補骨脂素對人牙周膜干細胞增殖、成骨分化的促進作用及其機制

韓敏，張韶君，席迅

山東第一醫科大學第一附屬醫院（山東省千佛山醫院）口腔科，濟南 250014

牙周炎是一種逐漸破壞牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，嚴重的牙周炎會導致牙槽骨吸收和牙齒松動脫落，并對患者的口腔功能和生活質量造成不良影響［1］。牙周炎與諸多全身性疾病有著非常密切的關系，例如不良妊娠、心血管疾病、2 型糖尿病等［2］。因此，治療牙周炎對于改善患者的生活質量至關重要。目前，牙周炎治療的熱點方向是牙周組織再生，而間充質干細胞是牙周組織再生的重點研究內容［3］。人牙周膜干細胞（hPDLSCs）是具有多向分化潛能的間充質干細胞，具有強大的自我更新潛力，被認為是牙周炎再生治療的一個非常有前途的干細胞群體［4］。有研究［5-7］證實，小檗堿通過MAPK/ERK 信號通路促進hPDLSCs 成骨分化，山奈酚通過Wnt/β-catenin 信號通路促進hPDLSCs 增殖和成骨分化，川續斷通過血管內皮生長因子/PI3K/Akt 信號通路促進hPDLSCs 成骨分化。目前，關于補骨脂素對hPDLSCs 增殖和成骨分化影響的研究較少。補骨脂素屬于呋喃香豆素類，自然存在于各種植物中［8］。現代藥理研究表明，補骨脂素具有抗炎、抗癌、抗菌和雌激素活性等作用，具有廣泛的生物醫學應用前景［9-13］。有文獻［14］報道，補骨脂素通過激活TGF-TGF/Smad3 通路，加速人骨髓間充質干細胞的成骨分化。過高濃度的補骨脂素并不利于細胞發揮正常生理功能［15］。目前，對補骨脂素作用的研究主要集中于成品細胞系和動物體內實驗［16-18］，對于其在hPDLSCs 成骨分化方面的研究報道較少。hPDLSCs 成骨分化過程需要諸多信號因子參與調節，其中骨特異性轉錄因子2（Runx2）是成骨向分化所必需的特異性轉錄調節因子。Runx2 能上調骨髓間充質干細胞、軟骨細胞、成骨細胞的胞外基質合成，加速細胞增殖分化，促進合成代謝及成骨反應，對于觀察hPDLSCs 成骨分化具有重要意義［19］。2023年3—9月，我們觀察了補骨脂素對hPDLSCs增殖、成骨分化的促進作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清（派克，上海中國），α-MEM培養基（元培，上海中國），胰酶消化液（元培，上海中國），青霉素鏈霉素（元培，上海中國）、磷酸鹽緩沖液（元培，中國）、維生素C（索萊寶，中國）、地塞米松（索萊寶，中國）、β-甘油磷酸二鈉鹽（索萊寶，中國）、茜素紅（索萊寶，中國）、補骨脂素（MCE，美國）、氯化合物（Sigma，美國）、PE 抗人CD34 抗體（BioLegend，英國）、APC 抗人CD90 抗體（BioLegend，英國）、增強型細胞計數試劑盒（Elabscience，武漢中國）、ALP 比色法試劑盒（Elabscience，中國）、總RNA 提取試劑盒（天根，中國）。

1.2 hPDLSCs 培養與鑒定 本研究經山東第一醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（No 2022-S264），取材自山東第一醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科門診拔除的健康成人的第三磨牙，拔牙后2 h內從牙根中間三分之一刮取牙周膜組織，并分離為1.0 mm×1.0 mm 的組織塊，平鋪在培養瓶的底部，每3天更換一次含20%胎牛血清的培養基，第7 天時鏡下可見組織周圍有細胞爬出。以1∶2 的比例傳代培養后，細胞形態均勻，呈纖細紡錘形。通過流式細胞儀檢測第三代細胞的表面標記物，造血干細胞標記物CD34 呈陰性，間充質干細胞特異性標記物CD90 呈強陽性。取第三代hPDLSCs 用于后續實驗。

1.3 hPDLSCs 增殖能力檢測 取第三代hPDLSCs，分為6 組，接種在96 孔板中，每組3 個復孔，每孔加入細胞懸液100 μL。5、10、25、50、100 μmol/L 補骨脂素組分別加入含最終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L 補骨脂素的培養液培養，對照組細胞正常培養。48 h后，棄原培養液，每孔加入細胞計數試劑（CCK-8）溶液100 μL，再培養4 h，采用酶標儀檢測450 nm波長處OD值。

1.4 hPDLSCs成骨分化能力檢測

1.4.1 ALP 活性 采用比色法檢測。取第三代hPDLSCs，并分為6 組，接種在96 孔板中，每組3 個復孔，每孔加入細胞懸液100 μL。5、10、25、50、100 μmol/L 補骨脂素組分別加入含最終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L 補骨脂素的成骨誘導液進行培養，對照組以正常成骨液誘導培養，成骨誘導液每3 天更換1 次。培養7 d，用塑料細胞刮板從平板上刮下細胞，在冰水浴中超聲處理后，提取上清液，使用比色法檢測上清液中ALP 的活性，采用酶標儀檢測520 nm波長處OD值。

1.4.2 成骨礦化結節 采用茜素紅染色檢測。取第三代hPDLSCs，并分為6組，每組3個復孔，接種在96 孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL。5、10、25、50、100 μmol/L 補骨脂素組分別加入含最終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L 補骨脂素的成骨誘導液進行培養，對照組以正常成骨液誘導培養，成骨誘導液每3天更換1次。培養21 d，用茜素紅染色檢測成骨礦化結節，并用10%氯化十六烷基吡啶進行定量，采用酶標儀檢測562 nm波長處OD值。

1.5 hPDLSCs Runx2、骨橋蛋白（OPN）mRNA 檢測 將第三代hPDLSCs 接種到6 孔板中，并分為兩組，對照組在成骨誘導液中正常培養；25 μmol/L 補骨脂素組在含25 μmol/L 補骨脂素的成骨誘導液中培養。成骨誘導液每3 天更換1 次，培養14 d，按照RNA 提取試劑盒的說明提取總RNA，使用FastKing RT 試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。采用實時定量PCR 檢測Runx2 和OPN mRNA，以β-actin 作為內參基因，引物由生工生物工程（上海）有限公司設計和合成。

1.6 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較若方差齊采用LSD 法檢驗，若方差不齊采用Tamhane 法檢驗，兩兩比較采用配對樣本T檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖、成骨分化能力比較 細胞增殖、成骨分化能力比較見表1。

表1 各組細胞增殖、成骨分化能力比較（）

表1 各組細胞增殖、成骨分化能力比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與5 μmol/L 補骨脂素組比較，bP＜0.05；與10 μmol/L 補骨脂素組比較，cP＜0.05；與25 μmol/L 補骨脂素組比較，dP＜0.05。

細胞成骨礦化結節（OD值）1.20 ± 0.17 1.70 ± 0.36 3.02 ± 0.12ab 1.47 ± 0.39 1.69 ± 0.38 0.84 ± 0.03組別5 μmol/L補骨脂素組10 μmol/L補骨脂素組25 μmol/L補骨脂素組50 μmol/L補骨脂素組100 μmol/L補骨脂素組對照組細胞增殖能力（OD值）1.61 ± 0.79a 1.73 ± 0.53a 3.71 ± 0.15abc 3.45 ± 0.14abc 3.37 ± 0.42abc 0.06 ± 0.02細胞ALP活性（OD值）0.25 ± 0.08a 0.43 ± 0.07ab 0.42 ± 0.05ab 0.22 ± 0.03acd 0.20 ± 0.05acd 0.05 ± 0.01

2.2 兩組細胞Runx2、OPN mRNA 相對表達量比較 細胞Runx2、OPN mRNA 相對表達量比較見表2。

表2 兩組細胞Runx2、OPN mRNA相對表達量比較（）

表2 兩組細胞Runx2、OPN mRNA相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別25 μmol/L補骨脂素組對照組OPN mRNA相對表達量5.44 ± 1.36a 1.38 ± 1.34 Runx2 mRNA相對表達量7.03 ± 3.55a 1.16 ± 0.70

3 討論

牙周炎主要由革蘭氏陰性細菌感染引起，是最常見的口腔感染性疾病，對患者的口腔功能、面部美學和生活質量都有嚴重不良影響［20］。研究［21］顯示，牙周炎的主要癥狀包括結締組織破壞、牙周附著喪失和牙槽骨吸收等。目前，牙周炎的治療方法主要為基礎治療、內科治療和手術治療等。引導組織再生術的主要目的是恢復和重建喪失的牙周組織，但尚不能獲得理想的牙周組織再生［22］。在正常生理條件下，牙槽骨的成骨細胞、破骨細胞和骨細胞相互作用，共同維持骨改建的動態平衡［23-24］。牙周炎患者牙周組織喪失源于骨改建的失衡，如何阻止牙周炎患者牙槽骨吸收，并實現牙槽骨再生，一直是牙周炎治療關注的熱點。牙周膜干細胞是一類具有多向分化潛能的間充質干細胞，能夠分化為成骨細胞、成纖維細胞、成牙骨質細胞等，具有調節牙槽骨改建的潛能，是研究牙周組織再生的首選細胞［25］。牙周膜干細胞的成骨分化功能，可成為牙槽骨再生治療的重要手段。

補骨脂素是一種天然的呋喃香豆素類生物活性分子，廣泛存在于多種自然植物中，如補骨脂、檸檬、酸橙、歐洲防風草、無花果和五指毛桃等，可用于治療骨質疏松［15］、腫瘤［26］、骨關節炎［27］、皮膚病［28］等。現代藥理研究表明，補骨脂素具有抗炎、抗癌、抗菌和雌激素活性等作用，其廣泛的生物醫學應用前景，正受到越來越多研究者的關注［9-13］。本實驗利用補骨脂素抗炎、抗骨質疏松的生物學特性，探究其在牙槽骨再生中的作用和機制。過高濃度的補骨脂素并不利于細胞發揮正常生理功能［29］，為了保證觀察結果的準確性，本實驗設計了5種不同補骨脂素濃度的實驗組，以觀察補骨脂素對細胞增殖和成骨分化的影響。

本文通過體外實驗研究補骨脂素對hPDLSCs增殖、成骨分化的影響，證實補骨脂素具有促進hPDLSCs 增殖和成骨分化的作用。CCK-8 檢測提示，補骨脂素能夠促進hPDLSCs 增殖，濃度在25～100 μmol/L范圍內效果更好。ALP活性檢測用于檢測成骨分化的早期潛力，是成骨分化的重要標志。ALP 活性檢測結果提示，補骨脂素能夠提高hPDLSCs ALP 的活性，且濃度在10～25 μmol/L 范圍內效果更好。茜素紅染色常用于檢測鈣沉積，證實細胞出現成骨分化特性。茜素紅染色結果顯示，25 μmol/L的補骨脂素能夠促進hPDLSCs經成骨誘導形成礦化結節。當補骨脂素濃度＞25 μmol/L時，細胞的成骨分化特性表達反而不強烈，可能是由于過高濃度的藥物對細胞的功能產生了不利影響。Runx2是成骨分化特異性轉錄因子，能上調前成骨細胞、軟骨細胞中各種礦化相關蛋白基因的轉錄，使其向成骨細胞方向分化；OPN是一種重要的骨基質蛋白，在骨礦化、代謝、重建中起重要作用。RT-qPCR法結果顯示，與對照組比較，25 μmol/L 的補骨脂素能夠提高hPDLSCs 中Runx2、OPN mRNA 的相對表達量，證實補骨脂素的作用可能與Runx2信號通路有關。

總之，補骨脂素能促進hPDLSCs 的增殖和成骨分化，尤以25 μmol/L 補骨脂素效果最好，機制可能與其可增強Runx2信號通路有關。