基于頂空固相微萃取-氣相色譜-嗅聞儀-質(zhì)譜儀結(jié)合氣味活力值鑒定檳榔香六堡茶關(guān)鍵香氣物質(zhì)

陳國(guó)和,胡騰飛,王樂(lè)涯,歐行暢,李勤,黃建安,3,劉仲華,3*,王超,3*

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙,410128)

2(國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南 長(zhǎng)沙,410128)

3(湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長(zhǎng)沙,410128)

六堡茶,我國(guó)特有的一種黑茶,因產(chǎn)于廣西壯族自治區(qū)梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名,距今已有1 500年歷史[1]。六堡茶是以蒼梧縣群體種、大中葉種及其分離、選育的品種、品系茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]的毛茶為原料,經(jīng)特定的加工工藝(篩分、拼配、汽蒸或不汽蒸、渥堆、汽蒸、壓制成型或不壓制、陳化等)制成的茶葉[2-3],其中微生物發(fā)酵在其品質(zhì)形成中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[4],造就了其獨(dú)特的“紅、濃、陳、醇”,并帶有陳香、檳榔香或參香風(fēng)味的品質(zhì),以及特殊的保健功效,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷香港、東南亞國(guó)家和地區(qū),備受廣大消費(fèi)者的青睞[5-8]。

檳榔香是六堡茶特有的、極具辨識(shí)度的獨(dú)特風(fēng)味,也是六堡茶獨(dú)特魅力所在。作為六堡茶獨(dú)特的茶韻,檳榔香必須要在良好的倉(cāng)儲(chǔ)環(huán)境下經(jīng)歷一定年限的陳化才能形成,所以檳榔香大多存在于六堡陳茶和老茶中,新茶很少有檳榔香出現(xiàn)[9]。劉澤森等[10]采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)結(jié)合氣相GC-MS對(duì)不同年份檳榔香六堡茶進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)隨著貯藏年份的增加,檳榔香六堡茶中香氣越加渾厚,這可能與六堡茶中陳香類物質(zhì)如雪松醇、杜松烯和花果香類物質(zhì)如β-芳樟醇、氧化芳樟醇含量隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng)而升高有關(guān)。目前對(duì)六堡茶檳榔香的研究主要集中在對(duì)其感官理化分析和揮發(fā)性香氣物質(zhì)組成分析方面。黃林杰等[6]采用動(dòng)態(tài)頂空結(jié)合氣相GC-MS對(duì)檳榔香六堡茶揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析,初步確定檳榔香主要揮發(fā)性成分為α-雪松醇、β-芳樟醇、(Z)-芳樟醇氧化物、水楊酸甲酯、苯甲酸甲酯、α-雪松烯、奈和甲氧基苯類化合物。LI等[11]采用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)檳榔香六堡茶進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)普勒酮、萘、1-甲基萘、2-甲基萘、2-庚酮、二氫-β-紫羅蘭酮和2-戊基呋喃可能是形成六堡茶檳榔香的重要香氣化合物。目前研究均為對(duì)檳榔香六堡茶揮發(fā)性香氣物質(zhì)的分析,對(duì)其關(guān)鍵香氣物質(zhì)組成深入研究較少,值得進(jìn)一步挖掘。

HS-SPME是一種集取樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣為一體的揮發(fā)性物質(zhì)提取技術(shù),具有操作簡(jiǎn)單、樣品用量少、無(wú)需使用溶劑、萃取樣品后可直接色譜進(jìn)樣等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種茶葉香氣的分析中[11-13]。本研究采用HS-SPME聯(lián)合氣相色譜-嗅聞儀-質(zhì)譜儀(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry, GC-O-MS)和氣味活力值(odor activity value, OAV)對(duì)檳榔香六堡茶關(guān)鍵香氣物質(zhì)進(jìn)行研究,以期為揭示六堡茶檳榔香特征風(fēng)味形成機(jī)理提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檳榔香六堡茶(5個(gè)樣品,均倉(cāng)儲(chǔ)5～7年),梧州中茶茶業(yè)有限公司,茶葉經(jīng)粉碎過(guò)2.0 mm圓孔篩,冰箱保存?zhèn)溆?氯化鈉(分析純),天津化學(xué)試劑一廠;六堡茶香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%),上海思域化工科技有限公司;內(nèi)標(biāo)物(正癸醇,≥99.5%),上海騰準(zhǔn)生物科技有限公司;C8～C32連續(xù)正構(gòu)烷烴溶液(500 mg/L,溶解劑為氯仿),美國(guó)AccuStandard公司,用于氣味化合物保留指數(shù)的計(jì)算。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國(guó)Agilent公司;OPD Ⅲ嗅聞儀,哲斯泰(上海)貿(mào)易有限公司;固相微萃取裝置和固相微萃取頭(65 μm PDMS/DVB),美國(guó)Supelco公司;IT-09A恒溫磁力攪拌器,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;YP1200電子天平,上海精科電子有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME程序

檳榔香六堡茶揮發(fā)性香氣物質(zhì)采用HS-SPME配置65 μm PDMS/DVB萃取頭進(jìn)行富集,富集條件參考先前的報(bào)道[14-15],詳情如下:精確稱取1.0 g六堡茶樣品、2.0 g氯化鈉放置20 mL頂空瓶中,加入轉(zhuǎn)子、50 μL內(nèi)標(biāo)物(66.5 μg/mL)和5.0 mL煮沸超純水,迅速擰緊瓶蓋。將頂空瓶放置于60 ℃恒溫水浴杯中,平衡5 min,插入HS-SPME萃取頭,恒速攪拌吸附60 min,然后迅速將HS-SPME萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口,解析附4 min,同時(shí)啟動(dòng)儀器數(shù)據(jù)采集。

1.3.2 儀器條件

儀器條件參考先前的研究[13]。GC-O條件是安捷倫GC(7890B)配置氫火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector, FID)和嗅聞儀,安捷倫HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)用于揮發(fā)性物質(zhì)的分離。升溫程序:初始溫度40 ℃(保持5 min),以3 ℃/min升至180 ℃,然后以10 ℃/min升高到250 ℃,保持5 min;GC進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣模式和載氣(He>99.999%)流速分別為250 ℃、不分流模式和1.0 mL/min。嗅聞儀條件:空氣流量為60 mL/min,傳輸線溫度為250 ℃。色譜柱流出成分在毛細(xì)管末端以1∶1的分流模式分別進(jìn)入檢測(cè)器和嗅聞儀。

GC-MS條件:色譜柱型號(hào)、升溫程序、GC進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣模式和載氣流速均與GC-O分析相同,進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣。質(zhì)譜條件為EI源,電子能量70 eV;接口溫度為280 ℃;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度為150 ℃;發(fā)射電流為34.6 A;掃描方式:全掃描;質(zhì)量掃描范圍:35～450 aum;溶劑延遲時(shí)間:3.0 min。揮發(fā)性香氣化合物的鑒定是基于NIST 17數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配、化合物保留指數(shù)(保留指數(shù)是C8～C32連續(xù)正構(gòu)烷烴相同色譜條件下分析后計(jì)算所得)和香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 嗅聞分析

嗅聞分析由4名(1名男士和3名女士)具有2年以上茶葉感官審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的茶葉研究人員組成,平均年齡28歲。4名嗅聞分析人員來(lái)自于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司,無(wú)抽煙史,且要求實(shí)驗(yàn)期間不允許使用化妝品。嗅聞分析時(shí)要求每位人員記錄嗅聞到的氣味和氣味強(qiáng)度。其中氣味強(qiáng)度采用數(shù)字進(jìn)行量化,其中0、1、5、9分別代表未嗅聞到氣味、氣味強(qiáng)度微弱、氣味強(qiáng)度中等和氣味強(qiáng)度高。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中至少有2名人員在同一保留時(shí)間處嗅聞到相同的氣味為有效結(jié)果,最終每個(gè)化合物的氣味強(qiáng)度為4名人員嗅聞到的氣味強(qiáng)度的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用氣味化合物標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/內(nèi)標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)(y),以氣味化合物標(biāo)準(zhǔn)品濃度/內(nèi)標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)(x)建立每種氣味化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)每種氣味化合物進(jìn)行定量分析。在氣味化合物定量分析的基礎(chǔ)上,參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中的黑茶審評(píng)方法,3 g茶樣,茶水比1∶50(g∶mL)計(jì)算每種氣味化合物的濃度,結(jié)合已報(bào)道每種氣味化合物在水中的閾值(https://www.vcf-online.nl/VcfHome.cfm),計(jì)算氣味活力值(OAV=化合物濃度/化合物閾值)。使用MS Excel 2010(Microsoft,USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 六堡茶氣味化合物鑒定

采用GC-O和GC-MS對(duì)檳榔香六堡茶進(jìn)行分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、保留指數(shù)和化合物氣味,從檳榔香六堡茶中嗅聞、鑒定出37種呈現(xiàn)氣味的化合物(表1)。氣味強(qiáng)度(odor intensity, OI)中等以上的化合物有19種,其中酮類化合物氣味強(qiáng)度相對(duì)較高,二氫-β-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮?dú)馕稄?qiáng)度最高,均為9(氣味強(qiáng)度高),其次為脫氫二氫-β-紫羅蘭酮(OI=7.57)、α-紫羅蘭酮(OI=7.38)和(Z)-茉莉酮(OI=5.24)。二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮和α-紫羅蘭酮均為類胡蘿卜素衍生出的芳香化合物,呈現(xiàn)出“木質(zhì)”氣味,曾被鑒定存在于各類茶葉中,對(duì)茶葉特征香氣的形成起關(guān)鍵作用[16]。(Z)-茉莉酮呈現(xiàn)“茉莉花”氣味,曾被報(bào)道是Chin Shin烏龍茶和四季茶的關(guān)鍵香氣化合物,相對(duì)含量高達(dá)7.00%～12.15%[17];醇類化合物氣味強(qiáng)度較高的化合物為β-芳樟醇和雪松醇,氣味強(qiáng)度分別為8.63和8.38,其次為香葉醇(OI=7.37)、苯乙醇(OI=7.09)、橙花醇(OI=6.54)和1-辛烯-3-醇(OI=6.24)。β-芳樟醇呈現(xiàn)令人愉悅的“花香”氣味,不僅被鑒定是各類茶葉特征香氣形成的關(guān)鍵化合物,也被鑒定是花卉和香料植物特征香氣形成的關(guān)鍵化合物[18-19];雪松醇呈現(xiàn)“木質(zhì)”氣味,曾被鑒定是普洱茶特征香氣形成的主要香氣化合物,在六堡茶中也具有較高的含量,被認(rèn)為是六堡茶特征香氣形成的關(guān)鍵化合物[11,20]。香葉醇、苯乙醇和橙花醇呈現(xiàn)令人愉悅的“花香”氣味,曾被鑒定對(duì)紅茶和普洱曬紅茶特征香氣的形成起關(guān)鍵作用[21-22]。1-辛烯-3-醇呈現(xiàn)“蘑菇”氣味,該物質(zhì)來(lái)源于亞油酸的氧化降解,被鑒定是蘑菇風(fēng)味形成的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[23],該物質(zhì)也被鑒定是普洱茶特征香氣形成的主要香氣物質(zhì)[24]。甲氧基苯類化合物氣味強(qiáng)度較高的為1,2,3-三甲氧基苯(OI=8.07),其次為4-乙基-1,2-二甲氧基苯(OI=6.19)、1,2,3,4-四甲氧基苯(OI=6.17)、3,4-二甲氧基甲苯(OI=5.09)和1,2,4-三甲氧基苯(OI=5.05)。甲氧基苯類化合物呈現(xiàn)特殊的“陳香”氣味,被認(rèn)為是在發(fā)酵過(guò)程中微生物降解和甲基化兒茶素形成的一類物質(zhì),同時(shí)在茶葉堆積發(fā)酵中的熱降解也有助于甲氧基苯類化合物的形成,這類化合物是六堡茶、普洱茶等后發(fā)酵茶類特征風(fēng)味形成的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[13,25]。醛類化合物氣味強(qiáng)度相對(duì)較高的化合物為(E,Z)-2,6-壬二烯醛(OI=6.83)和癸醛(OI=6.42)。(E,Z)-2,6-壬二烯醛呈現(xiàn)“黃瓜”氣味,曾被鑒定存在于普洱茶和紅茶中[26-27];癸醛呈現(xiàn)“脂肪”和“柑橘”的氣味,曾被鑒定是普洱茶的香氣化合物之一[28]。

表1 六堡茶氣味化合物GC-O分析結(jié)果Table 1 The results of odor compounds in Liupao tea by GC-O analysis

2.2 檳榔香六堡茶香氣物質(zhì)定量分析和OAV計(jì)算

通過(guò)GC-O分析,確定了檳榔香六堡茶中呈現(xiàn)氣味的化合物,為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)氣味化合物對(duì)檳榔香六堡茶整體香氣形成的貢獻(xiàn)度,對(duì)每種氣味化合物進(jìn)行定量分析,定量結(jié)果如表2所示。檳榔香六堡茶中含量較高的化合物為β-紫羅蘭酮(84 996.78 μg/kg)、二氫-β-紫羅蘭酮(54 637.50 μg/kg)、苯乙醇(13 582.16 μg/kg)、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮(6 872.67 μg/kg)、β-芳樟醇(4 424.37 μg/kg)、1,2,3-三甲氧基苯(1 931.23 μg/kg)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(726.83 μg/kg)、香葉醇(578.05 μg/kg)、癸醛(487.47 μg/kg)、4-乙基-1,2-二甲氧基苯(409.14 μg/kg)、1,2,3,4-四甲氧基苯(291.87 μg/kg)、3,4-二甲氧基甲苯(276.10 μg/kg)、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯(214.86 μg/kg)、(E)-2-壬烯醛(193.40 μg/kg)、α-紫羅蘭酮(193.29 μg/kg)、雪松醇(165.83 μg/kg)、橙花醇(103.81 μg/kg)和1,2-二甲氧基苯(101.69 μg/kg)。

表2 六堡茶香氣物質(zhì)定量分析和OAV計(jì)算結(jié)果Table 2 The results of quantitative analysis and OAVs calculation of aroma-active compounds in Liupao tea

目前食品領(lǐng)域中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)萬(wàn)余種氣味成分,然而僅有一小部分會(huì)對(duì)食品整體香氣的形成起著關(guān)鍵決定作用,這一部分氣味成分稱為關(guān)鍵香氣成分[29]。風(fēng)味化學(xué)研究者認(rèn)為,OAV≥1的氣味化合物通常被認(rèn)為對(duì)分析樣品整體香氣的構(gòu)成其貢獻(xiàn)作用,OAV<1的氣味化合物被認(rèn)為對(duì)分析樣品整體香氣的形成無(wú)貢獻(xiàn)作用或起較小的貢獻(xiàn)作用[30-31]。可見(jiàn),氣味化合物含量的高低并不能完全代表其對(duì)六堡茶檳榔香貢獻(xiàn)度的大小,需要結(jié)合GC-O-MS鑒定結(jié)果和OAV作進(jìn)一步判斷。為了進(jìn)一步篩選對(duì)檳榔香六堡茶整體香氣形成起主要貢獻(xiàn)作用的氣味化合物,在氣味化合物定量的基礎(chǔ)上,結(jié)合已報(bào)道氣味化合物在水溶液中的閾值計(jì)算OAV,結(jié)果見(jiàn)表2。

為準(zhǔn)確研究六堡茶檳榔香的特點(diǎn),以O(shè)AV≥1為標(biāo)準(zhǔn)共篩選出18種關(guān)鍵氣味物質(zhì),分別為:1-辛烯-3-醇、(E)-2-壬烯醛、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、癸醛、壬醛、β-芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、雪松醇、二氫-β-紫羅蘭酮、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮、3,4-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯及1,2,3,4-四甲氧基苯,這些化合物對(duì)檳榔香六堡茶整體風(fēng)味的形成起關(guān)鍵作用。其中,β-芳樟醇、苯乙醇、橙花醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮和α-紫羅蘭酮貢獻(xiàn)了花香;(E,Z)-2,6-壬二烯醛具有類似黃瓜的氣味,貢獻(xiàn)了清香;壬醛和癸醛貢獻(xiàn)了脂香;1-辛烯-3-醇和(E)-2-壬烯醛貢獻(xiàn)了青草香;雪松醇、二氫-β-紫羅蘭酮和脫氫二氫-β-紫羅蘭酮貢獻(xiàn)了木香;3,4-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯和1,2,3,4-四甲氧基苯貢獻(xiàn)了陳香。其中,二氫-β-紫羅蘭酮(OAV=1 092 750)、β-紫羅蘭酮(OAV=242 847.94)、苯乙醇(OAV=18 109.55)、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮(OAV=1 527.26)、(E,Z)-2,6-壬二烯醛(OAV=484.55)、β-芳樟醇(OAV=221.22)、癸醛(OAV=97.49)和1,2,3-三甲氧基苯(OAV=51.49)的OAV≥50,特別是二氫-β-紫羅蘭酮(0.001 μg/L)、β-紫羅蘭酮(0.007 μg/L)和苯乙醇(0.015 μg/L)有極低的閾值,OAV顯著高于其他氣味化合物,這些氣味化合物對(duì)于六堡茶檳榔香的形成具有重要的貢獻(xiàn)作用。六堡茶良好的倉(cāng)儲(chǔ)環(huán)境對(duì)這些關(guān)鍵香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、協(xié)調(diào)比例的形成及檳榔香的呈現(xiàn)起著決定性的作用[32]。通過(guò)對(duì)比OAV結(jié)果和GC-O分析結(jié)果,癸醛和(E)-2-壬烯醛具有較大的OAV,但GC-O分析香氣強(qiáng)度均小于5,這可能是物質(zhì)間的相互作用導(dǎo)致。總體來(lái)說(shuō),2種方法所篩選檳榔香六堡茶關(guān)鍵香氣物質(zhì)的分析結(jié)果基本保持一致。

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME結(jié)合GC-O-MS和OAV對(duì)檳榔香六堡茶香氣物質(zhì)進(jìn)行分析和關(guān)鍵香氣物質(zhì)篩選。經(jīng)GC-O分析,從檳榔香六堡茶共嗅聞、鑒定出37種呈現(xiàn)氣味的化合物,其中氣味強(qiáng)度中等以上的化合物為19種,主要為酮類、醇類、甲氧基苯類和醛類,其中香氣強(qiáng)度較高的化合物為二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、β-芳樟醇、雪松醇和1,2,3-三甲氧基苯。在GC-O分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合氣味化合物定量結(jié)合和氣味化合物閾值計(jì)算化合物OAV,檳榔香六堡茶中OAV≥1的氣味化合物有18種,其中二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯乙醇、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、癸醛、β-芳樟醇和1,2,3-三甲氧基苯的OAV≥50,可以說(shuō)明這些物質(zhì)對(duì)檳榔香六堡茶整體香氣形成貢獻(xiàn)度較大。對(duì)比GC-O分析和OAV計(jì)算結(jié)果,2種方法所篩選檳榔香六堡茶關(guān)鍵香氣物質(zhì)的分析結(jié)果基本一致,該研究結(jié)果對(duì)于六堡茶陳化過(guò)程中“檳榔香”的形成提供理論依據(jù)以及對(duì)于定向加工“檳榔香”六堡茶具有指導(dǎo)意義。

然而,通過(guò)GC-O-MS分析和OAV計(jì)算仍然無(wú)法準(zhǔn)確解析檳榔香六堡茶中的關(guān)鍵香氣成分,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需要通過(guò)香氣重組及遺漏實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行關(guān)鍵香氣成分的驗(yàn)證分析。此外,在2種分析方法中關(guān)鍵香氣物質(zhì)存在一定的差異,這可能與化合物較高的閾值以及香氣化合物之間的相互作用等因素有關(guān)。值得注意的是,單個(gè)氣味化合物對(duì)檳榔香六堡茶香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)不僅取決于其在茶葉中的含量,基質(zhì)成分也會(huì)影響氣味化合物的釋放。因此,在后續(xù)研究中,還需要進(jìn)一步針對(duì)基質(zhì)成分、低OAV化合物對(duì)檳榔香六堡茶香氣品質(zhì)的影響展開(kāi)相關(guān)研究。