土壤固碳微生物的絕對定量檢測實驗設計

付小花， 陳 皓， 張 華， 周 磊， 唐賢春

（同濟大學a.環境科學與工程學院；b.污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092）

0 引 言

在全球變暖及我國“雙碳”目標提出的背景下，自養微生物CO2的固定同化已成為研究熱點［1-3］。對特定環境，如濕地、森林、農田等土壤中的固碳微生物種類及數量進行監測，有助于近似估算這些區域的固碳潛能，對我國實現“碳中和碳達峰”目標有積極意義［4-5］。目前關于固碳微生物的分析有培養法和不需培養的分子生物學方法，培養法費時費力，而且結果中缺失不可培養的微生物信息，而不需培養的分子生物學方法在分析微生物群落時具有快速、高效、信息全面等特點［6］。常用的基于16SrRNA基因的測序分析，得到的是所有微生物的類群信息，難以獲得確切的固碳微生物數量信息。以卡爾文循環的關鍵酶——核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco）的大亞基編碼基因cbbL作為靶標表征固碳微生物是科學研究中常用的方法，被廣泛應用于固碳微生物分析［7-8］。

目前主要運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法進行以cbbL基因為靶標的固碳微生物定量檢測［9］，該定量方法依賴于Ct值（Ct指反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數），需要用標準品制備標準曲線，此過程較為費時費力，而且環境樣品中抑制劑的存在會改變樣品的Ct值，使得定量結果不準確。微滴數字聚合酶鏈式反應（ddPCR）是近年來新興的一種靶基因絕對定量實驗技術，該方法不依賴于Ct值和標準曲線就可以實現對核酸分子數目的絕對定量，檢測靈敏度高，理論上可檢出20 μL反應體系中的一個目的DNA分子［10］。分液技術可稀釋背景序列干擾，結果判讀時僅判斷“有”或“無”2 種擴增狀態，因此ddPCR對PCR反應抑制劑的耐受能力大大提高［11］。ddPCR技術在檢測低拷貝基因時有優勢，特別適合定量檢測復雜環境樣品中微量/痕量目的基因，目前已應用于醫療、食品、養殖業、環境等領域［12-15］，尚無應用于固碳微生物檢測的文獻。建立了以cbbL基因為檢測靶標、絕對定量土壤固碳微生物的ddPCR技術，為土壤固碳微生物的測定及碳匯能力評估提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

（1）實驗儀器。PCR儀（BioRad T100），定量PCR儀（BioRad CFX96），ddPCR 系統（BioRad QX200），臺式高速離心機（Thermo Pico21），生物樣品均質儀（MP FastPrep24-5G），單道可調微量移液器（Eppendorf，Rainin），超微量紫外/可見光分光光度計（NanoDrop2000），水浴鍋，恒溫搖床，隔水式恒溫培養箱。

（2）主要試劑。土壤DNA提取試劑盒（DNeasy?PowerSoil Pro Kit）購自Qiagen 公司；ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）、微滴生成油和微滴讀取油均購自Bio-Rad公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購自TaKaRa公司；引物、探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 引物、探針的選擇

通過文獻資料調研，以編碼卡爾文循環關鍵酶大亞基的cbbL基因表征固碳微生物，選擇引物cbbLR1F（5′-AAG GAY GAC GAG AAC ATC-3′）、cbbLR1intR（5′-TGC AGS ATC ATG TCR TT-3′）以及探針cbbLRpro（5′-CAT GCA YTG GCG CGA CCG-3′），其中，S = C/G，R = A/G，Y = C/T，擴增產物大小約275 bp［16］。

1.3 土壤總DNA提取

土壤樣品充分混合，稱取0.25 g 土壤，采用Qiagen公司的DNeasy? PowerSoil Pro Kit試劑盒按操作說明提取DNA，最后溶于60 μL無菌水，-20 °C 保存備用。

1.4 含cbbL基因質粒的構建

用cbbLR1F和cbbLR1intR 擴增提取得到的土壤樣品DNA，擴增條件為：95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，55℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個循環。PCR 產物連接pMD18T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，涂布于含60 μg/mL氨芐青霉素的LB 固體平板上，37 ℃倒置培養過夜。篩選陽性轉化子并測序，序列比對正確的轉化子保存菌種并提取質粒，獲得陽性質粒，命名為pMDcbbL，NanoDrop2000 超微量紫外/可見光分光光度計測定質粒濃度。

1.5 定量PCR檢測引物與探針的適用性

將pMD-cbbL質粒的質量濃度根據分子量換算成拷貝數濃度2.31010copies/μL，10 倍稀釋，取拷貝數濃度2.3100～2.3106copies/μL的pMD-cbbL為模板，以引物cbbLR1F、cbbLR1intR及探針cbbLRpro進行實時熒光定量PCR實驗，以評估引物探針的適用性。實時熒光定量PCR 反應程序為：95 ℃、5 min；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min（收集熒光），40 個循環。

1.6 ddPCR實驗條件的確定

（1）ddPCR檢測cbbL基因。參考BioRad 公司的ddPCR操作使用指南配制反應體系（見表1）?；旌暇鶆颍x心除氣泡。將微滴生成卡DG8 放入支架中，用Rainin的20 μL移液器和20 μL吸頭吸取20 μL反應液并加入DG8 中間一排孔中，在DG8 下面一排孔中分別加入70 μL微滴生成油，蓋上專用膠墊，放入微滴生成儀生成微滴。待微滴生成后，在微滴發生卡的上排能看見云霧狀的溶液，這就是生成的油包水微滴。緩慢吸取微滴（約40 μL），轉移到專用的96 孔板中。蓋上鋁膜，用預熱好的封膜儀180 °C、5 s 封膜，放入PCR 儀擴增，擴增程序如表1 所示，全程升降溫速率均小于等于2 °C/s。擴增完成后，讀取微滴信號，用QuantaSoft軟件分析數據。

表1 ddPCR反應體系和反應程序

（2）ddPCR反應條件的優化。選用pMD-cbbL質粒為模板，對ddPCR 反應條件進行優化，包括退火溫度、探針濃度和引物濃度。優化的關鍵因素是最大限度地提高陰性和陽性微滴分區之間的熒光振幅，并最小化具有中等熒光強度的微滴數量。退火溫度設為62.0、61.2、60.0、58.1、55.8、53.9、52.7、52.0 ℃。在優化退火溫度的基礎上，設置4 組探針濃度進行ddPCR 反應，分別為200、250、300、350 nmol/L，每組設3 個重復。最優退火溫度和探針濃度確定后，設定上下游引物終濃度600、750、900 nmol/L 進行ddPCR 反應，每組設3 個重復。

（3）線性范圍和靈敏度實驗。以pMD-cbbL 質粒為標準品，10 倍稀釋，取拷貝數濃度2.3 ×100～2.3 ×106copies/μL 的pMD-cbbL 為模板，采用優化的退火溫度、引物濃度和探針濃度進行實驗，評估ddPCR 檢測cbbL基因的線性范圍和檢測靈敏度。

（4）重復性實驗。將提取的濕地土壤稀釋10 倍后作為模板，以優化的反應條件檢測cbbL基因拷貝數，設置21 個重復，計算變異系數，以評估該方法的可重復性。

（5）特異性檢測。以優化的反應條件檢測pMDcbbL質粒、濕地土壤、大腸桿菌、產堿芽孢桿菌、產氣腸桿菌、真菌18SrDNA，以雙蒸水代替模板為空白對照，評估ddPCR方法的特異性。

2 結果與分析

2.1 引物與探針的適用性

用引物cbbLR1F、cbbLR1intR及探針cbbLRpro 實時熒光定量PCR 檢測質粒pMD-cbbL，結果如圖1 所示。從圖1 可以看出，10 倍稀釋的質粒樣品間呈現明顯的線性關系，R2= 0.996，擴增效率為94.2%，說明實驗中選用的引物和探針能有效檢測cbbL基因。

圖1 定量PCR檢測cbbL基因的標準曲線

2.2 ddPCR測定cbbL 基因方法的建立和反應條件優化

（1）ddPCR 方法的微滴數量控制。ddPCR 的數據分析是用QuanatSoft軟件統計陰陽性微滴數，計算陽性微滴的占比p，由泊松分布計算出每個微滴中所含有的靶基因拷貝數為-ln（1 -p），再根據理論微滴總數計算出靶基因總拷貝數［10］。為了獲得可靠數據，一般微滴總數需超過10 000，微滴總數低于10 000 的結果舍棄。本文中涉及的所有實驗，擴增的微滴總數均達到10 000 個以上，說明實驗結果均成立，后續不再贅述。圖2 所示為梯度稀釋實驗中16 個反應（編號1 ～16）的微滴總數。

圖2 ddPCR檢測cbbL基因生成的微滴總數

（2）ddPCR反應條件的優化。不同退火溫度擴增結果如表2、圖3 所示。各溫度間測得的質粒分子數有差異，其中52.7 ℃測定的質粒分子數最大，其次是55.8 ℃。PCR 實驗中，退火溫度越高，反應的特異性越好。當溫度為55.8 ℃時，熒光振幅最大，陽性微滴和陰性微滴分布界限最為明顯。因此，確定反應的最佳退火溫度為55.8 ℃。

圖3 退火溫度優化cbbL-ddPCR測定結果

表2 不同退火溫度下ddPCR檢測的質粒分子數

設置A05 ～C05、D05 ～F05、G05 ～A06、B06 ～D06的探針濃度分別為200、250、300、350 nmol/L，cbbLddPCR測定結果如圖4 所示。隨著探針濃度的增加，ddPCR測定的質粒濃度逐漸增加，但不同探針濃度測得的質?？截悢挡町惒伙@著（P＞0.05）。200、250、300、350 nmol/L 探針濃度下，ddPCR 檢測的質粒分子數分別為（618. 00 ± 24.17）、（627. 33 ± 22.17）、（629.33 ±50.76）、（634. 67 ±14.08）copies/μL。當探針濃度為350 nmol/L 時，熒光振幅最高，陰陽微滴區分最為明顯。因此，確定反應的最佳探針濃度為350 nmol/L。

圖4 探針濃度優化cbbL-ddPCR測定結果

當探針濃度為350 nmol/L 時，設置A07 ～C07、D07 ～F07、G07 ～A08 的引物濃度分別為900、750、600 nmol/L，cbbL-ddPCR 測定結果如圖5 所示。可見，在所選定的引物濃度范圍內，隨著引物濃度降低，ddPCR測定的質粒濃度逐漸增加，但差異不顯著（P＞0.05）。900、750、600 nmol/L引物濃度下，ddPCR 檢測的質粒分子數分別為（604.67 ±10.87）、（614.67 ±41.71）、（644. 67 ± 21.97）copies/μL。當引物濃度為600 nmol/L時，測得的質粒分子數最高，但熒光振幅低于900、750 nmol/L時。當引物濃度為750 nmol/L時，測得的質粒濃度較高，熒光振幅最高，陽性微滴和陰性微滴區分最為明顯。因此，確定反應的最佳引物濃度為750 nmol/L。

圖5 引物濃度優化cbbL-ddPCR測定結果

2.3 ddPCR方法的線性范圍和靈敏度

以拷貝數濃度為2.3 ×100～2.3 ×106copies/μL的pMD-cbbL質粒為模板，每個濃度設置3 個平行實驗，用優化后的反應條件進行ddPCR擴增，結果如圖6所示。從圖6（a）可以看出，拷貝數濃度為2.3 ×106copies/μL的樣品，所有微滴都顯示為陽性微滴，無陰性微滴，檢測結果不可靠，舍去。由圖6（b）可見，其余6 個稀釋度的質粒濃度與ddPCR檢測的拷貝數呈線性關系，曲線方程為y= 0.107 7x- 95.562，R2=0.999 7，線性關系良好，說明建立的cbbL-ddPCR 檢測方法定量結果可信。該方法的最高定量限為2.3 ×105copies/μL-DNA，最低定量限為2.3 copies/μLDNA。ddPCR實驗靈敏度極高，在20 μL 反應液中只要有1 個cbbL基因分子該技術就能檢測出來，實驗中20 μL 反應液中加入2 μL DNA模板，所以該方法的檢出限或者靈敏度為0.5 copy/μL-DNA。

圖6 ddPCR檢測cbbL基因的線性范圍

2.4 ddPCR方法的重復性

以優化的反應條件檢測稀釋10 倍的濕地土壤DNA的cbbL基因拷貝數，設置21 個重復（編號1 ～21）。結果顯示，21 個重復的cbbL基因拷貝數濃度范圍為2 080 ～2 380 copies/μL，組內變異系數為3.92%，說明建立的cbbL-ddPCR檢測方法具有極好的重復性（見表3、圖7）。

圖7 ddPCR方法的組內重復性實驗

表3 ddPCR方法檢測濕地土壤DNA的重復性實驗

2.5 ddPCR方法的特異性

用建立的cbbL-ddPCR方法分別對大腸桿菌、產堿芽孢桿菌、產氣腸桿菌和真菌18SrDNA 進行檢測，測試該方法的特異性。結果顯示，除了pMD-cbbL 質粒和濕地土壤樣本出現了陽性微滴（分別為5 967 和5 238 個），其他4 個DNA樣本和空白對照均未出現陽性微滴，說明建立的ddPCR 檢測方法對含有cbbL基因的固碳微生物具有較好的特異性（見圖8）。

圖8 ddPCR方法的特異性實驗

3 結 語

建立了以cbbL基因為靶標的固碳微生物ddPCR檢測方法。通過優化得到最佳退火溫度為55.8 ℃，最佳引物與探針濃度分別為750 nmol/L和350 nmol/L。測試結果表明，該方法靈敏度和重復性高、特異性好，實現了真正意義上的絕對定量，可用于測定土壤固碳微生物數量，從而評估土壤碳匯能力。