DNA條形碼技術融入普通昆蟲學實驗教學

康澤輝，孫麗娟，鄭桂玲，張 曉

（青島農業大學植物醫學學院，山東青島 266109）

0 引言

普通昆蟲學是植物保護專業的入門課程，是學習昆蟲學的基礎，也為后續多門課程打下重要基礎，是植物保護專業高水平、高質量人才培養的關鍵課程之一［1-2］。該門課程具有很強的實踐性，通過實驗教學可以使學生深入了解理論知識，同時也能提高實驗技能和科研能力［3］。隨著科技的發展，昆蟲學研究的方法和技術也在不斷更新和發展，然而，在實際的教學過程中，很多實驗教學內容都比較傳統，尤其是分類學部分實驗內容比較單一，缺乏創新性和前沿性，嚴重限制了學生對昆蟲學研究的探索和發展［4-6］。

DNA條形碼技術是一種基于DNA 序列的物種鑒定方法，該方法可以應用于各種生物樣本，只需極少量的樣本即可獲得高保真度的DNA條形碼序列，而且處理過程簡單、速度快，可以實現高精度的物種鑒定。此外，DNA條形碼技術具有高度的可重復性和可比性，不受環境因素的影響，具有較高的鑒定準確性［7］。DNA條形碼技術在人們的生產生活各個領域都有著廣泛的應用，隨著技術的不斷發展和應用的不斷拓展，DNA條形碼技術將會在未來的研究和應用中發揮更加重要的作用。因此，在普通昆蟲學實驗教學中融入DNA條形碼技術非常必要。

昆蟲分類是普通昆蟲學課程的重要組成部分，也是教學中的重點和難點，這方面的教學交流和研討一直是一個熱點。此前的很多研究圍繞提高標本質量、運用多媒體技術、改革教學模式（如翻轉課堂、互動教學）等方面提出了很多建議［1-3］，但融合最新科研成果和技術方面的研究相對較少［4-6］。利用DNA條形碼技術開展分子鑒定在一些生物學、動物學實驗課程研究和改革中有所涉及［8-9］，但在普通昆蟲學實驗教學中的研究還很少。對利用DNA 條形碼開展分子鑒定的流程進行全面分析和優化基礎上，本文設計了開展DNA條形碼專題實驗或者將其與傳統分類實驗結合的實施和考核方案，以期為改變普通昆蟲學實驗傳統教學模式、探索創新性實驗教學提供思路。

1 DNA條形碼技術

DNA條形碼技術可以用于農作物品種鑒定，通過對農作物DNA 測序，可以快速、準確地鑒定不同品種之間的差異和相似性，從而實現對農作物品種的優化和改良［10］。還可以通過對農產品DNA 進行測序，可以快速、準確地鑒定農產品的品種和來源，從而實現對農產品的質量控制和溯源管理。此外，DNA 條形碼技術可以通過對不同農作物樣本進行DNA測序，了解不同品種之間的遺傳關系，從而為農作物的遺傳改良提供科學依據［11-12］。相比傳統的鑒定方法，DNA條形碼技術可以通過測序物種特定基因的序列來確定物種的身份，從而避免了傳統鑒定方法中可能存在的誤判或漏判等問題。比如有些物種在形態上非常相似，很難通過傳統的鑒定方法來區分它們，而DNA條形碼技術可以通過測序物種特定基因的序列，來確定物種的身份，從而對于難以區分的物種具有更加明顯的優勢。

DNA條形碼技術在其他領域也有著廣泛的應用，可以幫助生態學家準確地鑒定和分類生物物種，從而更好地研究生物群落結構、物種多樣性、生態系統功能等生態學問題。例如，在研究食物鏈中的物種關系時，DNA條形碼技術可以確定食物鏈中不同物種的身份和數量，從而更好地研究食物鏈的穩定性和影響因素。DNA條形碼技術在食品鑒定中也有廣泛的應用。通過對食品中的DNA 序列進行分析，可以快速、準確地鑒定食品中是否含有非法添加物或雜質。例如，在魚類鑒定實驗中，可以通過對魚類DNA 序列進行分析，判斷魚類是否為野生或人工養殖的，是否含有添加物或雜種等。DNA 條形碼技術在醫學中也有著廣泛的應用，可以幫助進行疾病診斷、藥物研發等方面的研究。例如，利用DNA條形碼技術可以對不同癌癥樣本進行測序，了解它們之間的遺傳關系，為癌癥的診斷和治療提供科學依據。此外，DNA 條形碼技術在犯罪偵查中也有著重要的應用價值，可以幫助進行身份鑒定、證據分析等方面的工作。

DNA條形碼技術是生命科學領域的前沿技術，掌握該技術可以使學生了解和掌握最新的科技發展動態，提高科技創新能力和創新意識。作為未來的創新型人才，植物保護專業學生需要掌握DNA 條形碼技術，以更好地應對未來的挑戰和機遇。

2 DNA條形碼實驗設計

2.1 可行性分析

DNA條形碼序列應保證序列信息豐富度和可分辨性，同時應具有一定的保守性，即同一物種的DNA條形碼序列應高度相似，而不同物種的DNA條形碼序列應有明顯差異，以確保物種的可識別性。此外，DNA條形碼的分子標記應具有廣泛性，以確保能夠鑒定到盡可能多的物種。關于DNA 條形碼的分子標記選擇已有大量討論和比較分析研究，從目前的研究結果來看，昆蟲的標記選擇趨向于線粒體細胞色素C 氧化酶亞單位I基因（COI基因）［13］。

線粒體COI基因在昆蟲綱多個目的DNA 條形碼分子鑒定中已有廣泛應用，相關鑒定流程較為成熟，主要包括樣品處理、DNA提取、PCR擴增、測序及結果分析。此外，對該技術應用較成熟的檢驗檢疫部門已在2016年頒布了《DNA條形碼物種鑒定操作規程》（SN/T4626—2016）。

目前已有較多DNA 條形碼序列豐富的基礎數據庫可供使用，如BOLD 數據庫（Barcode of Life Data Systems，http：//www.boldsystems.org/）、NCBI（National Center for Biotechnology Information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GenBank數據庫等，其中BOLD 數據庫中已經有超過1 000 萬個DNA 條形碼數據。這些數據庫包含了充足的線粒體COI 基因序列數據和相關信息，足夠覆蓋普通昆蟲學涉及昆蟲類群的數據比對和分析。

綜上，目前昆蟲在DNA 條形碼分子標記的篩選、分子鑒定操作流程、基礎數據庫建設等方面已較為完善，這些都為本實驗的順利設計提供了堅實基礎。

2.2 實驗方案

在整合大量文獻的基礎上，通過驗證和摸索，優化了以COI基因序列作為DNA條形碼開展分子鑒定的具體流程（見圖1），以便在普通昆蟲學實驗教學中開展DNA條形碼專題實驗或者將其與傳統分類實驗結合。

圖1 普通昆蟲學DNA條形碼分子鑒定實驗流程圖

（1）樣品保存。將獲取的新鮮昆蟲樣品浸泡于無水乙醇中，置于-20 ℃冰箱中保存，避免樣本腐爛和DNA降解。

（2）DNA提取。DNA提取是DNA條形碼分析的關鍵步驟之一，DNA提取的方法選擇會直接影響后續實驗的準確性和效果。對于昆蟲樣本的DNA 提取有以下幾種方法：①酚氯仿法。是一種傳統的DNA提取方法，該方法具有操作簡單、成本低等優點，但是提取的DNA 質量和純度較低，容易受到污染，不同實驗人員操作重復性差，不利于保護RNA，很難進行微量化的操作，且實驗過程中會接觸苯酚、氯仿等試劑，毒性較大。②離心柱法。優點是比傳統的酚氯法提取的質量和純度高，有利于保護RNA，能進行微量操作，且價格低廉，操作便捷，提取過程不使用苯、氯仿等有毒試劑，逐漸取代了傳統DNA 提取方法，是目前較為通用的DNA提取方法。③磁珠法。操作簡單快速，能實現高通量、自動化操作，提取效率高且安全無毒。提取過程中只需微量的樣本，提取的核酸純度高、濃度大，且靈敏度高，但該方法依賴于磁力分離裝置或自動提取儀，目前價格依然很高。

綜合來看，離心柱法更適合于普通昆蟲學實驗，以天根公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）為例，該方法的具體操作如下：

①選用昆蟲胸部肌肉或者足，個體較小時可利用除腹部和翅以外的全部蟲體。將選取的昆蟲組織放入1.5 mL離心管中，加入200 μL 緩沖液GA，使用研磨棒進行充分研磨。

②加入20 μL 蛋白酶K 溶液，充分混勻。放入56 ℃水浴鍋中消化過夜，直至組織溶解。

③取出離心管，加入200 μL 緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃水浴10 min，簡短離心。

④加入200 μL無水乙醇，充分震蕩約15 s，混勻并簡短離心。

⑤將上一步所得溶液轉入組裝好的吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉，將吸附柱放回收集管中。

⑥向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD（需提前按要求加入無水乙醇），12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉，將吸附柱放回收集管中。

⑦向吸附柱中加入700 μL漂洗液PW（需提前按要求加入無水乙醇），12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉，將吸附柱放回收集管中。

⑧向吸附柱中加入500 μL 漂洗液PW，12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉。

⑨將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min 離心2 min，廢液倒掉。將吸附柱打開蓋子置于超凈工作臺中，吹15 min，徹底晾干吸附柱。

⑩將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加入50 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。DNA產物保存在-20 ℃冰箱中，防止DNA降解。

（3）PCR擴增。

①引物選擇。DNA條形碼序列主要利用COI 基因序列5′端位于輕鏈1 490 和重鏈2 198 之間目的片段。目前LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAA TCA-3′）為最為通用的昆蟲COI 基因序列擴增的引物［14］，在此基礎上改造的LepF1（5′-ATTCAAC CAATCATAAAGATATTGG-3′）和LepR1（5′-TAAACTT CTGGATGTCCAAAAAATCA-3′）目前也較為廣泛應用［15］。

②PCR擴增體系和條件。將提取的DNA作為模板，使用COI基因特異性引物進行PCR擴增。參考生工Taq PCR Master Mix 的建議用量，摸索出最適PCR的反應體系Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物分別為1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：94 ℃預變性，4 min。30 個擴增循環：94 ℃變性，30 s，45～55 ℃復性，30 s，72 ℃延伸，1 min；72 ℃終延伸10 min；10 ℃保溫。反應結束后及時取出放入4 ℃冰箱保存。

（4）電泳檢測。將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Gold View 型核酸染色劑染色，上樣3 μL的PCR產物進行檢測，確認PCR 擴增是否成功并檢測DNA 的大小和純度。凝膠成像系統進行觀察并拍照保存。具體步驟如下：

①1%的瓊脂糖凝膠制備。稱取0.4 瓊脂糖置于錐形瓶中，加入40 mL的1*TBE 緩沖液，微波爐中高火加熱煮沸至瓊脂糖全部融化并搖勻。將凝膠沖水冷卻至60 ℃，不燙手時加入4 μL的Gold View型核酸染色劑并混合均勻。

②膠板制備。取洗凈晾干的制膠槽放入制膠玻璃板，將梳子放入固定好，將上述凝膠倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，不要產生氣泡，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置30 min，至膠完全凝固后垂直輕拔梳子，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加1*TBE至沒過膠板。

③加樣。吸取3 μL的PCR產物加入膠板的槽孔里，另加入5 μL Marker作為對照。

④電泳。加樣完畢后，立刻通電進行電泳，電壓160 V，電流60 mA，樣品從負極向正極方向移動，電泳30 min。

⑤觀察拍照。電泳完畢后取出凝膠放入凝膠成像系統內觀察并拍照保存。

（5）測序和分析。將PCR 產物送至測序公司進行測序。通常使用Sanger測序方法，核苷酸雙向測序結果以SEQ 和ABI 格式輸出。使用CONTIG 序列編輯軟件對測序的COI 結果進行編輯、修剪和校正，輸出FASTA 格式序列。序列上傳至BOLD 數據庫的IDENTIFICATION 板塊或NCBI 中的BLAST 進行比對，找出序列相似度最高的物種信息。

2.3 評價考核

本實驗重點培養學生的動手能力、科學素養和創新精神。在實驗過程中，要鼓勵學生進行討論和交流，分享彼此的觀察和發現，讓學生在互相學習和交流中不斷提高。在實驗完成后，要對實驗結果進行詳細的分析和解讀，將實驗結果進行對比和驗證。通過分析實驗結果，讓學生更深入地了解基本原理，并能夠加深對科研成果的理解和應用。在實驗結束后，要求學生撰寫實驗報告，在報告中應詳細描述實驗的過程、結果和分析。通過撰寫實驗報告，讓學生能夠更全面地理解實驗過程和原理，同時也能夠提高學生的科學寫作能力。

評價考核主要通過觀察實驗過程，結合實驗結果和實驗報告進行，重點關注以下幾個方面：①實驗操作技能，包括實驗操作的規范性、熟練性和正確性等指標；②實驗報告能力，包括實驗報告的完整性、規范性、清晰性和邏輯性等指標；③實驗思維能力，包括實驗設計的合理性、實驗數據的分析能力和實驗結果的解釋能力等指標；④實驗安全意識，包括實驗安全規定的遵守程度、實驗安全操作的正確性和實驗安全問題的處理能力等指標；⑤綜合素質，包括學生的學習態度、團隊合作能力、創新能力和解決問題的能力等指標。

經評價考核，若學生已經充分掌握了知識內容，并熟練運用知識點內容設計實驗方案，并能夠在完成基本實驗要求的情況下表現出較強的實際動手能力，則評判為A檔；若學生基本掌握了知識點，完成了實驗內容，表現出了一定的學習能力，則評判為B 檔；若學生對知識點內容沒有完全理解，不能根據原理和知識點完成實驗內容，則評判為C 檔，并要求學生繼續學習相關知識，熟悉實驗操作流程，提升自身的整體能力。

3 結語

將DNA條形碼技術融入普通昆蟲學實驗教學可以提高學生的科研能力和綜合素質，促進植物保護專業本科教學的發展。為了實現這個目標，需要拓寬教學內容、創新教學方式，即引入更多的分子生物學知識和技術，如DNA條形碼技術與PCR技術、基因測序技術等，從而更好地了解這些技術的原理和應用，并采取更加生動、直觀的教學方法，可以通過講解案例、實驗操作和課堂討論等方式，使學生更好地了解DNA條形碼技術的原理和應用。還需要加強實驗室建設，提供先進的實驗設備和技術支持，如PCR 擴增儀、DNA 測序儀等先進的實驗設備，為學生提供更好的實驗條件和技術支持。此外，還要加強師資隊伍建設，培養更多的專業教師和科研人才，尤其是具有分子生物學背景和實驗技能的教師，為學生提供更好的教學和指導。

通過這些努力，在DNA條形碼技術融入普通昆蟲學實驗教學的基礎上，未來可以將更多科研成果和技術融入植物保護專業的實驗和實踐課程中，能夠進一步提高學生的科學素養和實踐能力，同時也能夠激發學生的創新能力，讓學生能夠更好地應用科學知識解決實際問題。相信按照該模式可以培養更多的創新型人才，進一步發展植物保護事業，為守護國家糧食安全做出更大的貢獻。