P2X7R過表達的巨噬細胞MSU晶體誘導痛風炎癥反應過程中IL-1β、TNF-α、NLRP3表達觀察

秦麗巖，冀琨，陳鄔錦，張蓓，孫玉萍，李瑞

1 新疆醫科大學公共衛生學院，烏魯木齊 830017；2 新疆醫科大學第六附屬醫院神經外科；3 新疆醫科大學基礎醫學院

痛風是晶體相關關節性疾病，可以表現為急性痛風發作、慢性痛風性關節炎或痛風石等［1］。文獻［2］報道，尿酸在體內堆積形成單鈉尿酸鹽（MSU）晶體，可誘導痛風炎癥反應。MSU 晶體被巨噬細胞吞噬后，啟動先天免疫，激活NOD 樣受體家族3（NLRP3）、Toll 樣受體和NOD 樣受體信號轉導通路，產生并分泌IL-1β，促進痛風的進展［3］。但MSU 晶體并不是引起痛風發作的惟一因素，甚至清除MSU 晶體后也不能阻止痛風的發作［4］。嘌呤能受體P2X 配體門控離子通道7 的配體（P2X7R）是嘌呤能受體P2X 家族的重要成員，在人體的固有免疫中發揮重要作用，當細胞外三磷酸腺苷（ATP）濃度發生變化時，P2X7R 被活化，此時引起細胞內鉀外流，激活NLRP3 蛋白，并進一步分泌IL-1β，引起炎癥反應［5］。然而，痛風的發生是否與P2X7R 的活化并激活NLRP3 蛋白有關鮮有報道。2022 年5 月—2023 年5 月，我們觀察了P2X7R過表達白血病細胞誘導分化的巨噬細胞MSU 晶體誘導痛風炎癥反應過程中IL-1β、TNF-α、NLRP3 蛋白表達情況，旨在為探討痛風發作的分子機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、慢病毒載體及主要試劑、儀器 人單核細胞白血病細胞系THP-1 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；慢病毒載體V1000532-1 PDS279_pLCMV-GFP-ccdB-puro-P2X7R（P2X7R 過表達慢病毒載體）和V1000532-2 PDS279_pL-CMV-GFP-ccdBpuro-blank（P2X7R 過表達慢病毒空載體）購自北京擎科生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液購自Gibco公司，FBS 和雙抗購自Sciencell 公司，THP-1 細胞專用培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，MSU 購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）購自MultiSciences 公司，RNA 提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自上海賽默飛世爾科技有限公司，Real Time PCR EasyTM-SYBR Green Ⅰ試劑盒購自成都福際生物技術有限公司，高效RIPA 組織/細胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、甘氨酸、三氨基甲烷和吐溫-20 購自Solarbio 公司，Easy See Western blot kit購自Trans 公司，SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒和中分子量蛋白marker 購自Biosharp 公司，RB A beta-Actin 和NLRP3 抗體購自Bioss 公司，P2X7R 抗體購自Abcam 公司，ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。氣套式觸屏CO2恒溫培養箱購自美國精騏公司，低速臺式離心機、高速冷凍離心機購自湖南湘儀公司，渦旋儀購自其林貝爾公司，生物安全柜購自蘇凈安泰公司，倒置生物顯微鏡系統和熒光顯微鏡購自寧波舜宇儀器有限公司，數顯恒溫水浴鍋購自上海力辰邦西儀器科技有限公司，立式高壓蒸汽滅菌器購自上海申安醫療器械公司，微量移液器購自德國賽多利斯集團，微量振蕩器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，熒光定量PCR 儀購自杭州朗基科學儀器有限公司，Bio 小型垂直電泳及轉印購自Bio-Rad Laboratories公司，水平脫色搖床和化學發光成像購自北京六一生物科技有限公司，酶標儀購自北京凱奧科技發展有限公司。

1.2 THP-1 細胞分組、P2X7R 過表達質粒轉染及THP-1 細胞誘導分化為巨噬細胞、MSU 晶體誘導痛風炎癥反應過程 THP-1 細胞培養于THP-1 細胞專用培養基，置于37 ℃、含有5% CO2的細胞培養箱中培養。當細胞密度達到90%左右時進行傳代。將培養至第三代的細胞接種于6 孔板中，37 ℃培養過夜，第2 天觀察細胞，密度在30%～40%時，將細胞隨機分為過表達組、空白組、模型組、對照組。將200 μL 滴度為1×108TU/mL 的P2X7R 過表達質粒、空白質粒分別加入過表達組和空白組，十字交叉法混勻后放入細胞培養箱過夜，第3 天給細胞換正常培養基，繼續培養72 h。將過表達組、空白組和模型組細胞用100 ng/mL 的PMA 刺激3 h 后分化為巨噬細胞，另將MSU 晶體用氫氧化鈉溶解配制成濃度為100 μg/mL的MSU乳糜狀懸液并加入細胞培養液中孵育6 h。收取巨噬細胞和巨噬細胞上清液，以備下一步實驗使用。

1.3 巨噬細胞P2X7R mRNA、蛋白相對表達量測算 ①P2X7R mRNA：采用RT-PCR 法。取各組細胞，吸棄培養基后，每孔加入1 mL 的TRIzol 充分裂解細胞，然后吸至離心管中。按照RNA 提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，測定RNA 濃度后，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR。引物序列：P2X7R：F-AGCTCGCAAACCATTCTCCA，R-TGTGTAAACGTGGACGGGAG；β-actin：F-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，R-GCTGTCACCTTCACCGTTCC。熒光定量程序設定為預變性94 ℃、3 min，變性94 ℃、5 s，退火60 ℃、20 s。②P2X7R 蛋白：采用Western blot 法。各組細胞中加入1 mL 的TRIzol 充分裂解細胞，然后吸至離心管中，向離心管中加入等體積5×loading buffer，置于金屬浴中煮20 min 提取細胞總蛋白，按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量。選擇10%配膠試劑盒配膠，待檢測蛋白樣品上樣量為20 μL。電泳（濃縮膠恒壓70 V，約20 min；分離膠恒壓110 V），電泳停止后轉膜，轉膜條件為恒流230 mA，150 min。轉膜結束后將膜置于牛奶中封閉1 h，孵育一抗（一抗采用1∶10 000濃度稀釋，孵育1 h）和二抗（二抗采用1∶20 000濃度稀釋，孵育1 h），化學發光成像系統曝光，保存圖片。

1.4 巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α 檢測 采用ELISA 法。取各組細胞上清液，嚴格按照ELISA 試劑盒操作要求進行操作。設置標準品孔、空白對照孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。樣本孔中加40 μL 樣本稀釋液，然后再加待測樣本10 μL；空白對照孔不加樣本及酶標試劑。標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化酶（HRP）標記的待測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5 次。每孔加入底物A、B 各加50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min 內在450 nm 波長處測定各孔的OD 值。

1.5 巨噬細胞NLRP3 蛋白相對表達量測算 分組及檢測方法與“1.3中②”相同。

1.6 統計學方法 采用SPSS23.0 軟件和Graph Pad Prism7.0 軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組巨噬細胞P2X7R mRNA、蛋白相對表達量比較 巨噬細胞P2X7R mRNA、蛋白相對表達量比較見表1。

表1 各組巨噬細胞P2X7R mRNA、蛋白相對表達量比較（）

表1 各組巨噬細胞P2X7R mRNA、蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與過表達組比較，cP＜0.05。

P2X7R蛋白0.24 ± 0.02ab 0.18 ± 0.01ac 0.20 ± 0.03a 0.12 ± 0.01組別過表達組空白組模型組對照組P2X7R mRNA 3.62 ± 0.28ab 2.25 ± 0.16ac 2.44 ± 0.54a 1.02 ± 0.27

2.2 各組巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α水平比較巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α水平比較見表2。

表2 各組巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α水平比較（）

表2 各組巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與過表達組比較，cP＜0.05。

TNF-α 78.71 ± 1.90ab 72.74 ± 2.53ac 72.86 ± 1.51a 65.82 ± 2.81組別過表達組空白組模型組對照組IL-1β 67.12 ± 1.48ab 59.81 ± 0.94ac 61.57 ± 2.42a 54.42 ± 2.21

2.3 各組巨噬細胞NLRP3 蛋白相對表達量比較過表達組、空白組、模型組、對照組巨噬細胞NLRP3蛋白相對表達量分別為0.95 ± 0.10、0.71 ± 0.08、0.80 ± 0.06、0.60 ± 0.07，過表達組、模型組分別與對照組比較，過表達組與模型組、空白組比較，P均＜0.05。

3 討論

痛風是一種炎癥性關節炎，雖然是自限性疾病，但急性發作時嚴重影響患者的生活質量，而且隨著經濟的發展，痛風的發病率也有所增加，因此越來越引起公眾關注［6］。痛風是高尿酸血癥進展而來，MSU 在關節腔中析出后可作為危險信號激活NLRP3，從而招募ASC（凋亡相關斑點樣蛋白）和Caspase-1 組成NALP3 炎性小體，使得IL-1β成熟并分泌，驅動炎癥反應，導致患者受累關節腫脹、疼痛。此外也有研究證實，MSU 不僅能激活NOD 樣炎性信號通路誘導炎癥，而且作為跨膜蛋白的Toll 樣受體也能感受到MSU，從而激活細胞內銜接蛋白MyD88，使得核因子-κB（NF-κB）向細胞核移動，最終合成并釋放IL-1β，參與痛風的發病［7-9］。但隨著對痛風研究的不斷深入發現，并非所有高尿酸血癥患者都會發生痛風的急性發作，故不能單純的認為僅有MSU 晶體就會發生痛風，痛風的發作還存在其他致病信號［10］。THP-1 是人單核細胞白血病細胞，經PMA 刺激后會誘導分化為巨噬細胞，而MSU 晶體可以刺激巨噬細胞促進炎癥并激活免疫細胞，導致促炎介質和趨化因子的釋放引發痛風。此外，現在越來越多的研究發現，巨噬細胞在痛風發作的開始、進展及消退過程中都發揮作用［11］。雖然目前關于痛風發病機制的研究眾多，但關于巨噬細胞在痛風發生過程中發揮的作用研究較少，因此本研究選用THP-1 細胞，經PMA 誘導分化為巨噬細胞后通過過表達P2X7R，探討P2X7R 與痛風炎癥反應間的關系，為深入挖掘痛風的發病機制提供實驗數據，為今后尋找防治痛風的藥物靶點提供線索。

P2X7R 是一種ATP 門控離子通道受體，其可感受細胞外ATP 水平變化［12］。當受高濃度ATP 持續刺激時，P2X7R 被激活，形成離子通道及孔道，允許大分子通過，同時使鈣離子由胞外進入細胞，鉀離子從細胞流出，這些變化就會激活先天免疫系統中的NLRP3 炎癥小體［13］。NLRP3 被激活后，會與ASC 相互作用，進而招募Caspase-1 形成NLRP3 炎癥小體，炎癥小體經裂解使Caspase-1 有活性，經進一步加工后，產生并分泌成熟IL-1β，引起炎癥［14］。因此，ATP/P2X7R 信號通路可以與其他致病信號協同參與炎癥性疾病的發病過程［15-16］。酗酒、暴飲暴食、勞累、寒冷、熬夜等都是痛風發作的誘發因素。在這些致病信號的刺激下，機體ATP 水平會波動，如劇烈運動時的機械刺激會激活AMP 蛋白激酶，使得ATP 利用減少，產生增加；寒冷環境下，機體的適應性發熱也會增加ATP 水平；飲酒會促進ATP 合成酶的表達，從而提高ATP 的濃度等。而當MSU 晶體在關節腔沉積后會引起關節周圍組織壞死，此種情況下，細胞釋放產生的局部ATP 水平也會增加。增加的ATP 就會激活P2X7R，從而使細胞內外發生離子流，活化NLRP3 炎癥小體，最終釋放大量IL-1β，觸發痛風的急性炎癥反應［17-19］。因此認為ATP 是除MSU 晶體外引起痛風發作的關鍵致病信號，而P2X7R 的表達是炎癥級聯反應的關鍵。綜上，本研究通過過表達P2X7R，在細胞痛風炎癥反應中探討P2X7R 與NLRP3 炎癥小體及炎癥因子間的關系，旨在表明P2X7R 可能作為痛風發作的致病信號。

NLRP3 是一種具有特殊功能（傳感器和效應器）的模式識別受體，在無菌性炎癥性疾病和抗菌防御中具有重要作用［20］。近年來的研究數據顯示，NLRP3 炎性小體在痛風發作過程中發揮舉足輕重的作用。NLRP3 的激活一方面是由于脂多糖激活NF-κB 信號通路，促進NLRP3 炎癥小體成分的表達，而另一方面則是由于MSU 晶體被巨噬細胞攝取后促進NLRP3 炎性小體的組裝和活化。活化的NLRP3 炎性小體可進一步觸發下游炎癥信號級聯反應，其中就包括促炎細胞因子的產生及釋放［21］。IL-1β 和TNF-α 都是典型的促炎細胞因子，而且先前的研究已經證實MSU 晶體可以促進單核細胞來源的巨噬細胞分泌IL-1β，與痛風的炎癥反應密切相關［22］。因此，本研究探討了P2X7R 與NLRP3 炎性小體及促炎細胞因子IL-1β 和TNF-α 間的關系，旨在表明P2X7R 可能是痛風炎癥反應的另一個觸發因素。本研究結果顯示，P2X7R mRNA 相對表達量在過表達組最高，與對照組、模型組和空白組差異均有統計學意義。P2X7R 和NLPR3 蛋白相對表達量均在過表達組最高，且與對照組、模型組和空白組差異有統計學意義。因此，本實驗結果說明，NLRP3、IL-1β 和TNF-α 水平會隨P2X7R 水平的增高而增高，P2X7R 參與了MSU 晶體誘導的痛風炎癥反應。

總之，P2X7R 參與了MSU 晶體誘導的痛風炎性因子IL-1β 和TNF-α 的產生并釋放，且可能通過激活NLRP3蛋白來實現。