裂解多糖單加氧酶的研究進(jìn)展

陳凌宇,李志建,刁文濤,王佰濤,劉德海

1(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州,450001)

2(河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司,河南 鄭州,450008)

3(河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450008)

多糖類天然產(chǎn)物是自然界中一類重要的生物資源,在生命發(fā)展的過(guò)程中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。木質(zhì)纖維素作為多糖類天然產(chǎn)物的重要組成部分,主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成,其在自然界大量存在,也是植物細(xì)胞壁的主要組成部分。在全球能源以及資源緊張的情況下,木質(zhì)纖維素作為可再生資源越來(lái)越受到人們的重視,開(kāi)發(fā)利用木質(zhì)纖維素在降低資源浪費(fèi)的同時(shí)還能減少環(huán)境污染。

目前,針對(duì)木質(zhì)纖維素存在2種降解方式,一種是化學(xué)水解,另一種是利用酶制劑進(jìn)行高效酶解[1]。相對(duì)于化學(xué)方法,酶催化水解具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì),成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。通過(guò)微生物代謝的糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)對(duì)木質(zhì)纖維進(jìn)行降解,是一種高效的生物質(zhì)資源化方法[2]。但是,植物細(xì)胞壁內(nèi)的纖維素大多為高強(qiáng)度、高密度結(jié)晶態(tài),構(gòu)成了一道天然的“防降解壁壘”,阻止了糖苷水解酶對(duì)多糖鏈結(jié)晶區(qū)的可及性,限制了其高效降解[3]。同時(shí), GH活性低,不耐高溫,不耐酸堿,或有抑制劑干擾,限制了其大規(guī)模應(yīng)用。因此如何高效降解結(jié)晶區(qū)成為人們的研究動(dòng)力。近年來(lái),裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)的發(fā)現(xiàn)完全顛覆了對(duì)酶解法降解結(jié)晶多糖的認(rèn)知[4]。LPMO是一類銅離子依賴性氧化酶,它可以通過(guò)氧化作用切斷多糖類中的糖苷鍵,從而使難于降解的生物質(zhì)發(fā)生解聚并暴露出更多與GH結(jié)合的位點(diǎn),從而加快纖維素和幾丁質(zhì)的水解[5]。

1 裂解多糖單加氧酶的發(fā)現(xiàn)

最初人們從粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中發(fā)現(xiàn)一種分子質(zhì)量很小的碳水化合物結(jié)合模塊33家族(carbohydrate-binding module family 33,CBM33)蛋白,該蛋白與甲殼素有強(qiáng)烈的結(jié)合作用,命名為甲殼素結(jié)合蛋白(chitin binding protein,CBP21)[6]。隨后的研究表明CBP21可以在有氧和電子供體條件下,氧化裂解幾丁質(zhì)多糖,并且發(fā)現(xiàn)酶活性可能與二價(jià)銅離子有很強(qiáng)的相關(guān)性,因其內(nèi)切葡聚糖酶活性被歸入GH61家族[7]。并且研究發(fā)現(xiàn)在太瑞斯梭殼孢霉(Thielaviaterrestris)發(fā)酵液中加入等量的瑞氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶,可有效地增加纖維素的降解,顯著增加了糖分的轉(zhuǎn)化率。在此基礎(chǔ)上,太瑞斯梭殼孢霉菌和瑞氏木霉細(xì)胞外纖維素酶系差異分析結(jié)果顯示,篩選到3種與糖類代謝有關(guān)的胞外酶,即GH61B、GH61E、GH61G。這類化合物雖不是GH61家族成員,卻能明顯增強(qiáng)預(yù)處理后的玉米秸稈中纖維素酶的活性[8]。2011 年,這種具有銅離子依賴性并且能夠氧化斷裂纖維素中的糖苷鍵的酶被命名為 LPMO,其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物質(zhì)的解聚,將底物的作用位點(diǎn)完全暴露,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素的高效降解。

2 裂解多糖單加氧酶的分類與來(lái)源

最初根據(jù)氨基酸序列的相似性,將 LPMO分為CBM33和GH61家族兩大類[9]。由于LPMO的氧化作用可以促進(jìn)糖苷鍵的斷裂,增加了底物和GH結(jié)合位點(diǎn)的親和力,加快了其降解效率。2013年,LPMO被歸于碳水化合物活性酶(carbonhydrate-activity enzymes database,CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)中的輔助活性(auxiliary activity family,AA)家族。如今,由CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息和對(duì)LMPO中氨基酸序列與功能之間的分析將LPMO分為8個(gè)家族,分別為AA9-11、AA13-17輔助活性家族。它們的來(lái)源及底物如表1所示,其中GH61和CBM33分別屬于AA9和AA10家族。

表1 LPMO的分類、來(lái)源和底物Table 1 The classification, sources, and substrates of LPMO

LPMO主要分布在細(xì)菌和真菌中[12]。AA9家族來(lái)源于真菌,主要降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素。AA10家族是LPMO中最大的家族,最早發(fā)現(xiàn)馬氏沙雷氏菌中,其大多來(lái)自于細(xì)菌也有少量來(lái)自于真菌、古生菌,降解底物為纖維素和幾丁質(zhì)。

真菌來(lái)源的AA11、AA13、AA14家族LPMO對(duì)多糖底物均有降解。細(xì)菌來(lái)源的AA11家族對(duì)幾丁質(zhì)有降解作用,AA13家族的LPMO能在C1位點(diǎn)切斷淀粉骨架鍵釋放寡糖從而起到對(duì)淀粉的降解作用,AA14家族則可降解木質(zhì)素。最初, LPMO僅存在于微生物中,在小魚(yú)中AA15LPMO的新發(fā)現(xiàn)引發(fā)了人們對(duì)動(dòng)物 LPMO的關(guān)注[13]。AA15家族LPMO主要來(lái)源于真菌、動(dòng)物、植物等真核生物對(duì)蝦殼中的幾丁質(zhì)也有降解作用[14]。AA16家族LPMO來(lái)源于真菌和部分卵菌中,對(duì)纖維素有活性的同時(shí)也能協(xié)同纖維素酶共同降解纖維素[15]。AA17家族LPMO是目前唯一存在于真菌中具有果膠酶活性的LPMO家族[16]。

3 裂解多糖單加氧酶的結(jié)構(gòu)和功能

3.1 裂解多糖單加氧酶的結(jié)構(gòu)

迄今,已知的LPMO均為β-三明治折疊和組氨酸支架構(gòu)成的高度保守平面結(jié)構(gòu)[17-19]。以來(lái)源于嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的LPMO(TaLPMO)結(jié)構(gòu)為例(圖1),β-三明治折疊,由 8～10個(gè)反向平行的β-折疊通過(guò)α-螺旋相互連接組成;LPMO的活性中心(圖1)包括2個(gè)保守的組氨酸(His),以及一個(gè)酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe),其分支可以將銅離子固定在其上[20]。除了AA14家族,其他LPMO的結(jié)構(gòu)中均含有銅離子的活性中心。此外,其他的組氨酸骨架在軸位上為酪氨酸(Tyr),而在AA10上為苯丙氨酸(Phe),是其重要的底物結(jié)合位點(diǎn)[21]。

圖1 TaLPMO三維結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)[17]

目前所知的 LPMO一般是一種具有除催化域之外的多個(gè)區(qū)域的酶,除此之外,還具有CBM。在源于粉紅面包霉菌(Neurosporacrassa)體內(nèi)的LPMO(NaLPMO)中就有天然形式的CBM[22],同時(shí)LPMO的催化結(jié)構(gòu)域可以與CBM組合從而影響活性。這種模式下不僅可以讓酶與底物結(jié)合得更好,也使底物的多樣性得到極大地加強(qiáng)。

3.2 裂解多糖單加氧酶的催化機(jī)制

LPMO在氧分子和電子供體同時(shí)存在時(shí),通過(guò)氧化的方式斷裂多聚糖主鏈的 β-1,4 糖苷鍵產(chǎn)生寡糖,電子供體大多為酶類還原劑。后來(lái)的研究表明該過(guò)程要有銅離子的參與,催化過(guò)程中LPMO在氧和銅原子存在條件下生成LPMO-Cu2+復(fù)合物,電子供體產(chǎn)生的電子將其轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)PMO-Cu+復(fù)合物。該復(fù)合物得到氧分子中的電子產(chǎn)生銅離子過(guò)氧化物中間體,有多余電子情況下氧化多糖內(nèi)C1或C4位的碳原子生成羥基化多糖并產(chǎn)生水[23-25]。還有一種觀點(diǎn)認(rèn)為L(zhǎng)PMO在電子和H2O2存在下產(chǎn)生LPMO-Cu2+羥基復(fù)合物,從而達(dá)到氧化多糖的作用。LPMO作用機(jī)制(圖2)不同于糖苷水解酶,兩者協(xié)同作用可以提高對(duì)木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率,首先LPMO在電子供體和銅離子條件下,切斷纖維素結(jié)晶區(qū)之間的糖苷鍵,使其出現(xiàn)更多GH的作用位點(diǎn)而增加對(duì)纖維素的降解速度。

圖2 LPMO的催化機(jī)制[29]

LPMO根據(jù)氧化位點(diǎn)的不同可以分為三類(圖3)。第一類只對(duì)多糖的C1位進(jìn)行氧化,產(chǎn)生醛糖酸,第二類僅對(duì)多糖的C4位進(jìn)行氧化,產(chǎn)生C4酮醛糖,最后一類作用C1和C4產(chǎn)生醛糖酸和C4酮醛糖[26-27]。LPMO共底物是O2還是H2O2一直是一個(gè)在討論的話題,現(xiàn)在較多的實(shí)驗(yàn)表明H2O2作為共底物的酶活性較高[28]。

圖3 LPMO反應(yīng)途徑

3.3 裂解多糖單加氧酶的功能

杜文珍等[30]對(duì)絲狀真菌(Podosporaanserina)中AA11家族的5個(gè)LPMO 基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除的實(shí)驗(yàn)中,5個(gè)基因同時(shí)被敲除后,菌株對(duì)碳源的吸收能力明顯降低、生長(zhǎng)速度下降、孢子萌發(fā)速率降低,子實(shí)體數(shù)量減少、部分子實(shí)體發(fā)育不良、壽命縮短以及纖維素降解能力降低。由此表明菌株中的AA11家族基因影響著其生長(zhǎng)、生殖、衰老和纖維素降解方面。來(lái)源于蟬棒束孢菌(Isariacicadae)突變體基因IcFBR1其包含糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, GPI-AP)同系物的LPMO。敲除IcFBR1后,孢梗維管束不再出現(xiàn),菌落氣生菌絲發(fā)育和產(chǎn)孢均不正常。菌體中的多糖含量明顯減少,同時(shí)還伴隨著淀粉酶、蛋白酶活力的降低。其在調(diào)控蟬花梗束發(fā)育、次生物質(zhì)代謝以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[31]。

此外,LPMO在動(dòng)物植體內(nèi)也發(fā)揮著重要作用。如黑腹果蠅不同的發(fā)展階段中LPMO中有著高水平的表達(dá),同時(shí)基因發(fā)生改變之后對(duì)其致死率有著影響[32]。MoAa91(AA9家族的LPMO)是水稻瘟疫病菌中一個(gè)具有誘導(dǎo)黏附作用的蛋白,其敲除會(huì)導(dǎo)致黏附能力下降,從而阻礙了水稻的侵染[33]。昆蟲(chóng)以植物為主要食料,其消化道內(nèi)的酶類及其與共生菌共同完成對(duì)植物的高效消化。家蠶無(wú)腸道菌群,因此,來(lái)自家蠶中腸區(qū)的 LPMO(AA15)在其中扮演了重要角色[12]。

4 裂解多糖單加氧酶活性測(cè)定方法

LPMO的活性測(cè)定影響因素較多。一方面氧化產(chǎn)物多為不溶解性底物,另一方面由于直接作用于底物效率較低。由于LPMO與O2和電子供體(如抗壞血酸)存在的條件下形成H2O2,基于此通過(guò)分析H2O2來(lái)表示酶活性的測(cè)定方法有2,6-二甲基苯酚比色法和Amplex Red辣根過(guò)氧化物酶法。通常也可用協(xié)同活性來(lái)表示表示LPMO的活性,二硝基水楊酸法(3,5-dinitro-2-hydroxybenzoic acid, DNS)便是一種比較普遍的方法。

4.1 二硝基水楊酸法(DNS法)

二硝基水楊酸法是以二硝基水楊酸和還原糖在堿性環(huán)境中的氧化-還原反應(yīng)為基礎(chǔ),以540 nm波長(zhǎng)下的吸光值為指標(biāo),對(duì)還原糖的含量進(jìn)行了測(cè)定。將 LPMO和GH對(duì)纖維素底物進(jìn)行協(xié)同作用,將其與 DNS試劑進(jìn)行混合之后,再進(jìn)行加熱顯色,并記錄還原糖的 OD540吸光值,通過(guò)將單獨(dú)測(cè)活和協(xié)同測(cè)活以產(chǎn)物的提高量進(jìn)行比較,來(lái)判斷 LPMO的活性[34]。此法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,但其靈敏度不高,僅能對(duì)還原性糖類進(jìn)行測(cè)定,而對(duì)某些非還原性糖類物質(zhì)則不能進(jìn)行測(cè)定。此法用于研究LPMO與其他酶的協(xié)同作用,但是只能對(duì)樣品中的單糖進(jìn)行定量分析。

4.2 2,6-二甲基苯酚比色法(2,6-dimethoxyphenol,2,6-DMP法)

研究表明[35]2分子2,6-DMP和1分子H2O2在LPMO酶的作用下產(chǎn)生2分子2,6-DMP自由基在不穩(wěn)定的條件下自發(fā)二聚產(chǎn)生1分子氫化木醋醌然后與1分子H2O2在LPMO下產(chǎn)生黃色顯色產(chǎn)物木醋醌,由木醋醌在469 nm波段具有特征吸收峰即可表現(xiàn)出LPMO活性(圖4)。這種方法快速、簡(jiǎn)單能對(duì)濃度0.5～50 mg/L的LPMO進(jìn)行活性測(cè)量,已用于測(cè)定纖維素和甲殼素中LPMO的活性,但是該方法在酸性條件下靈敏度較差。氫化木醋醌是比2,6-DMP更好的底物,表觀 KM 值低約 30 倍,氧化電位低 160 mV。底物被氫化木醋醌代替之后酶活性顯著提高且在酸性pH 值為4～8時(shí)也能夠檢測(cè)到,得到了更穩(wěn)定的檢測(cè)條件和更高的靈敏度[36]。毛相朝等[37]用該方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)純化后EbLPMO10A的酶活性,達(dá)到了356.36 U/g,同時(shí)測(cè)得該酶的最適溫度與pH值分別為60 ℃和7。

圖4 2,6-DMP法測(cè)LPMO酶活性原理

4.3 Amplex Red辣根過(guò)氧化物酶法

Amplex Red是一種很好的過(guò)氧化物酶底物,在檢測(cè)H2O2中具有很高的靈敏度和穩(wěn)定性。在過(guò)氧化物酶催化下,Amplex Red試劑與H2O2按1∶1的定量比例發(fā)生反應(yīng),生成具有紅色熒光的氧化產(chǎn)物試鹵靈對(duì)其進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定,間接表示LPMO活性。這一方法是以測(cè)定H2O2的產(chǎn)量來(lái)表征 LPMOs的活力。方法靈敏度很高且操作方便快捷在測(cè)定LPMO活性方面有著廣泛的應(yīng)用[38]。用 Amplex Red辣根試劑盒測(cè)定 LPMO活性,結(jié)果表明[39],H2O2的濃度在0.25～5 μmol/L和5 μmol/L辣根過(guò)氧化物酶的條件下,構(gòu)建H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線且相關(guān)性很好(R2=0.99)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)[35]測(cè)定LPMO為20～574 mg/L時(shí)有著比較準(zhǔn)確的結(jié)果,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若存在游離態(tài)銅離子會(huì)對(duì)于結(jié)果造成影響[40]。

5 裂解多糖單加氧酶的克隆與表達(dá)

LPMO資源豐富,但其生產(chǎn)效率低、分離困難。為進(jìn)一步提高 LPMO的產(chǎn)量,促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化,通過(guò)在其他寄主中進(jìn)行異源表達(dá),是一條行之有效的途徑。由于AA9基因來(lái)源于真菌,畢赤酵母是應(yīng)用最為廣泛的一種真核表達(dá)體系,由于其基因操縱技術(shù)的成熟,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于異源表達(dá)AA9[41]。除畢赤酵母外,已有部分AA9基因在其他真菌的表達(dá)載體上進(jìn)行了改造,但仍面臨著轉(zhuǎn)化困難、操作難度大等問(wèn)題。

為進(jìn)一步提高AA9的產(chǎn)量,通過(guò)在真菌表達(dá)宿主中構(gòu)建了一系列的信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)AA9的高效表達(dá),表達(dá)載體為畢赤酵母最常見(jiàn)的信號(hào)肽是α-因子信號(hào)肽和AA9 的原生信號(hào)肽。LADEVZE等[42]在畢赤酵母中使用2種信號(hào)肽表達(dá)3種蛋白,結(jié)果表明由原始信號(hào)肽分泌的LPMO含有更多正確的N端His以及3種采用原生信號(hào)肽的酶的比活均大于α-因子信號(hào)肽。來(lái)自紅側(cè)耳Pleurotusdjamor的PdLPMO,通過(guò)添加組氨酸標(biāo)簽、基因密碼子優(yōu)化、增加基因劑量以及聯(lián)合共表達(dá)分子伴侶蛋白等方法,使構(gòu)建菌株蛋白含量與酶活性提高75%和66.92%[43]。AA10大部分來(lái)源于細(xì)菌,目前主要是在芽孢桿菌和大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。有些AA10利用它們自身的信號(hào)肽表達(dá),有些則利用其他蛋白的信號(hào)肽,AA10對(duì)不同信號(hào)肽的作用效果存在差異。在對(duì)比不同AA10 的信號(hào)肽中,SmAA10A的信號(hào)肽相比其他蛋白的信號(hào)肽有著更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),還能實(shí)現(xiàn)多種蛋白的高效表達(dá)[44]。徐倩倩[45]在構(gòu)建 CsLPMO的異源表達(dá)過(guò)程中,得出pET-22b為最優(yōu)的表達(dá)質(zhì)粒,后續(xù)對(duì)其菌株表達(dá)條件優(yōu)化后可溶性蛋白含量與酶活性分別提高 32.1%和45.2%。

LPMO家族的異源表達(dá),主要表達(dá)宿主為大腸桿菌和畢赤酵母。從真菌中分離得到的AA9在畢赤酵母中比大腸桿菌更容易得到高產(chǎn)。與此相反,AA10主要來(lái)自于細(xì)菌,在大腸桿菌中表達(dá)較好。

6 裂解多糖單加氧酶的應(yīng)用

6.1 功能性食品

功能食品作為一種具有保健、防治疾病等功效的食品,近年來(lái)日益受到人們的重視。低聚果糖、低聚半乳糖等低聚糖作為益生元添加到食品中開(kāi)發(fā)成功能性食品,不僅可以改善產(chǎn)品口感,而且具有調(diào)控腸道菌群和腸道微生態(tài)的潛力。LPMO與GH協(xié)同,可實(shí)現(xiàn)低聚糖的高效合成,在功能性食品領(lǐng)域極具潛力為人類健康提供新的思路。周頔等[46]觀察低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖4種低聚糖類益生元分別代替蔗糖對(duì)煉乳品質(zhì)影響過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)糖替代比15%的低聚異麥芽糖煉乳在滿足甜味的同時(shí),又實(shí)現(xiàn)了減糖的目的,并且益生元的加入使其具有更多的功能性。在酸奶制作中添加乳果糖、菊粉作為益生元能夠減少貯存過(guò)程中活菌數(shù)的下降提升酸奶的品質(zhì),同時(shí)有效促進(jìn)嗜熱乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌的增殖,從而改善腸道健康[47]。姜雅杰等[48]開(kāi)發(fā)的功能性殼寡糖復(fù)合固體飲料能夠改善糖尿病小鼠的腸道微生物群落結(jié)構(gòu),促進(jìn)益生菌的增殖,減少病原菌,改善腸道健康,同時(shí)還能幫助小鼠降脂和穩(wěn)定血糖。燕麥奶含有豐富的益生元低聚果糖,攝入后可提高腸道內(nèi)短鏈脂肪酸(丁酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽)的生成,降低腸道 pH、氮終產(chǎn)物和糞便酶的量,并提高機(jī)體免疫力,促進(jìn)骨生長(zhǎng)[49]。

6.2 飼料添加劑

抗生素在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用,不僅可以預(yù)防動(dòng)物疾病,提高動(dòng)物的健康水平,而且可以提高飼料利用率,還可以提高肉、蛋、奶的產(chǎn)量,大大推動(dòng)了我國(guó)畜牧業(yè)的迅速發(fā)展。與此同時(shí),也引發(fā)了許多新的問(wèn)題,比如在飼料中加入抗生素,所帶來(lái)的藥物殘留危害非常明顯,因?yàn)榭股氐拈L(zhǎng)期使用,會(huì)使致病菌的抗藥性變得更強(qiáng),從而形成具有耐藥性的超級(jí)細(xì)菌。與此同時(shí),還會(huì)對(duì)周圍的環(huán)境造成污染,進(jìn)而對(duì)人體的健康造成威脅,同時(shí)2020年起全面禁止使用抗生素,人們開(kāi)始尋找安全、有效的無(wú)抗飼料[50]。隨著人們的生活水平的不斷提升,食品安全問(wèn)題受到了越來(lái)越多的重視,眾多益生菌、酶制劑如LMPO等添加到飼料中應(yīng)運(yùn)而生[51]。

非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)是除淀粉外的一種多糖,其在飼料中具有顯著的抗?fàn)I養(yǎng)作用,其在水中溶解后具有較高的黏度。然而,傳統(tǒng)飼料配料中含有的非淀粉多糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子及有毒物質(zhì),使其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著降低,限制了其在生豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)[52-53],添加非淀粉多糖復(fù)合酶能顯著地提高了豬對(duì)飼料的吸收利用能力,并使其達(dá)到了較好的增重效果,同時(shí)也使總能量的表觀消化率得到了很大的提高。因此,在飼料中添加 LPMO及非淀粉多糖酶,可有效地降解NSP,解除NSP的抗?fàn)I養(yǎng)作用[54]。同時(shí)還可產(chǎn)生功能寡糖類和其他有益物質(zhì),纖維寡糖作為纖維素的主要產(chǎn)物,聚合度為2～6的可溶性纖維寡糖可以促進(jìn)雙歧桿菌(Bifidobacteria)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacei)等腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)繁殖,不僅增強(qiáng)人體抵抗力,還改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道發(fā)育以及使食糜黏度下降從而降低畜禽胃腸疾病的發(fā)生,可作為優(yōu)良的家畜飼料促進(jìn)畜禽的健康生長(zhǎng)[55]。

6.3 生物能源

以木質(zhì)纖維為原料的生物質(zhì)資源是繼煤炭、石油、天然氣之后的一種新的可再生能源,是緩解人類日益嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題的重要途徑。木質(zhì)纖維素經(jīng)降解發(fā)酵可轉(zhuǎn)化為生物酒精,該過(guò)程分為2個(gè)步驟:首先將纖維素分解成單糖,再將單糖進(jìn)行發(fā)酵,而這一過(guò)程的核心是降解為單糖階段。因此,開(kāi)發(fā)廉價(jià)高效的木質(zhì)纖維素降解酶,為其高效轉(zhuǎn)化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持具有重要意義。R17LPMO和纖維素酶的協(xié)同作用對(duì)經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理過(guò)的玉米秸稈降解效果顯著提高,數(shù)據(jù)表示200 ℃預(yù)處理玉米秸稈3 min效果最好[56]。同樣的幾丁質(zhì)在生物能源方面的利用和木質(zhì)纖維素有著相同的處境,自然界中存在量大但是降解為人們所能利用是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題。研究表明具有幾丁質(zhì)降解能力菌株(Chitiniphilussp. LY72)的裂解多糖單加氧酶(CsLPMO)和幾丁質(zhì)水解酶之間有著協(xié)同的輔助性,可以有效地提高對(duì)固體幾丁質(zhì)的水解效率,而且CsLPMO用量越大,對(duì)幾丁質(zhì)降解的輔助性作用越顯著[57]。源于Natrialbaceaearchaeon中的NaLPMO10A作為甲殼素的C1氧化劑在溫度40 ℃、pH 9.0的條件下對(duì)幾丁質(zhì)的糖化效率達(dá)到最高,同時(shí)也可以在高濃度粒子的極端條件下提升糖化[58]。

7 結(jié)論和展望

生物質(zhì)是繼煤炭、石油和天然氣之后最重要的一種可再生能源,是解決全球氣候變化、環(huán)境污染和能源危機(jī)的重要途徑。在這些物質(zhì)中,木質(zhì)纖維素和幾丁質(zhì)的儲(chǔ)量都比較大,它們可以被用來(lái)轉(zhuǎn)換成綠色的生物燃料和高附加值的化工原料,其高值化和資源化對(duì)于維持地球碳循環(huán)以及生物煉制行業(yè)的發(fā)展都有著非常重要的意義。LPMO可通過(guò)氧化性斷裂破壞纖維素晶體結(jié)構(gòu),增加糖苷水解酶的結(jié)合位點(diǎn),是實(shí)現(xiàn)纖維素高效酶解的關(guān)鍵,是一種很有發(fā)展前景的纖維素降解酶。LPMO的發(fā)現(xiàn)也讓人們對(duì)降解結(jié)晶多糖有了新的認(rèn)識(shí),通過(guò)其與GH協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)功能性低聚糖的合成,為功能性食品的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供幫助。并且在飼料中添加LPMO和相關(guān)酶制劑可以降低非淀粉多糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子帶來(lái)的不利影響,保障畜禽的健康生長(zhǎng)。雖然LPMO在降解木質(zhì)纖維素和幾丁質(zhì)等多糖中表現(xiàn)出較好的效果,但是在工業(yè)上產(chǎn)量、高活力以及穩(wěn)定性等方面還存在不少的挑戰(zhàn),相信在不久的將來(lái)可以解決這個(gè)問(wèn)題,進(jìn)一步推動(dòng)其在功能性食品、飼料添加劑及生物燃料等方面的應(yīng)用。