自制增高籠具結合雙后肢大鼠建立椎間盤退變動物模型的影像學及形態學研究

李德芳 蔣理想 復旦大學附屬金山醫院 （上海 201508）

內容提要： 目的：探索自制籠具建立雙后肢大鼠椎間盤退變動物模型的影像學和形態學特點。方法：將新生幼鼠自肱骨上段用絲線結扎，然后截去雙前肢。用特制的可不斷加高籠飼養，改變其飼養條件，迫使大鼠只有依靠雙后肢站立才能進食和飲水的活習慣，以此訓練大鼠類似于人類直立活動。2周、4周、8周、24周攝腰椎側位片及磁共振成像檢查，測定椎間隙高度指數，按Pfirrmann分級。制作組織切片，HE染色后進行組織學評估。結果：造模2周X射線片顯示，腰椎生理彎曲正常，椎間隙未見明顯狹窄。隨著時間延長，24周時椎體邊緣變銳，終板軟骨下骨密度增加，部分出現骨贅。磁共振成像時椎間盤信號改變，嚴重者出現“黑椎間盤”。Pfirrmann分級明顯增加。組織學評分不斷升高。結論：特制增高籠具結合雙后肢大鼠可以建立椎間盤退變動物模型，使其更接近于人體自然退變，可用于椎間盤退變的研究。

椎間盤退行性變是引起腰部疼痛的重要病因，目前的治療措施無論保守治療還是手術治療都無法從病因上治療椎間盤退變，鑒于此學者們開始探索分子治療、基因治療或細胞治療等生物治療的方式，以期從源頭上解決退變椎間盤內髓核細胞數量減少和細胞外基質的合成減少的問題。這就需要合適的椎間盤退變動物模型來研究椎間盤退變的發生機制和檢測各種治療手段有效性，可靠的動物模型為深入研究椎間盤的發病機制及治療手段提供可靠的載體。目前，文獻中介紹的椎間盤退變動物模型多種多樣，大致可以分為直接結構損傷模型、機械間接應力模型、自發模型、基因敲除模型等，每一種模型引起退變的機制亦不相同，或急性損傷，或化學刺激或基因敲除等，都無法模擬人體自然退變的過程[1-6]。本研究中介紹了一種雙后肢大鼠模型結合自制增高籠具的造模方法，該方法通過模擬人類直立活動、進食，增加大鼠脊柱負重，增加退變，盡量模擬人類脊柱退變過程，為椎間盤退變的體內研究提供可靠模型。

1.材料與方法

1.1 一般材料

3月齡SD大鼠8只，約250～300g[斯貝福（北京）生物技術有限公司提供]；其中，雌鼠6只，雄鼠2只；自制增高籠具；外科手術器械等。

1.2 方法

1.2.1 雙后肢大鼠動物模型的建立

該動物實驗通過上海市公共衛生臨床中心審核通過。由雌雄鼠自由交配的方法獲取新生幼鼠40只，進行雙后肢大鼠模型建立，大致過程為：將幼鼠置提前置于4°C冰箱低溫處理，以收縮四肢血管，減少后續操作中出血。雙前肢碘伏消毒，自肱骨上段用絲線結扎，然后截去雙前肢，創面消毒按壓止血。雌鼠哺乳喂養至第3周，待建模鼠能自行進食后移走母鼠。密切觀察大鼠進食飲水時的高度，在以后的試驗中用特制的加高籠飼養，改變其飼養條件，迫使大鼠只有依靠雙后肢及尾部支撐站立才能進食和飲水的生活習慣，以此訓練大鼠類似于人類的直立活動，成功建立雙后肢大鼠模型20只，同時取同齡20只作為對照組。

1.2.2 特制籠具制作

測量實驗室用大鼠飼養籠具的長寬高，定制相等長寬的鋁合金增高框架，高度為3cm，隨著大鼠身高的增加，增加增高框的層數，每層間打孔，可用鋼絲固定。

1.3 觀察指標與判定標準

1.3.1 觀察大鼠進食、生活習性

觀察籠具增高后大鼠進食時大鼠能否正常進食。觀察大鼠能否利用雙后肢行走。

1.3.2 影像學檢測

X射線攝片測量椎間隙高度變化：兩組動物在2周、4周、8周、24周攝脊柱側位片，并做好標記，給動物做好編號。根據兩組不同編號名稱，在圖像存檔和傳輸系統中調出相應X射線片，運用系統測量功能，測量側位片上腰椎的椎間盤高度。為了減少因體位及大鼠生長快慢、體重等因素引起的誤差，檢測椎間盤相對高度：分別測量椎間盤前部、中間及后部3個位置的高度求取平均值，同樣旳方法，依次測量該椎間盤上下位兩椎體前、中、后3個位置的高度，取均值，兩者的比值即為椎間盤的相對高度（椎間盤高度指數）。

磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）檢查椎間盤退變程度分級：兩組動物在2周、4周、8周、24周攝脊柱MRI片，了解隨著時間推移造模組椎間盤信號改變。按照Pfirrmann分級對MRI影像進行分級，該分級系統根據MRI上椎間盤的結構，髓核與纖維環的邊界，椎間盤信號及椎間盤高度等4個方面的表現，將其分為5級，Ⅰ～V級退變程度不斷加重。

1.3.3 椎間盤組織學觀察

兩組動物在2周、4周、8周、24周進行影像學檢查后，取出脊柱，經固定，脫鈣后制作病理切片，HE染色。根據Masuda等描述的椎間盤組織學分級標準，對椎間盤形態進行觀察。該分級標準有4個觀察指標，分別為纖維環斷裂程度、纖維環和髓核邊界斷裂程度、髓核內細胞數量及細胞內液泡數量以及髓核內基質凝聚程度等，每個指標根據程度不同分為3分，評分范圍從正常椎間盤的4分到嚴重退變椎間盤的12分，從組織學評估造模的退變程度。

1.4 統計學分析

所得數據以±s表示，應用Stata 10.0統計軟件進行分析，檢驗標準P＜0.05具有統計學意義。非數值變量用Kruskal-Wallis（K-W）檢驗，組間兩兩比較用Bonferroni法。

2.結果

2.1 生活習性觀察

脫離母鼠后，兩組動物均能自行進食，飲水，在體型、外觀及毛發上沒有明顯差異。在籠中爬行時對照組大鼠利用四肢在墊料中行走，而雙后肢大鼠則主要依靠后肢，借助腰腹部肌肉力量，呈現上半身半直立狀態行走，步態稍蹣跚（圖1a）。另外還觀察到當把雙后肢鼠單獨放在籠中，其跳躍能力明顯增強。隨著身高增加，使用自制增高籠具后，雙后肢大鼠能夠直立進食飲水（圖1b）。

圖1.雙后肢大鼠結合自制增高籠具構建椎間盤退變動物模型（注：1a.雙后肢大鼠可依靠后肢及尾部支撐直立飲水；1b.自制增高籠具，根據動物身高不斷增高）

2.2 影像學檢查

2周時攝腰椎X射線片，兩組腰椎生理彎曲正常，椎間隙未見明顯狹窄及骨贅形成，上下終板未出現軟骨下骨硬化（圖2a、2b）；隨時間延長，椎間隙高度呈現逐漸下降趨勢，與對照組相比，雙后肢造模組可見椎體邊緣變銳，軟骨下骨4d硬化增生明顯，甚至在椎體前方形成骨橋（圖2c、2d）。

圖2.兩組動物腰椎X射線片（注：2a.2周時對照組X射線片；2b.2周時造模組X射線片；2c.24周時對照組X射線片；2d.24周時造模組X射線片）

2.3 椎間盤高度指數測量

結果發現隨著時間延長，椎間隙呈現逐漸下降趨勢；而每個時間點上，造模組的下降趨勢較對照組椎間盤高度指數下降更為明顯，特別在24周時下降趨勢有統計學差異，P＜0.05（見圖3）。說明該模型能模仿體內椎間盤退變時椎間隙狹窄的病理改變。

圖3.兩組動物X射線片測量椎間盤高度指數

2.4 MRI檢查

在造模早期MRI上可見椎間盤高度正常，信號較高呈白色或灰色，髓核的高信號與纖維環的低信號界限明確，隨著造模時間延長，MRI上可見到椎間隙狹窄，髓核呈現低信號，髓核與纖維環界限消失（見圖4）。Pfirrmann分級不斷升高，與對照組有統計學差異，P＜0.05。

圖4.兩組動物MRI圖像及Pfirrmann分級對比（注：4a.2周時對照組MRI圖像；4b.2周時造模組MRI圖像；4c.24周時對照組MRI圖像；4d.24周時造模組MRI圖像；4e.Pfirrmann分級統計圖）

2.5 組織學觀察

切片HE染色（見圖5）后結果示對照組髓核呈現膠凍狀，含水量較高，纖維環與髓核邊界清晰，未見纖維環斷裂。造模后期髓核出現明顯退變表現，髓核含水量較低，細胞明顯減少，細胞基質明顯聚集呈現棉絮狀，可見纖維環或終板斷裂處，組織學評分明顯升高，退變程度加重。

圖5.兩組動物椎間盤切片HE染色（注：5a.2周時對照組染色結果；5b.2周時造模組染色結果；5c.24周時對照組染色結果；5d.24周時造模組染色結果；5e.組織學評分統計圖）

3.討論

椎間盤退變的動物模型為體內研究椎間盤退變的機制及相關治療方法提供了合適的載體。文獻報道，理想的用于建立動物模型的動物需要滿足以下條件：①與人椎間盤退變過程具有相似性和可比性；②具有易操作性和經濟性；③具有可操作性和經濟性[7]。從動物模型量化制造到實施的過程至今已經走過了將近75年，近年來比較傾向于用狗、羊、豬等傳統動物制備動物模型。靈長類動物無論在進化方式或解剖結構方面來說均與人類最為相似，如恒河猴，是目前為止最理想的動物模型[8]。但它們數量少、價格昂貴、飼養困難，有些還受到相關國家法律的保護，難以廣泛用于科研活動。目前最常用的是大鼠模型，飼養方便、價格便宜、繁殖迅速，且其椎間盤解剖結構與人類椎間盤結構極為相似。

目前已成功建立的動物模型可以分為兩大類，一為誘導性退變，一為自發性椎間盤退變模型。后者的典型代表為沙鼠椎間盤退變動物模型，其退變過程與人類相似，同時較為迅速，但其種類有限，且研究認為其退變過程是遺傳因素決定的[9,10]。近期也有學者報道了與小鼠年齡相關的自發性椎間盤退變的研究，結果表明，14月齡小鼠出現輕度但明顯的椎間盤退變，退變程度進展緩慢，22月齡小鼠達到中度至重度。至少14個月的隨訪是評估自發性年齡相關性小鼠椎間盤退變的必要條件[11]。該方法雖然符合人類自然退變的進程，但造模周期過長，不便于研究。誘導性退變的方法主要為兩大類，第一類為改變椎間盤生物力學環境誘發退變，動力軸向加壓、切斷脊柱周圍軟組織，可模擬部分重體力勞動人群的退變過程，對于因積累性反復輕微損傷導致的椎間盤退變不太符合[12]；第二類為通過損傷椎間盤自身結構誘發退變，使用較多的為纖維環穿刺及軟骨終板穿刺[13-15]。

本研究中使用大鼠制作動物模型，通過出生時截去雙前肢，改變籠具高度和飼養條件，迫使其通過雙后肢直立行走及進食，模擬人類對抗引起退變的最主要因素重力作用建立模型，可以避免其他化學、機械損傷，易于操作，重復性高。與對照組自然退變比較發現，隨著時間推移造模組X射線片發現終板處軟骨下骨硬化明顯，椎間隙狹窄，椎體邊緣變尖，骨贅形成，甚至觀察到骨橋形成。在進行MRI檢查后發現，椎間盤含水量明顯下降，髓核信號明顯下降，與纖維環界限不清，甚至出現黑椎間盤征象。取材進行組織學分析后發現，此時髓核內細胞明顯減少，細胞內囊泡減少，本應該為膠凍狀的髓核因退變逐漸轉變成棉絮狀，纖維含量較高，纖維環膨出，斷裂，組織學評分明顯高于對照組。因此認為該模型能較好模擬人類椎間盤退變應用于試驗研究。

該模型可能存在不足之處，正如Mauro等[16]提到的動物和人類在細胞數量、組織組成、椎間盤和脊柱解剖、發育、生理和力學性能等方面存在許多差異。由于倫理和政府監管的限制，很難獲得用于此類研究的人體材料，因此經常使用動物組織、器官和體內模型。另一方面該模型出現椎間盤顯著退變的周期仍較長，導致實驗周期長，耗費的人力、經費較大。

綜上所述，特制增高籠具結合雙后肢大鼠可以建立椎間盤退變動物模型，使其更接近于人體自然退變，可用于椎間盤退變的研究。