早發性卵巢功能不全患者外周血Tfh占比、功能相關細胞因子表達變化及其與性激素水平的相關性

麥爾哈巴·艾斯卡爾，朱玥潔，張曼麗，張于念，鞏曉蕓，王輝，丁劍冰，4

1 新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊 830054；2 新疆醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心；3 新鄉醫學院河南省免疫與靶向藥物重點實驗室；4 新疆醫科大學第一附屬醫院省部共建國家重點實驗室

早發性卵巢功能不全（POI）是指女性在40 歲之前出現卵巢功能減退的臨床綜合征，以月經異常（停經或稀發月經）伴有促性腺激素水平升高（FSH＞25 U/L）和雌激素水平波動性下降為特征［1］。POI 的發病率為1%～3.7%，且隨年齡增長而升高［2］。POI發病原因仍未完全確定，4%～30%的POI與自身免疫因素相關。研究［3-4］表明，POI 患者CD4+T 細胞增加，B 細胞增多，CD4+/CD8+比值上升。濾泡輔助性T 細胞（Tfh）是CD4+T 細胞的特殊亞群，主要定位于淋巴結和濾泡內。BCL-6、CXCR5 蛋白在Tfh 中呈高表達狀態，IL-6和IL-21在初始T細胞分化為Tfh 過程中起正向促進作用，均為Tfh 功能相關細胞因子。Tfh 能調節B 細胞增殖、延長B 細胞存活時間、漿細胞分化、體細胞高頻突變、抗體的重組和同型轉換、黏附以及輔助B 細胞招募其他分子［5］。目前，Tfh在感染、疫苗接種和腫瘤、自身免疫性疾病中的研究較多，但Tfh在卵巢疾病中的研究較少。本研究觀察POI患者外周血Tfh占比、Tfh發揮作用所涉及的因子水平變化，并分析其與性激素水平的相關性，探討Tfh 及相關因子在POI 發病中的應用價值，為POI的預防、診斷和治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2022 年1 月—2023 年6 月新疆醫科大學第一附屬醫院收治的POI 患者29 例（觀察組），年齡（34 ± 4）歲。診斷標準：參照2016 年歐洲人類生殖與胚胎學會發布的《POI 處理指南》［2］及2017 年《POI 的臨床診療中國專家共識》［6］中POI 的管理指南擬定相關標準。納入標準：①符合上述診斷標準者；②近3 個月內未服用任何激素類和影響內分泌激素的藥物者。排除標準：①具有或合并其他內分泌疾病者；②生殖器器質性病變引起的卵巢功能減退者；③患有嚴重的心、肝、腦、腎及造血系統等原發性疾病及精神障礙者；④對針具、線體過敏，或皮膚表面有大面積潰瘍、濕疹等不能配合治療者；⑤孕婦、哺乳期婦女及未有過性生活者。另選同期健康體檢者31 例（對照組），年齡（32 ± 4）歲。兩組一般資料無統計學差異，具有可比性。本研究獲新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準（審批號：K202303-09），同時已獲得全部患者的知情同意。

1.2 全血Tfh 檢測 采用流式細胞術測算外周血中Tfh 占比。取100 μL 的新鮮外周血，置于新的流式管中（在加完外周血于流式管中，要檢查流式管壁，并擦除管壁上殘留的外周血），分別加入CD3-APC-Cy7、CD4-FITC、CXCR5-PerCP-Cy5.5 等抗體，用渦旋振蕩器混勻，避光孵育20 min。加入2 mL紅細胞裂解液，移液器輕輕地反復混勻，并置于搖床上裂解20 min，后以1 500 r/min 速度離心5 min。棄上清，加2 mL 的PBS 緩沖液進行輕輕地反復混勻，后以1 500 r/min速度離心5 min。棄上清，加入200 μL的PBS 緩沖液混勻重懸，等待上機。通過FlowJo 軟件對檢測結果進行圈門和分析，結果以Tfh占CD4+T細胞的占比來表示。

1.3 外周血單個核細胞（PBMC）中CXCR5和BCL-6檢測 外周血離心后沉淀物中加入與其等量的生理鹽水進行混勻后，加入外周血淋巴細胞分離液溶液離心。離心結束取第二層云霧狀于液體并加入適量PBS 后混勻離心。加入2～4 mL 的紅細胞裂解液混勻，靜置20 min進行裂解。離心棄去上清，加入裂解液混勻進行裂解，后離心，結束后轉移至新的EP 管中，-20 ℃保存。對蛋白進行蛋白定量，蛋白變性。制膠，20 μL 蛋白上樣，電泳電轉，封閉2 h，TBST 漂洗、一抗孵育過夜（GAPDH、BCL-6、CXCR5），TBST漂洗、二抗1 h，TBST 漂洗、化學發光凝膠成像系統中進行曝光。后通過Image J 對蛋白條帶進行灰度值掃描，從而計算蛋白的相對表達量。

1.4 血清IL-6和IL-21檢測 采用ELISA 法檢測血清中IL-6 和IL-21，嚴格按照試劑盒說明進行操作，采用酶標儀檢測450 nm 波長下OD 值，通過標準品的OD 值和濃度制作四參數標準曲線，并按照所得計算濃度公式算出樣本的濃度，用算出的濃度表示最終結果。

1.5 血清性激素檢測 采集空腹靜脈血，離心后取血清，通過電化學發光法檢測血清促卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、泌乳素（PRL）、孕酮（P）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、抗繆勒管激素（AMH）。

1.6 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數檢驗。相關性分析采用Spearman 相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組全血Tfh 占比及PBMC CXCR5、BCL-6 蛋白相對表達量和血清IL-6、IL-21 水平比較 全血Tfh 占比及PBMC CXCR5、BCL-6 蛋白相對表達量和血清IL-6、IL-21水平比較見表1。

表1 兩組全血Tfh占比及PBMC CXCR5、BCL-6蛋白相對表達量和血清IL-6、IL-21水平比較［M（P25，P75）］

2.2 兩組血清性激素水平比較 血清性激素水平比較見表2。

2.3 觀察組Tfh、CXCR5蛋白、BCL-6蛋白、IL-6、IL-21與性激素的相關性 全血Tfh 占比與血清FSH、LH水平呈正相關（r分別為0.75、0.63，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負相關（r分別為-0.35、-0.82，P均＜0.05）；血清IL-6 水平與血清FSH、LH 水平呈正相關（r分別為0.75、0.62，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負相關（r分別為-0.47、-0.77，P均＜0.05）；血清IL-12 水平與血清FSH、LH 水平呈正相關（r分別為0.68、0.56，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負相關（r分別為-0.25、-0.73，P均＜0.05）；PBMC BCL-6 蛋白表達與血清FSH、LH 水平呈正相關（r分別為0.73、0.60，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負相關（r分別為-0.27、-0.76，P均＜0.05）；PBMC CXCR5 蛋白表達與血清FSH、LH水平呈正相關（r分別為0.72、0.58，P均＜0.05），與血清E2、AMH 水平呈負相關（r分別為-0.27、-0.70，P均＜0.05）。

3 討論

POI是指女性在40歲之前出現卵巢功能減退的臨床綜合征，臨床表現為月經異常、生育力降低或不孕、低雌激素水平及促性腺激素升高（FSH＞25 U/L），并伴有不同程度的圍絕經期癥狀［6-7］。POI是漸進變化并波動的過程，是卵巢功能減退的早期階段［8-9］。POI 病因和發病機制復雜，病情進展迅速且缺乏有效治療措施。POI 一旦發生常會導致嚴重的生育問題，嚴重影響了女性的身心健康。文獻［10］報道，有4%～30%的POI 與自身免疫因素相關。研究［3，11］表明，POI患者中出現免疫紊亂。然而Tfh由CD4+T細胞分化而形成的一個特殊亞群，其通過觸發B 細胞分化成分泌抗體的漿細胞和記憶性B細胞來參與體液免疫的調控［4，12］。研究發現，Tfh 在卵巢早衰中發揮著一定的作用。但是，目前Tfh在POI中的研究較少，對于介導POI的發病機制尚不清楚。因此，本研究通過檢測POI 患者全血中Tfh 及其相關因子的表達，并通過分析POI患者Tfh及其相關因子與激素水平之間的相關性，探究Tfh在POI中的臨床價值。

Tfh 作為CD4+T 的一個特殊亞群，以高表達BCL-6、CXCR5、IL-21 為特征。IL-21 和BCL-6 對Tfh的發育至關重要，其中IL-21 誘導Tfh 分化并促進其表面CXCR5 的表達［13］。此外，IL-6 和IL-21 作為正向調控Tfh 的細胞因子，IL-6 誘導新激活的CD4+T細胞表達BCL-6，促進Tfh 的發育，在IL-6 缺失的情況下，可以觀察到Tfh 分化的早期缺陷［14］，因此其在Tfh產生過程中是必須的。Tfh在自身免疫性疾病疾病中發揮重要的免疫作用［15］。本團隊前期研究發現［16］，Tfh 及相關因子在不明原因復發性流產中上調。此外有研究報道［17］，Tfh在卵巢相關疾病中會發生數量的變化，并與疾病的嚴重程度有關聯。

本研究顯示，與對照組相比，觀察組FSH、LH 水平升高，E2、AMH 水平降低。研究認為，FSH 水平的升高和AMH水平的降低都表明患者卵巢功能變差。內分泌激素水平表明POI的發生發展伴隨著相對應激素的改變，且伴隨卵巢功能的減退。本研究還顯示，觀察組全血Tfh占比增加，CXCR5、BCL-6蛋白表達也增加，表明在POI 患者中Tfh 及相關分子增多。研究報道，POI 患者中CD4+T 細胞和B 細胞數量增多，CD4+/CD8+比值增加。在小鼠POI模型研究中發現并得出［16］，小鼠卵泡數量的減少與卵巢內CD4+T細胞，B 細胞和巨噬細胞的增多有關。由此我們推測，在POI患者中出現了細胞免疫紊亂，該紊亂在一定程度上攻擊了卵巢組織并損傷了卵巢。ELISA 實驗結果顯示，觀察組細胞因子IL-6、IL-21 水平明顯升高。IL-6 和IL-21 作為CD4+T 細胞分化過程中正調控因子，促進CD4+T細胞分化為Tfh。相關性分析結果顯示，Tfh 及其相關因子與FSH，LH 呈正相關；與E2，AMH 呈負相關。在一項研究中發現，IL-6 和IL-2l水平越高，AMH水平越低，卵巢儲備功能越差。由此推測，POI 患者中AMH 水平越低，與AMH 呈負相關的Tfh 占比及IL-6、IL-21 水平升高使得患者卵巢功能低下。

總之，POI患者全血Tfh占比增加，PBMC CXCR5、BCL-6 蛋白表達升高，血清IL-6、IL-21 水平升高，血清FSH、LH 水平升高和E2、AMH 水平降低，Tfh 及其相關因子與激素水平呈正相關或負相關，可能參與了POI發生過程。