ESBLs陽(yáng)性肺炎克雷伯菌的研究進(jìn)展

丁嘉雯 李娜

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，濱州 256600

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是目前臨床上重要的條件致病菌之一［1］。它在自然界中廣泛存在，不僅可以在水和土壤中單獨(dú)存在，還可以與植物、昆蟲(chóng)或各種哺乳動(dòng)物等以共生生物或潛在病原體的形式共同存在，引起人類(lèi)廣泛感染。20世紀(jì)80年代，一名德國(guó)醫(yī)生首次發(fā)現(xiàn)了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）基因；他在1例ICU患者身上分離出了具有超廣譜活性的β-內(nèi)酰胺酶基因SHV-2［2］。研究者分析發(fā)現(xiàn)，SHV-2是SHV-1在氨基酸序列的238位點(diǎn)由甘氨酸序列突變成了絲氨酸序列，發(fā)生了點(diǎn)突變。近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物的大量應(yīng)用，導(dǎo)致KPN引起的耐藥性及醫(yī)院感染的比例明顯上升。因?yàn)楫a(chǎn)ESBLs KPN經(jīng)常攜帶不止一種耐藥基因，所以引起的細(xì)菌感染往往表現(xiàn)為更強(qiáng)的耐藥性。因此，對(duì)KPN的深入研究具有重要意義［3］。

ESBLs陽(yáng)性KPN的耐藥基因分析

1.檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)［TEM、SHV、OXA、CTX-M］、喹諾酮類(lèi)［aac（6’）-Ib-cr］的耐藥基因

KPN最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制是產(chǎn)ESBLs，可水解青霉素及頭孢菌素類(lèi)抗生素，造成多藥耐藥，而ESBLs是β-內(nèi)酰胺酶中重要的一類(lèi)，它主要是質(zhì)粒介導(dǎo)的衍生物，通過(guò)改變活性位點(diǎn)構(gòu)型的突變而產(chǎn)生，從而擴(kuò)大酶的水解譜［4］。目前，發(fā)現(xiàn)的ESBLs依據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能主要包括TEM、SHV、鄰氯青霉素水解酶（OXA）、CTX-M和其他一些少見(jiàn)類(lèi)別［5］。根據(jù)CTX-M型ESBLs氨基酸殘基序列相似性，將其大致分為4類(lèi)：CTX-M-1型（CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-15及CTX-M-55等）、CTX-M-2型（CTX-M-2、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-6等）、CTX-M-9型（CTX-M-9、CTX-M-13、CTX-M-14、CTX-M-27等）及CTX-M-8/CTX-M-25組［6］。此外，ESBLs的流行類(lèi)型在不同的國(guó)家和地區(qū)也不盡相同，這是抗菌藥物的使用觀念和使用策略不同以及細(xì)菌對(duì)于不同抗菌藥物的自身選擇壓力不同導(dǎo)致的［7］。有研究顯示，北美及西歐地區(qū)主要以TEM型和SHV型為主，南美地區(qū)和東歐地區(qū)則以CTX-M型為主［8］。而在我國(guó)，CTX-M型是主要的耐藥基因，同時(shí)還兼有SHV型和TEM型的存在。

CTX-M是我國(guó)最常見(jiàn)的ESBLs耐藥基因。有研究表明，染色體DNA上β-內(nèi)酰胺類(lèi)CTX-M-9耐藥基因在ESBLs（+）的KPN中陽(yáng)性率為70%，但在ESBLs（-）KPN中的檢出率為0。其次，喹諾酮類(lèi)aac（6’）-Ib-cr耐藥基因在ESBLs（+）KPN中的檢出率也明顯高于ESBLs（-）的KPN菌株，其陽(yáng)性率為40%［9］。因此，KPN染色體DNA所攜帶的β-內(nèi)酰胺類(lèi)CTX-M-9基因和喹諾酮類(lèi)aac（6’）-Ib-cr等多種耐藥基因均與產(chǎn)ESBLs的垂直遺傳傳播有關(guān)。

同時(shí)，由于抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)于抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，使得越來(lái)越多的產(chǎn)ESBLsKPN攜帶多種耐藥基因，這讓我們對(duì)其耐藥基因的研究變得更加復(fù)雜也更加困難。

2.整合子

整合子是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的可移動(dòng)基因元件，是一種潛在的移動(dòng)端遺傳元件，能夠捕獲和傳遞特定的外源基因盒［10］。其本身無(wú)法移動(dòng)，通常位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和致病島嶼上，捕獲并整合耐藥基因從而形成巨大的多基因座，并隨著細(xì)菌的不斷復(fù)制進(jìn)行傳播，促進(jìn)它們?cè)诓煌?xì)菌之間轉(zhuǎn)移［11］。根據(jù)整合酶基因的核苷酸序列不同，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5類(lèi)整合子［12］，其中對(duì)I、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子研究較多，且明確與耐藥性有關(guān)。在革蘭陰性菌株中，I類(lèi)整合子更為常見(jiàn)，且有較高的耐藥基因攜帶率，是KPN最常見(jiàn)的整合子類(lèi)型。研究表明，ESBLs（+）KPN中，整合子的攜帶率較ESBLs（-）KPN高［13］，且其含有的ESBLs基因型別越多，該菌攜帶I類(lèi)整合子的可能性也越大［14］。I類(lèi)整合子已被鑒定為耐藥基因的主要來(lái)源，并被懷疑是多種革蘭陰性菌耐藥基因的宿主和交換平臺(tái)，因此了解KPN I類(lèi)整合子的流行病學(xué)和分子特征對(duì)實(shí)施干預(yù)策略至關(guān)重要［15］。

多位點(diǎn)序列分型

首先參照多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）數(shù)據(jù)庫(kù)確定MLST的7個(gè)管家基因（gapA、rpoB、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）［16］。采用水煮法粗提DNA，將得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在50 ℃的退火溫度下進(jìn)行，除了gapA（60 ℃）和tonB（45 ℃）以外。純化的PCR產(chǎn)物用焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序［17］，并使用SnapGene對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)，用在線(xiàn)工具（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）分配等位基因編號(hào)和序列類(lèi)型。根據(jù)pubMLST得到的ST結(jié)果，將pubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)ST類(lèi)型的等位基因按相同順序串聯(lián)，得到不同ST類(lèi)型的串聯(lián)序列［18］。MLST的結(jié)果可以通過(guò)聚類(lèi)技術(shù)進(jìn)行分析，使用最嚴(yán)格定義的eBURST V3（http：//eburst.mlst.net）分析［19］；基于ST型，可以把不同菌株歸于不同克隆群中，高遺產(chǎn)相似性的分離株歸為一個(gè)克隆群［20］。

同源性分析

分子分型在流行病學(xué)研究中起著重要作用，可以確定分離株和感染源之間的遺傳相似性，這種方法也可以用于監(jiān)測(cè)醫(yī)院病原體的傳播和遺傳多樣性。KPN的同源性分析的方法有多種，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）［21］和質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）［22］。

1.PFGE

PFGE使用脈沖場(chǎng)電泳室分離限制性DNA條帶，然后根據(jù)PFGE條帶模式對(duì)細(xì)菌進(jìn)行克隆分配。其結(jié)果具有極高的分辨率和再現(xiàn)性，因此被認(rèn)為是流行病學(xué)研究的分子金標(biāo)準(zhǔn)［23］。它可以根據(jù)基因組指紋圖譜的變化來(lái)區(qū)分臨床和環(huán)境分離株，對(duì)親緣相近菌株進(jìn)行細(xì)致區(qū)分。PFGE分型用于感染控制，追蹤醫(yī)院內(nèi)病原體的傳播。比較從患者、醫(yī)護(hù)人員和病房環(huán)境中分離的細(xì)菌PFGE條帶，有助于感染控制團(tuán)隊(duì)確定感染源和傳播途徑［24］。

將篩選出的ESBLs陽(yáng)性KPN菌株進(jìn)行裂解、洗膠、酶切、上樣，通過(guò)電泳獲得圖像，利用BioNumerics軟件進(jìn)行同源性分析［25］。用該軟件分析宏觀限制性片段模式，采用算術(shù)平均的非加權(quán)對(duì)組方法進(jìn)行樹(shù)狀圖分析。當(dāng)菌株的宏觀限制模式的3個(gè)條帶的差異最大時(shí)（即相似性水平約為80%），菌株可被聚為群。采用皮爾遜雙側(cè)卡方檢驗(yàn)，如果任何單元格中的期望計(jì)數(shù)低于要求，則使用Fisher精確檢驗(yàn)來(lái)比較這些數(shù)據(jù)［26］。

2.MALDI-TOF MS

近10年來(lái)，MALDI-TOF MS作為一種快速、可靠的微生物鑒定方法得到了廣泛的應(yīng)用［27］。它的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在通量高、時(shí)效高、誤差小、性?xún)r(jià)比高等［28］，已被納入許多臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的工作流程，在流行病學(xué)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。這種方法的實(shí)施使實(shí)驗(yàn)室能夠在以前無(wú)法想象的時(shí)間尺度上為臨床醫(yī)生提供最終的生物鑒定。MALDI-TOF MS主要檢測(cè)的蛋白是核糖體蛋白，分析檢測(cè)蛋白質(zhì)指紋圖譜，但也能檢測(cè)到其他高度豐富的胞質(zhì)蛋白（如DNA結(jié)合蛋白和冷休克蛋白）。然后使用軟件將未知生物的光譜剖面與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，通過(guò)分析病原菌菌株間蛋白豐度的細(xì)小差異，自動(dòng)確定被測(cè)試生物的身份［29］。

MALDI-TOF MS檢測(cè)結(jié)果與MLST檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性，可建立各醫(yī)院流通的產(chǎn)ESBLs KPN克隆體的數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于疫情的快速識(shí)別［30］。但是，MALDI-TOF MS仍然存在許多挑戰(zhàn)，包括參考譜的主要局限性。微生物的質(zhì)譜鑒定依賴(lài)于鑒定每個(gè)物種的特征譜，并與MALDI-TOF MS中的大型數(shù)據(jù)庫(kù)（也稱(chēng)為參考譜）進(jìn)行比較。

綜上所述，ESBLs陽(yáng)性KPN由于其強(qiáng)大且復(fù)雜的耐藥機(jī)制，給臨床抗菌治療帶來(lái)了很大的困難，其暴發(fā)也對(duì)不同地區(qū)乃至國(guó)家的醫(yī)療衛(wèi)生安全帶來(lái)極大威脅。因此，明確其具體的耐藥機(jī)制、分子分型及同源性，有助于科學(xué)制定抗感染治療方案，對(duì)防止或減慢耐藥基因、耐藥菌株的產(chǎn)生、播散和流行具有重要意義［31］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明丁嘉雯：試驗(yàn)實(shí)施與研究，數(shù)據(jù)采集與分析，文章撰寫(xiě)；李娜：設(shè)計(jì)并指導(dǎo)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析，對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱