轉染DPP-4 siRNA 或（和）加入SP600125 的小鼠肺泡巨噬細胞極化及JNK/AP-1信號通路激活情況觀察

陳陽西，余幼微，楊帆，陳睦虎，宋其泰，鐘武，2

1 西南醫科大學附屬醫院急診醫學部，四川瀘州 646000；2 四川省康復醫院急診科

巨噬細胞是肺局部炎癥微環境和炎癥反應最重要的調節細胞，當肺受到各種外來致病因素刺激后，細胞被激活并釋放大量炎癥介質，引起炎癥級聯放大反應，細胞活化被認為是急性肺損傷以及肺部炎性疾病的始發因素［1-2］。巨噬細胞在不同環境信號刺激下極化為兩種主要的功能表型，即M1 和M2型，它們可以產生促炎或抗炎因子［3-4］。所以任何影響巨噬細胞M1/M2 極化穩態的因素都可能會造成機體疾病或炎癥狀態，通過干預巨噬細胞極化表型，可能成為治療急性肺損傷的新策略。二肽基肽酶-4（DPP-4）在肺實質和人類支氣管的上皮、血管內皮、成纖維細胞表面高度表達，通過切割和滅活部分趨化和炎癥因子可對炎癥和免疫功能產生顯著影響［5-6］。研究［7-9］發現，LPS 刺激可使小鼠巨噬細胞中DPP-4表達增加5～10倍，DPP-4可通過直接或間接的方式來減少或增加促炎因子的產生，在調節M1/M2型巨噬細胞極化過程中起不同的作用，但對DPP-4如何影響以及調節肺泡巨噬細胞極化的相關研究還比較少。本研究觀察了轉染DPP-4 siRNA 或（和）加入c-Jun N-末端激酶抑制劑（SP600125）的小鼠肺泡巨噬細胞極化情況、JNK/AP-1信號通路激活情況。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肺泡巨噬細胞（MH-S）、MH-S 細胞專用培養基（CM-0597）、無血清非程序凍存液（PB180438）；RIPA裂解液、蛋白質磷酸酶抑制劑、一氧化氮（NO）檢測試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒；BCA 蛋白濃度測定試劑盒；活性氧（ROS）檢測試劑盒；PVDF 膜；預染蛋白；LPS（O111：B4）、c-Jun N-末端激酶（JNK）抑制劑（SP600125）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；一抗體：p-JNK、JNK，CD86、CD206、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos；二抗體：HRP標志山羊抗小鼠、HRP標志山羊抗兔；DPP-4 siRNA、riboFECTCP轉染試劑；引物；快速RNA 提取試劑盒、反轉錄預混試劑盒、SYBR Green tag預混型qPCR試劑盒。

1.2 MH-S 細胞培養 復蘇購買的MH-S 細胞，接種于培養瓶中，加入MH-S 細胞專用培養基，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育，每間隔12 h或24 h更換培養液，待細胞生長至80%后吹打傳代，收集細胞用于后續實驗。

1.3 MH-S 細胞M1 型極化標志物及促炎因子檢測 ①細胞CD86 蛋白：采用Western bolt 法。取MH-S 細胞，將細胞接種于6 孔板中（2.0×105/孔），并隨機分為3 組，Control 組轉染空載siRNA，LPS 組轉染空載siRNA+LPS，siDPP-4+LPS 組轉染DPP-4 siRNA+LPS。將細胞使用PBS 水洗滌3 次，與RIPA裂解液混勻置于冰上裂解30 min，轉移至EP 管低溫高速離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min）；采用BCA 法進行蛋白定量，使用Loading Buffer 進行蛋白調平；混勻后置于100 ℃金屬浴煮沸10 min 使蛋白變性。通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，轉移到PVDF膜上，快速封閉液室溫封閉0.5 h，TBST洗膜10 min、重復3 次；清洗后加入一抗（1∶1 000 稀釋）在4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗10 min、重復3 次后加入二抗（1∶1 500 稀釋）在室溫下孵育1 h；孵育結束TBST 清洗10 min、重復3 次，滴加ECL 顯影液使用化學發光成像系統曝光條帶，采用Image J 對相應蛋白質水平進行定量分析；蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/對應GAPDH 灰度值。②細胞CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA：采用RT-qPCR 法。細胞分組及轉染同“1.3 中①”。使用快速RNA 提取試劑盒從細胞中分離RNA，以RNA 為模板通過逆轉錄試劑盒，逆轉錄得到cDNA。采用SYBR熒光定量檢測方法進行PCR擴增；反應條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環。實驗數據顯示為2-ΔΔCt值，以GAPDH為內參計算細胞中目的基因相對表達量。③細胞上清液NO、ROS：采用NO 測定試劑盒和免疫熒光法。取MH-S 細胞，將細胞接種于6 孔板中（2.0×105/孔），并隨機分為4 組。Control 組轉染空載siRNA，LPS 組轉染空載siRNA+LPS，siDPP-4+LPS組轉染DPP-4 siRNA+LPS，siDPP-4組轉染DPP-4 siRNA。使用移液槍將細胞上清液100 μL 分別加入96 孔板中，每組設置3 個副孔，做好標記；避光條件下依次加入Griess Reagent Ⅰ液50 μL 和Griess Reagent Ⅱ液50 μL 后輕輕混勻，室溫孵育10 min 后用酶標儀在540 nm 處檢測各組吸光度值（OD 值）。另采用免疫熒光法分析各組細胞內ROS 生成情況，將MH-S細胞接種至經過透明平底處理的6孔板上，棄去細胞培養基，用PBS 水清洗3 次后吸去廢液；取二甲基亞砜（DMSO）溶解為5 mmol 的ROS-二氫乙啶（DHE）儲存液，將儲存液按照1∶500 比例使用PBS 水稀釋成工作液后加入6 孔板中與細胞混勻，將6 孔板置于37 ℃水浴鍋中避光孵育30 min，再次使用PBS 水清洗3 次后吸除廢液；滴加DAPI 染核，室溫避光孵育20～30 min于熒光顯微鏡下觀察細胞形態，拍照分析細胞內熒光強度。

1.4 MH-S 細胞M2 型極化標志物檢測 細胞CD206 蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA：細胞分組、轉染、檢測方法同“1.3 中①、②”，分別采用Western bolt 法和RT-qPCR 法。實驗數據顯示為2-ΔΔCt值，以GAPDH 為內參計算細胞中目的基因相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/對應GAPDH灰度值。

1.5 MH-S 細胞JNK、AP-1 轉錄蛋白（c-Jun、c-Fos）磷酸化檢測 取MH-S細胞，將細胞接種于6孔板中（2.0×105/孔），并隨機分為4 組。siDPP-4+LPS+SP600125 組轉染DPP-4 siRNA+LPS 聯合SP600125，LPS 組轉染空載siRNA+LPS，siDPP-4+LPS 組轉染DPP-4 siRNA+LPS，LPS+SP600125 組轉染空載siRNA+LPS 聯合SP600125。采用Western blotting 法檢測各組細胞中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對表達情況，檢測方法同“1.3中①”，蛋白相對表達量=目的蛋白（磷酸化）灰度值/對應總蛋白灰度值。

1.6 統計學方法 采用Graphpad Prism9.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞M1 型極化標志物相對表達量比較 細胞M1型極化標志物相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞M1型極化標志物相對表達量比較（）

表1 各組細胞M1型極化標志物相對表達量比較（）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS組LPS組Control組IL-1βmRNA 4.790 ± 0.130#2.151 ± 0.266*1.118 ± 0.113 CD86蛋白0.816 ± 0.115#0.446 ± 0.039*0.209 ± 0.037 CD86 mRNA 3.478 ± 0.172#1.993 ± 0.117*1.036 ± 0.093 TNFα mRNA 3.797 ± 0.218#2.682 ± 0.218*1.082 ± 0.071 iNOS mRNA 3.024 ± 0.387#2.022 ± 0.172*1.113 ± 0.148

2.2 各組細胞上清液促炎因子水平比較 細胞上清液促炎因子水平比較見表2。

表2 各組細胞上清液促炎因子水平比較（）

表2 各組細胞上清液促炎因子水平比較（）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS組siDPP-4組LPS組Control組ROS（熒光強度）85.66 ± 10.81#33.20 ± 5.58 63.16 ± 10.15*34.86 ± 6.67 NO（OD值）13.831 ± 0.402#3.589 ± 0.404 7.884 ± 0.438*3.072 ± 0.441

2.3 各組細胞M2 型極化標志物相對表達量比較 細胞M2型極化標志物相對表達量比較見表3。

表3 各組細胞M2型極化標志物相對表達量比較（）

表3 各組細胞M2型極化標志物相對表達量比較（）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS組LPS組Control組IL-10mRNA 0.600 ± 0.049#0.831 ± 0.042*0.990 ± 0.008 CD206蛋白0.051 ± 0.029#0.259 ± 0.060*0.669 ± 0.126 CD206 mRNA 0.674 ± 0.046#0.906 ± 0.054*1.042 ± 0.049 ARG-1 mRNA 0.673 ± 0.068#0.807 ± 0.009*0.987 ± 0.037 IL-4 mRNA 0.702 ± 0.039#0.850 ± 0.062*1.008 ± 0.071

2.4 各組細胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos 蛋白磷酸化相對表達量比較 細胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos 蛋白磷酸化相對表達量比較見表4。

表4 各組細胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對表達量比較（）

表4 各組細胞p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對表達量比較（）

注：與LPS組比較，*P＜0.05；與siDPP-4+LPS組比較，#P＜0.05。

組別siDPP-4+LPS+SP600125組LPS組siDPP-4+LPS組LPS+SP600125組p-c-Fos/c-Fos 0.114 ± 0.016#0.324 ± 0.022 0.867 ± 0.055*0.098 ± 0.008*p-JNK/JNK 0.165 ± 0.021#0.373 ± 0.034 0.956 ± 0.099*0.155 ± 0.011*p-c-Jun/c-Jun 0.128 ± 0.010#0.533 ± 0.174 1.165 ± 0.057*0.178 ± 0.041*

3 討論

肺是人體中參與氣體交換的主要場所，在呼吸過程中肺部可遭受各種環境因素影響，比如暴露于煙霧、微粒的侵害以及病原體形式（如細菌、病毒和真菌）的感染［10］。肺部免疫細胞群主要由肺泡巨噬細胞構成，在維持肺部免疫穩態和防御過程中發揮著極其重要的作用，是機體抵御外部侵害的首道防線［2］。在外來病原體的刺激下，巨噬細胞可以釋放多種炎癥因子和趨化因子，在肺組織內引發一系列炎癥放大反應并介導肺組織損傷。由LPS 或干擾素-γ 誘導的M1 型巨噬細胞高度表達M1 型效應分子，如CD86、iNOS、TNF-α，通過產生活性氮和活性氧中間體參與NO 釋放和ROS 合成，具有增強巨噬細胞抗菌、促進炎癥反應發生，嚴重時造成組織損傷的作用；由IL-4 和IL-10 誘導的M2 型巨噬細胞高度表達M2 型效應分子，如CD206、ARG-1、IL-10、CD163，主要發揮抗炎反應，在致病因素消除或者炎癥后期促進組織修復和炎癥反應消退，具有促進血管生成、纖維化、腫瘤形成等功能［11-13］。因此，由巨噬細胞M1/M2 型極化失衡后釋放的炎性細胞因子和趨化介質可在肺部炎癥性疾病中發揮著重要作用，并與急性肺損傷、慢性阻塞性肺病、哮喘、特發性肺纖維化等肺部炎性疾病密切相關［14］。所以在本研究中，我們以小鼠肺泡巨噬細胞為關注點，并探討其可能影響巨噬細胞極化的靶點和作用機制，從而有助于我們更新和拓展巨噬細胞極化在急性肺損傷和相關肺部炎性疾病中的功能作用，為巨噬細胞參與的肺部炎性疾病治療提供新的思路和方向。

DPP-4 是一種調節胃腸源性肽激素的蛋白酶，其生物活性對內分泌途徑具有重要意義，其抑制劑通過增加胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖依賴的促胰島素多肽水平被廣泛用于治療2 型糖尿病［15］。由于DPP-4 在肺上皮、血管內皮以及肺泡巨噬細胞表面大量表達，越來越多的研究關注DPP-4 及其抑制劑在炎癥性肺部疾病中的潛在作用［5］。研究［16］表明，DPP-4 在巨噬細胞中可發揮直接的促炎作用，可溶性DPP-4 刺激LPS 預處理的細胞中會以劑量依賴性方式增加iNOS表達和NO的產生。同時發現，DPP-4在巨噬細胞高表達情況下通過CXCR4/mTOR 通路在促進巨噬細胞自噬的同時發揮一定的抗炎作用［17］。也有研究［8］揭示，DPP-4 以ROS 依賴的方式通過增加M1 極化和抑制M2 極化的方式來調節巨噬細胞M1/M2 極化平衡。以上研究充分證實了DPP-4 在炎癥免疫過程中發揮著不可或缺的作用，但關于DPP-4是如何影響巨噬細胞參與的極化過程卻少有研究。由于DPP-4在巨噬細胞中存在差異表達，所以本研究通過DPP-4 siRNA 轉染小鼠肺泡巨噬細胞的方法來探明LPS刺激的巨噬細胞極化表型轉變情況。本研究顯示，與Control 組比較，LPS 組M1 型促炎因子NO、ROS，M1 型極化標志物（CD86蛋白和CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA）表達升高，M2型極化標志物（CD206蛋白和CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA）表達降低。與LPS 組比較，siDPP-4+LPS 組M1 型促炎因子NO、ROS，M1 型極化標志物（CD86 蛋白和CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA）表達升高，而M2 型極化標志物（CD206 蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA）表達降低。所以上述實驗研究觀察到的M1/M2型極化標志物表達平衡變化和炎癥因子的釋放情況，說明了轉染DPP-4可促進LPS誘導的巨噬細胞發生M1型極化增強，使巨噬細胞M2 型極化減弱，并通過M1 型相關促炎因子的釋放在一定程度上促進了炎癥反應的發生。

JNK 作為絲裂原活化蛋白激酶的重要組成之一，在巨噬細胞M1 型極化過程中起到重要作用［18-19］。激活蛋白-1（AP-1）作為JNK 重要的效應物，主要由c-Jun和c-Fos組成，其表達靶基因的激活需要c-Jun 和c-Fos 的二聚化，這是AP-1 發揮功能的關鍵步驟［20］。AP-1 對先天免疫，尤其對巨噬細胞M1 型極化有著重要作用［21-22］。在炎癥反應中，當JNK 被特異性激活后，可進一步激活AP-1 等下游底物，導致促炎因子表達增加，如環氧合酶-2、TNF-α、IL-6 等［23］。以上研究證明了JNK/AP-1 信號通路在巨噬細胞M1 型極化過程的中的重要作用，但這一作用機制在肺泡巨噬細胞中是否適用還有待證實。所以，在本次研究中我們進一步評估了JNK/AP-1信號通路在轉染DPP-4 條件下對巨噬細胞極化表型變化的具體作用；研究發現，與LPS 組比較，siDPP-4+LPS 組p-JNK/JNK 和下游AP-1 轉錄蛋白（p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos）的蛋白磷酸化相對表達量升高；與siDPP-4+LPS 組比較，siDPP-4+LPS+SP600125組p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對表達量降低；以上結果說明了轉染DPP-4 后可促進LPS 誘導的JNK/AP-1 信號通路的激活，加入JNK 抑制劑后，由轉染DPP-4 引起的JNK/AP-1 信號通路的激活效應則被抑制。與LPS+SP600125 組相比，siDPP-4+LPS+SP600125 組中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun和p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相對表達量變化無顯著差異，說明使用DPP-4 siRNA 轉染細胞并不會影響JNK 抑制劑引起的JNK/AP-1信號通路變化，從而進一步說明JNK/AP-1信號通路在此次LPS誘導的巨噬細胞M1型極化過程中扮演重要作用。綜合以上數據，我們認為，轉染DPP-4后可能通過LPS誘導的MH-S細胞中JNK/AP-1信號傳導途徑的激活，從而參與巨噬細胞M1型極化過程。

總之，轉染DPP-4 siRNA 可促進LPS 誘導的巨噬細胞炎癥中JNK/AP-1 信號通路的激活，并促進巨噬細胞M1型極化的發生。