蕓薹根腫菌遺傳多樣性分析

左丹丹 尚靜 黃云

摘要? ［目的］研究來自全國范圍內蕓薹根腫菌的遺傳多樣性，并探索ISSR分子標記與Williams生理小種鑒定結果之間的關系。［方法］對100條ISSR引物進行篩選，將篩選出的引物對48株根腫菌DNA進行擴增，根據擴增的多態性條帶建立根腫菌聚類分析圖，對根腫菌進行遺傳多樣性分析，并與Williams生理小種鑒定結果進行對比。［結果］100條ISSR引物中篩選出3條引物能擴增48株根腫菌DNA，獲得清晰條帶。ISSR聚類分析結果可將11號生理小種與其他生理小種區分開來，但不能以Williams生理小種鑒定結果標準將根腫菌完全區分開來，并且根腫菌的地理來源與其遺傳距離并無相關性。［結論］該研究為利用分子手段鑒別根腫菌生理小種的研究奠定了基礎。

關鍵詞? 蕓薹根腫菌；ISSR；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號? S432.4? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）09-0079-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Evaluation of Genetic Diversity of Plasmodiophora brassicae

ZUO Dan-dan1， SHANG Jing2， HUANG Yun2

（1.Meishan Pharmaceutical College， Meishan， Sichuan 620200;2.Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan 611130）

Abstract? ［Objective］To study the genetic diversity of Plasmodiophora brassicae and to explore the relationship between ISSR markers of Plasmodiophora brassicae and Williamsrace identification results. ［Method］100 ISSR primers were screened， and the selected primers were used to amplify the DNA of 48 P.brassicae from all over the country. Based on the amplified polymorphic bands， a cluster analysis chart was established to analyze the genetic diversity of P.brassicae and compare the results with Williamsrace identification.［Result］Three primers were screened out of 100 ISSR primers to amplify the DNA of 48 Plasmodiophora brassicae to obtain clear bands. The results of ISSR clustering analysis could distinguish the Williamsrace No.11 from other races， but could not completely distinguish Plasmodiophora brassicae， and the geographical origin of P.brassicae had no correlation with its genetic distance.［Conclusion］This study lays a certain foundation for the molecular identification of Plasmodiophora brassicae.

Key words? Plasmodiophora brassicae;ISSR;Molecular marker;Genetic diversity

作者簡介? 左丹丹（1993—），女，貴州貴陽人，講師，碩士，從事根腫病及中草藥種植研究。*通信作者，教授，從事植物病理研究。

收稿日期? 2023-07-07；修回日期? 2023-07-28

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的主要發生在十字花科作物上的一種世界性土傳病害［1-2］，隨著全球范圍內農產品生產與運輸，根腫菌會隨著商品的運輸而傳播。研究發現，根腫病發病時最高可導致減產50%以上，危害面積可達到實際生產面積的30%以上［3］，對十字花科植物的產量和品質危害嚴重。根腫病的主要癥狀為植株根部膨大，秋天葉片變黃，春天營養輸送受到阻礙，植株逐漸枯萎，這些癥狀都會導致作物的產量以及質量受到嚴重影響［4-5］?，F已研究出劃分根腫菌生理小種的幾種鑒別系統，使用范圍最廣的是Williams鑒別系統和ECD鑒別系統。不論是Williams還是ECD鑒別方法，都耗時長、勞動力需要量大，結果易受環境影響，且由于根腫菌田間分離系的異質性的影響，生理小種鑒定結果的解釋通常會受不均勻反應限制［6］。此外，致病基因型可能會被病根的非致病基因型所掩蓋［7-8］。

前人已有研究表明，根腫菌田間分離系的遺傳多樣性能使病原菌克服植株抗性［9］，這對根腫病抗性品種的研究是一個挑戰［10］。近幾年，分子標記已用于鑒別根腫菌田間分離系［11-16］。

簡單重復序列間（ISSR）分析是常用的測定遺傳多樣性技術。優點是有很多可見位點，豐富的多態性，可靠的鑒別信息以及更低的技術要求及花費［17］。因此，ISSR已被廣泛用于檢測很多物種的遺傳多樣性及變異性［18-24］。

根腫菌現有的生理小種鑒別體系存在很多問題，如耗時長，勞動量需求大，結果不穩定，易受環境影響。近年來，利用分子標記方法區分根腫菌生理小種的研究越來越多，用分子方法建立起一套快速、科學的蕓薹根腫菌生理小種鑒定體系已成為研究趨勢。筆者通過ISSR分子標記方法，對來自我國不同地區的根腫菌進行遺傳多樣性分析，形成的UPMGA聚類分析圖與生理小種鑒別結果進行對比，以期探索不同地理來源的根腫菌與其遺傳背景的關系以及生理小種的分布與其遺傳背景之間的關系，為利用分子手段建立生理小種體系的研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 菌株來源

菌根主要采自我國根腫病高發地區的9個省市。菌根材料清洗干凈，室內晾干后儲藏在-20 ℃冰箱備用。48個根腫菌材料采樣地點見表1。菌株生理小種采用Williams鑒別體系進行鑒定。

1.2? 菌懸液的制備

休眠孢子懸浮液的制備參照馬淑青［25］的方法并進行修改：取保存于-20 ℃冰箱內的腫根，在25 ℃下腐熟5 d。將根瘤切成小塊，用勻漿機加入無菌水打磨3 min左右，打磨后的液體通過8層紗布過濾，濾液移入50 mL干凈離心管，靜置10 min左右。將靜置液體的上清液及上層的灰色沉淀移入另一支50 mL干凈離心管中，加30 mL無菌水懸浮，5 000 r/min離心5 min。留沉淀，加入5 mL 50%蔗糖溶液，用渦旋振蕩儀振蕩，使其混合均勻，5 000 r/min離心10 min。上清液移入另一支50 mL干凈離心管，加45 mL無菌水，5 000 r/min離心10 min，沉淀溶于45 mL無菌水中，5 000 r/min離心10 min，留沉淀（該步驟重復2～3次），沉淀溶于5 mL滅菌水中。4 ℃保存備用，24 h內提取DNA。

1.3? 休眠孢子DNA提取及DNA質量檢測

DNA的提取采用傳統CATB方法并進行改良。配制1.0%瓊脂糖凝膠，倒膠點樣成像，將跑出清晰條帶的DNA保存備用，不清晰、被降解的棄去。

1.4? ISSR-PCR擴增

ISSR引物來自加拿大Brithsh Colunbia大學公布的100條引物，由江蘇金唯智生物技術合成公司合成。ISSR-PCR反應體系總體積15 μL，其中包含1 μL DNA模版（80 ng/μL），0.5 μL引物（10 μmol/L），7.5 μL 2×PCR Mastermix（每1 mL含40 U Taq酶）以及6 μL ddH2O。ISSR-PCR擴增反應程序包括94 ℃預變性持續5 min，30 s 94 ℃變性、45 s Tm ℃ 復性、2 min 72 ℃延伸、7 min 72 ℃后延伸共重復40次，最后于12 ℃ 保存。PCR反應體系先進行退火溫度和引物的預篩選。條帶結果用2%凝膠電泳進行檢測。

1.5? 數據處理

ISSR屬于顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，相同移位上有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，弱帶也記為“1”，形成只有“1”和“0”的二次元數據矩陣。用NTSYSpc-2.01軟件進行數據處理，建立UPGMA樹狀圖。

2? 結果與分析

2.1? ISSR-PCR擴增結果

根據引物的擴增結果，從100條引物中篩選出3條擴增條帶清晰、多態性明顯、重復性好的引物，分別是888、889、890（圖1～3）。將出現頻率為5%～95%的條帶視為多態性條帶，3條ISSR引物對病原菌共擴增出44條帶，其中多態性條帶數為43，多態性比例為97.73%，平均每條引物的多態性條帶數14.33（表2）。3條引物中引物889的多態性比例最小，為94.11%，另外2條的多態性比例均達到100%。引物擴增條帶大小在250～4 000 bp，引物的擴增條帶數在1～17。

2.2? 根腫菌ISSR遺傳多樣性分析

結果表明，48株根腫菌菌株之間的遺傳相似系數為0.58～1.00。聚類結果顯示（圖4），同是來自江西省南昌市南昌縣的33號、34號菌株聚在兩大不同類群上，33號歸為類群Ⅰ，34號歸為類群Ⅱ，2菌株遺傳相似系數只有0.580 5，而來自四川省涼山州冕寧縣的27號菌以及來自安徽省宣城市績溪縣的39號菌遺傳相似系數為1.00，來自黑龍江省哈爾濱阿城區的44號菌以及來自四川省德陽市羅江區的46號菌遺傳相似系數高達0.954 5，這說明菌株的地理來源與其遺傳背景相關性不大。同為11號生理小種的30號以及34號菌歸為類群Ⅱ，遺傳相似系數為0.772 7，而遺傳相似系數高達1.00的27號以及39號的菌株為4號生理小種，遺傳相似系數為0.954 5的1號以及2號菌株，遺傳相似系數為0.931 8的10號和11號菌株以及遺傳相似系數為0.931 8的33號、38號菌株也都是4號生理小種。4號生理小種被聚類到多個支上，同為4號生理小種的31號菌和1號菌遺傳相似系數為0.647 3，說明ISSR聚類分析結果可以將11號生理小種與其他生理小種區分開來，4號生理小種遍布遺傳背景差異較大的菌至遺傳背景差異較小的菌。同為7號生理小種的18號菌以及14號菌遺傳相似系數為0.782 4，但與同為7號生理小種的46號菌株的遺傳相似系數只有0.725 6，說明ISSR聚類分析結果并不能以Williams生理小種鑒定結果標準把不同根腫菌完全區分開來。

3? 討論

關于根腫菌遺傳多樣性，國外從1996年就開始進行研究。Mller等［26］用RAPD引物對根腫菌進行分子鑒定，結果

表明，引物OPA09對3個單孢系擴增出了相同的條帶，引物

OPA07擴增條帶的結果與ECD生理小種鑒定結果一致。Yano等［27］用32條RAPD引物對來自日本7個地區的16個

根

腫菌樣品進行PCR擴增，UPGMA聚類結果顯示，9號生理小種的2個菌單獨聚在一類，與4號生理小種和1號生理小種的菌樣區分開來，但不能把對白菜抗病品種有致病性的5個菌和其他11個菌區分開來。Manzanares-Dauleux等［15］用19個RAPD引物對來自7個不同田塊的37個根腫菌單孢分離系進行分析，并用some鑒別體系對這37個單孢系進行生理小種的鑒別，結果表明，屬于P1生理小種的菌都能在約1 200 bp處擴增出1條特異的共有的1個片段——OPLl4（1 200），對這個片段進行膠回收、克隆轉化和測序，建立其SCAR標記，設計出了用于檢測P1生理小種的特異性引物。吳健雄［28］用13條RAPD引物對來自湖北的24個根腫菌進行擴增，并將條帶圖進行UPGMA聚類，聚類結果發現，Williams生理小種鑒定結果與聚類結果不能一一對應，同一小種間也存在著遺傳差異。柴阿麗等［29］利用肌動蛋白和多聚泛素蛋白這2個位點基因，設計出特異性引物對ActF1/ActR1 和UbiF1/UbiR1 對來自我國11個省份、12個寄主的43個根腫菌樣進行PCR擴增。UPGMA聚類分析結果表明，根腫菌遺傳變異與地理來源密切相關，與寄主無關。任靜［30］對40 份來源于不同省份和地區的根腫菌進行了SSR 多態性分析發現，根腫菌生理小種的遺傳分化與其地理來源有密切關系。許路陽［31］篩選出4 個SRAP引物組合，對72 個根腫菌樣本進行遺傳多樣性分析，發現SRAP分子標記技術能將9 號生理小種分離開來。沈旭［32］采用RAPD 和SRAP 方法對48 個根腫菌單孢系進行了遺傳多樣性分析，發現RAPD 和SRAP 能在一定程度上對單孢系按照生理小種和地理位置進行分類，但并不能完全準確地區分生理小種。馬坡等［33］根據SSR引物聚類結果發現，同一地區的根腫菌大多聚類到一起，但同時存在變異。趙輝等［34］利用SSR技術對32 個主栽油菜品種上分離的 100株油菜根腫病菌的遺傳分化進行研究發現，油菜根腫病菌的遺傳分化與地理來源和寄主品種都有著一定相關性，但主要依賴地理來源間的差異，相近地理距離的根腫菌有著更近的親緣關系。

筆者嘗試用ISSR分子標記方法將11號生理小種與其他生理小種的菌區分開來，且遺傳相似系數較高的菌為相同生理小種，這是用ISSR方法探索根腫菌與生理小種之間的關系，這對于用分子手段鑒別根腫菌生理小種的研究奠定了一定的基礎。

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