機制密切相關[11]。MPO是骨髓細胞的特異性標志物，主要存在于中性粒細胞中，可催化氯離子生成次氯酸和具有氧化能力的自由基，從而啟動脂質過氧化，導致機體氧化應激失衡[12]。本研究結果發現，CB可降低膿毒癥ALI模型小鼠血清中MDA水平和肺組織中MPO水平，升高SOD水平，這提示CB可能通過調節氧化應激預防小鼠膿毒癥ALI。

炎癥細胞因子如IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α在膿毒癥的發病機制中起著關鍵作用[13]。IL-1β可由巨噬細胞、單核細胞和成纖維細胞分泌合成，是重要的炎癥介質，有研究發現，膿毒癥模型動物體內IL-1β水平顯著升高[14]。IL-6是另一種重要的炎癥細胞因子，且IL-6 mRNA在膿毒癥患者肺組織中顯著升高[15]。TNF-α是一種由單核細胞和巨噬細胞分泌的促炎細胞因子，在脂質代謝、胰島素抵抗中具有重要作用[16]。本研究結果發現，CB可降低膿毒癥ALI模型小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平，這表明CB可能通過抑制炎癥因子水平預防小鼠膿毒癥ALI。

炎癥風暴是膿毒癥ALI發生的主要病機之一，其中IL-6是參與炎癥風暴最活躍的細胞因子。研究表明，IL-6與IL-6R結合產生的IL-6/IL-6R復合物與信號轉導成分gp130結合，誘導gp130的同源二聚體激活酪氨酸激酶家族和STAT家族，從而誘導炎癥反應[17]。本研究結果發現，CB可降低膿毒癥ALI模型小鼠肺組織中IL-6、IL-6R蛋白表達水平以及JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，且免疫組化實驗結果也顯示，CB可降低模型小鼠肺組織中p-STAT3蛋白陽性表達，這表明CB可能通過抑制肺組織中IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達，預防小鼠膿毒癥ALI。

綜上所述，CB可預防小鼠膿毒癥ALI，其作用機制可能與抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路活性、減輕炎癥反應有關。