米非司酮混懸液灌胃制備小鼠不完全型胚胎著床障礙模型的適宜劑量選擇

葛挺，張曼麗，張于念，2，3，臘曉琳，2，3

1 新疆醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，烏魯木齊 830054；2 新疆生殖免疫臨床醫學研究中心；3 省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室

反復種植失?。≧IF）指40 歲以下女性在最少3個新鮮周期或冷凍周期內移植至少4 個優質胚胎后未能實現臨床妊娠［1］。反復自然流產（RSA）指連續兩次懷孕在同一妊娠周發生自然流產的現象，屬于婦產科常見并發癥。一次成功妊娠離不開優質胚胎和子宮內膜容受性，人類輔助生殖技術很大程度上排除了胚胎植入時胚胎質量對于妊娠結局的影響，因此探索胚胎植入時子宮內膜容受性有重要意義。小鼠因胚胎植入過程與人類相似，且因生殖周期短便于觀察，成為生殖醫學研究的首選動物模型。不完全型胚胎著床障礙（EID）模型鼠的子宮內膜蛻膜化異常與胚胎發育不同步，導致“種植窗”開放延后，從而出現胚胎著床數減少及發育不良，這與人類RIF 或RSA 的疾病特征更為相似［2］。米非司酮是一種具有抗糖皮質激素特性的孕激素受體拮抗劑，可以通過競爭性的與孕激素受體（PR）結合，阻斷孕激素對妊娠的支持［3］，導致子宮內膜蛻膜化異常，無法從增生期轉變為分泌期，從而在子宮內膜水平上影響胚胎植入，但以往采用米非司酮制備的模型不穩定［4-6］，尋找最佳制模劑量尤為重要。既往研究［7］發現當皮下注射0.06 mg時，小鼠著床率沒有影響；當皮下注射劑量為0.08 mg時，可引起小鼠完全型胚胎著床障礙，由于根據不同藥物給藥方式的藥物吸收率不同，灌胃藥物是皮下注射的2 倍左右，并且灌胃給藥較皮下給藥，生物利用率較低，更容易制備不完全型EID 模型。故本研究分別采用0.12、0.14、0.16 mL/只的米非司酮（1 mg/mL）灌胃妊娠期雌性小鼠制備不完全型EID 模型，并比較各劑量制備后雌性小鼠的妊娠率、胚胎著床點數、血清雌激素及孕酮（P）的含量、子宮內膜的形態改變及PR，以篩選米非司酮的適宜劑量，旨在為建立穩定且有效的不完全型EID 動物模型提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7 周齡SPF 級發育成熟、未孕且未產雌性昆明小鼠32 只，體質量30～35 g，購于新疆醫科大學實驗動物中心［SCXK（新） 2018-0002］。7周齡SPF 級發育成熟且未交配雄鼠16 只，體質量35～40 g，購于新疆醫科大學實驗動物中心［SCXK（新）2018-0002］。動物飼養于新疆醫科大學實驗動物中心［SYXK（新） 2018-0003］，屏障環境，12 h光照，12 h 黑暗，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，自由飲食，食用標準小鼠維持飼料。本研究獲得新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審核批準（IACUC-20211224-47）。

1.2 主要試劑與儀器 米非司酮片（25 mg，H20033551，武漢九瓏人福藥業有限責任公司）；生理鹽水（50 mL，H20044304，四川科倫藥業股份有限公司）；ELLSA 試劑盒（Progesterone EIA Kit，Cat.#JL20678，江萊生物）；ELLSA 試劑盒（Estrogen EIA Kit，Cat.#JL11232，江萊生物）；蘇木素伊紅染色試劑盒（G1120，索萊寶）；孕激素受體抗體（25871-1-AP，proteintech），二抗（SA00001-2，proteintech）；光學顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 米非司酮混懸液配制 25 mg 米非司酮片于研缽中研磨成粉狀，倒入合適的容器中，加入25 mL生理鹽水，超聲溶解，配制成1 mg/mL的米非司酮混懸液，無耗損，現配現用。

1.4 雌性妊娠小鼠篩選及分組 先將雌、雄小鼠分籠適應性飼養。5天后每日下午5∶30通過目測法觀察雌性小鼠陰道，目測法無法辨別情期時，可采用陰道涂片法。將動情期雌性小鼠于當日下午6∶00 與雄鼠以2∶1的比例合籠。次日早上9∶00檢查雌性小鼠陰道后分籠喂養，若發現雌性小鼠陰栓則計為妊娠第1 天（PD1）。將32 只PD1 雌性小鼠隨機分為4組，每組8只。

1.5 米非司酮混懸灌胃制備雌性妊娠小鼠不完全型EID 模型方法 于雌性小鼠妊娠第4 天（PD4）早上9∶00進行造模。對照組給予適量生理鹽水，低劑量組灌胃給予0.12 mL 米非司酮混懸液制備不完全型EID 模型，中劑量組灌胃給予0.14 mL 米非司酮混懸液制備不完全型EID 模型，高劑量組灌胃給予0.16 mL米非司酮混懸液制備不完全型EID模型。

1.6 觀察指標及觀察方法 于妊娠第8天（PD8）早上9∶00經眼球取血，離心處理，收集血清，-80 ℃凍存，用于血清雌二醇（E2）和P 的檢測。迅速剖腹，觀察子宮形態及血流供應狀況，并計錄雌性小鼠妊娠數量及兩側子宮胚胎著床數，將胚胎去除后的子宮浸泡于4%多聚甲醛溶液中，用于后續HE染色及免疫組化。血清E2和P：從-80 ℃中取出血清樣本，37 ℃水浴鍋中解凍，按照酶聯免疫吸附測定法，取出E2、P的ELLSA 試劑盒，經過包被、洗滌、孵育等過程，于450 nm 處測OD 值，繪制標準曲線，計算E2、P含量。雌性小鼠平均著床胚胎數、妊娠率：檢查子宮，記錄每只雌性小鼠胚胎著床情況，以及懷孕雌性小鼠數量。并通過以下公式計算妊娠率及平均著床胚胎數。妊娠率=孕鼠數/受試動物數×100%。平均著床胚胎數=總著床胚胎數/孕鼠數。子宮內膜組織病理學：采用HE 染色法。將浸泡在多聚甲醛溶液中的雌性小鼠子宮組織切分成大小為0.5 cm×0.5 cm 的組織塊，進行石蠟包埋并進行切片，厚度為2 μm，石蠟切片進行蘇木素、伊紅染色，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察各組雌性小鼠子宮內膜的超微結構變化。子宮內膜組織PR：采用免疫組化法。取子宮內膜白片在60 ℃烤箱內烤4～6 h，37 ℃孵箱過夜，二甲苯脫蠟2 次，每次10 min，酒精梯度復水，每次3 min，去離子水震蕩洗滌2 次，每次5 min，抗原修復，室溫冷卻，3%H2O2室溫避光浸泡10 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；滴加封閉血清，室溫孵育15 min，滴加一抗，4 ℃過夜；復溫15 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；滴加二抗，常溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，滴加二抗，常溫孵育20 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，DAB 顯色，蘇木素復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明2 次，每次10 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。利用Image J 分析軟件進行分析，計算陽性表達區域的累積光密度值及對應的表達區域面積，以平均光密度值（AOD）作為陽性表達的定量標準，反映PR 表達情況。AOD=累積光密度/陽性區域面積。

1.7 統計學方法 采用SPSS27.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey' HSD法；不符合正態分布用中位數（最大值，最小值）表示，組間比較采用Krus Kal-WallisH檢驗，多重比較采用Bonferroni 法調整α 水準。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清E2、P水平比較 各組血清E2、P水平比較，P均＞0.05（詳見表1）。

表1 各組血清E2、P水平（）

表1 各組血清E2、P水平（）

組別低劑量組中劑量組高劑量組對照組n8 8 8 8 E2（pg/mL）31.37 ± 3.06 32.08 ± 2.13 31.28 ± 3.01 32.64 ± 2.32 P（ng/mL）21.24 ± 0.36 20.56 ± 0.72 22.13 ± 0.27 21.48 ± 0.28

2.2 各組子宮肉眼觀比較 對照組8 只雌性小鼠全部妊娠，且雙側子宮均勻增大，子宮血供豐富，胚胎著床點分布緊密且無出血點，胚胎發育良好。低劑量組8 只雌性小鼠也全部妊娠，雙側子宮外觀形態與對照組無異常，但子宮血供較對照組差，胚胎發育無異常。中劑量組8 只雌性小鼠也均妊娠，但是雌性小鼠兩側子宮胚胎著床點較對照組和低劑量組分布不規則，部分胚胎著床處有積血；胚胎體積也較對照組和低劑量組小，未著床處的子宮較細，顏色蒼白，血供不佳。高劑量組雌性小鼠中僅有1只妊娠，雙側子宮形態規則，顏色蒼白，血供較差，雙側子宮彈性差。

2.3 各組妊娠率及胚胎著床數比較 低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組妊娠率分別為100.0%、100.0%、12.5%、100.0%，高劑量組分別與其他3 組比較，P均＞0.05；低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組胚胎著床數分別為16.00（13，18）、12.50（8，15）、0（0，1）、16.50（14，17）個，中劑量組、高劑量組分別與低劑量組、對照組比較，高劑量組與中劑量組比較，P均＜0.05。

2.4 各組子宮內膜組織病理學比較 對照組：子宮內膜間質廣泛蛻膜化反應，腺體數量多，腺腔面積大，腺腔內含有分泌物，小血管增生；低劑量組：子宮內膜間質蛻膜明顯，腺體數量多；中劑量組：子宮內膜有蛻膜化改變，間質較致密，腺體較少而小，血管擴張不明顯；高劑量組：子宮內膜間質區蛻膜化不完全，腺體小而少，分泌不足，內膜間質致密，仍呈增生期樣改變，發育明顯滯后（詳見圖1）。

圖1 各組小鼠子官內膜腺體、腺腔、血管(HE染色，×200)

2.5 各組子宮內膜PR 表達比較 對照組和低劑量組兩組中上皮層PR 表達完整，形態規則。隨著給藥劑量的增加，中劑量和高劑量兩組中上皮層PR 表達缺失，且高劑量組更明顯。低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組PR AOD 分別為0.279 ± 0.019、0.213 ± 0.016、0.192 ± 0.017、0.301 ± 0.018，中劑量組、高劑量組分別與對照組比較，中劑量組、高劑量組分別與低劑量組比較，高劑量組與中劑量組比較，P均＜0.05。

3 討論

據統計，75%的妊娠損失與著床失敗有關［8］。胚胎著床作為哺乳動物成功建立妊娠的關鍵前提，是一個囊胚和子宮內膜之間的復雜對話過程。根據子宮內膜對于囊胚著床的敏感性，可將子宮內膜分為接受前期、接受期以及非接受期［9］。囊胚與子宮內膜的質量以及這二者發育的同步性是成功妊娠的必要條件［10-11］。子宮內膜接受胚胎著床的時間有限，這一階段被稱為“著床窗口”，主要受P 和E2調節。于PD1，P 和E2調節子宮內膜細胞的增殖和分化，并建立著床窗口；排卵前，卵巢分泌的E2增多，誘導子宮內膜上皮細胞增殖，從PD3開始，新形成的黃體分泌的P 開始增加，并啟動基質細胞分化。由于P 水平升高和卵巢分泌的E2小幅升高，在PD4 子宮由接受前期過渡為接受期［12］。在這一過程中，E2刺激基質細胞增殖，誘導子宮內膜細胞上的PR 表達，繼而在P的作用下，子宮內膜轉化為具有支持作用的接受態。此時，上皮細胞增殖停滯，母體在P的作用下維持妊娠［13］。目前，構建EID 模型［14］的方法有多種。吲哚美辛［15］通過抑制前列腺素的合成，阻止血管內皮生長因子的表達，從而抑制子宮內膜血管的生成，降低血管通透性，抑制子宮內膜蛻膜化。宮腔注入95%乙醇［16］通過損傷子宮內膜導致胚胎種植失敗。利洛司酮［17］干擾子宮內膜孕激素和前列腺素的平衡，從而使子宮收縮較強，導致EID。上述造模方法類似于子宮內膜受損或薄型子宮內膜引起的EID，這與RIF 或RSA 因子宮內膜“種植窗”開放滯后而引起胚胎著床失敗的疾病特點不相符。因此，需要構建不完全型EID 的動物模型對研究RIF或RSA的發病機制的研究具有深刻意義。

米非司酮是一種口服的活性孕激素受體拮抗劑，其與PR 結合的親和力是P 的5 倍，競爭性與PR結合，阻止孕激素在子宮中發揮作用，從而抑制子宮上皮的分泌和基質細胞的蛻膜化，從而阻止胚胎著床［18］。米非司酮可溶于有機溶劑，不溶于水，臨床上普遍采用口服的方式給藥。既往的研究均通過皮下注射米非司酮，但其溶解性差，故采用皮下注射造模平均著床數波動較大，模型不穩定。皮下給藥較灌胃給藥的生物利用率高，更容易構建完全型EID 模型。因此，本研究通過灌胃的方式，尋找合適的劑量，建立穩定且有效的不完全型EID 模型。本實驗中在雌性小鼠合籠見栓后，于PD3～PD4，發育正常的胚胎移行至兩側子宮腔，胚胎著床大約發生在PD4 傍晚［19］。因此于PD4 上午9∶00 給予米非司酮混懸液，可以排除由于胚胎自身發育問題以及輸卵管功能障礙而導致的著床障礙。與此同時，由于子宮內膜對于米非司酮敏感性較高，可以阻止增生期的子宮內膜轉變為分泌期，降低子宮內膜容受性，使胚胎與子宮內膜發育不同步，發生著床障礙。胚胎完成植入大概在PD6～PD7，故于PD8 進行采樣［20］。本實驗中，當灌胃劑量為0.12 mL/只（低劑量組）時，妊娠率和平均胚胎著床數均無影響；當灌胃劑量為0.14 mL/只（中劑量組）時，妊娠率無影響，但可顯著減少平均胚胎著床數；當灌胃劑量為0.16 mL/只（高劑量組）時，妊娠率和平均胚胎著床數均降低。可見，當米非司酮劑量為0.16 mL/只時，可以抑制雌性小鼠胚胎著床。鏡下觀察，高劑量組子宮內膜較其他3 組相比，間質區蛻膜化不完全，腺體小而少，分泌不足，內膜間質致密，仍呈增生期樣改變，發育明顯滯后。同樣，PR 表達明顯低于其他三組，但血清中的E2和孕激素無明顯變化。說明當米非司酮劑量為0.16 mL/只時，在子宮局部競爭性與PR結合，干擾孕激素的正常作用，導致子宮內膜發育遲緩，蛻膜化異常，著床窗口開放延遲。EID 動物模型目前沒有統一的判斷標準，研究［6-7，14，21］認為妊娠率和平均胚胎著床數顯著減少是判斷造模成功的標準；林益等［2］提出了根據子宮內膜“種植窗”是否完全關閉分為完全型著床障礙和不完全型著床障礙。因此根據本實驗結果表明：雌性小鼠妊娠第4 天給予0.16 mL/只1 mg/mL 米非司酮構建更加符合不完全型EID 模型，為后期進一步研究RIF 和RSA 供了理想的動物模型。

總之，米非司酮制備小鼠不完全型EID 模型穩定可靠，適宜劑量為0.16 mL/只（1 mg/mL）。