阿卡斑病毒G1蛋白原核表達及其主要抗原結構域的抗原性分析

Prokaryotic Expression of Gl Protein of Akabane Virus and Antigenicity Analysis of its Main Domain

YANG Qingl2，CAI Chang2，WEI XianXin， WEI ShanShan2， LU ChenYang2，

LIN Jun2， QIN ShaoMin2， CHEN FengLian2， WU JianMin2， OU ChangBo'， OU YANG Kangl*， MA Ling*

（'CollegeofAnimalScienceandTechnologyGuangxiUniversityNanning，Guangxi34，China；2Guangxi Veterinary Research Institute/ Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Key Laboratory of China

（Guangxi）-ASEAN Cross-Border Animal Disease Prevention and Control，Ministry of Agriculture and RuralAffairs，

Nanning，Guangxi 301，China；Binyang Center forAnimalDiseaseControlandPrevention，Nanning，Guangxi 530400， China）

Abstract： 【Objective】 Akabane（AKA） is a vector-borne infectious disease caused by Akabane virus（AKAV）， which mainly infects catle and sheep， and is one of the epidemic diseases that must be quarantined for imported cattle and sheep in China. The purpose of this study was to prepare the AKAV Gl protein and its polyclonal antibodies for analyzing the antigenicity of the main structural domain of Gl protein， and to provide the foundation for establishing the detection method of AKAV and analyzing biological function of AKAV G1. 【Method】 The recombinant AKAV G1 protein was expressed by a prokaryotic expression system through online bioinformatics analysis， and polyclonal antibodies were prepared using it as the immunogen. Immunogenicity of the G1 protein and the specificity of the polyclonal antibodies were detected by indirect ELISA， IFA， Western blot， and neutralization tests. Based on antigenic epitope analysis， G1b（Thr189-Val397） 0-0 was identified as the main antigenic structural domain of G1 protein， and Glb was expressed by eukaryotic expression system， and the antigenicity of G1b was verified by Western blot.【Result】 The target protein G1 was successfully expressed at about ， and the polyclonal antibody was prepared with a potency of and a neutralizing potency of 1：251.19 ，which showed good reactivity and neutralizing activity， and could specifically recognize the Gl protein. Western blot validation of the recombinant Glb protein showed that Glb protein could be specifically recognized by polyclonal antibody to G1 protein. 【Conclusion】 This study has successfully prepared the recombinant AKAV G1 protein with good expression and immunogenicity. The generated polyclonal antibodies have highly specificity， high potency and strong neutralizing activity， and the Glb protein has good antigenicity， which provides a basis for the establishment of AKAV detection methods and further exploration of AKAV infection and pathogenic mechanisms.

Keywords： Akabane virus； G1 protein； bioinformatics； polyclonal antibody； antigenicdomain

0 引言

【研究意義】阿卡斑病（Akabane，AKA）又稱赤羽病，是由阿卡斑病毒（Akabanevirus，AKAV）引起的一種主要感染牛、羊的蟲媒性傳染病，該病主要通過蚊和庫等媒介昆蟲在宿主動物間叮咬進行傳播，妊娠期的牛、羊最易感病，感染后能引起流產、早產、死胎、胎兒畸形、新生胎兒關節彎曲和積水性無腦綜合征等癥狀（馬玲等，2022）。除牛、羊外，AKAV也可以感染豬、雞、野牛、羚羊等多種家養和野生動物，嚴重影響養殖業健康發展以及野生動物安全，存在跨物種傳播的風險，為《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》二類傳染病，是我國進口牛、羊必檢的疫病之一（INOUEetal.，2024）。研究AKAV主要結構蛋白的功能，對指導AKAV檢測方法建立、疫苗研制以及致病機制研究具有重要意義。【前人研究進展】AKAV屬于布尼亞病毒目（Bunyavi-rales）泛布尼亞病毒科（Peribunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyaviruses）辛波血清群，為分節段的單股負鏈RNA病毒，有3個節段，分別為S、M、L基因節段。S節段高度保守，編碼核衣殼蛋白（N）和非結構蛋白（NSs）；M節段高度變異，編碼病毒囊膜糖蛋白（G1、G2）和非結構蛋白（NSm）；L節段編碼RNA依賴的RNA聚合酶，具有復制和轉錄活性。M節段約 ，編碼高甘露糖型GP前體，可被宿主蛋白酶在內質網腔切割，形成G1、G2和NSm蛋白，其中G1蛋白參與構成AKAV纖突，具有型特異性，參與病毒附著于哺乳動物細胞的過程，是病毒重要的毒力因子，同時G1蛋白包含了中和抗原表位決定簇，具有強烈的免疫原性，能誘導宿主產生特異性的體液免疫以及具有保護性的中和抗體（陳冬杰等，2024；蔡暢等，2024；李運娜等，2024）。G1具有至少5個抗原結構域（A、B、C、D、E），其中A、C抗原結構域各有2個抗原表位（AKASHIetal.，1997）。【本研究切入點】目前國內并無對AKAV的有效防治方法，囊膜糖蛋白G1具有重要作用，但G1蛋白由936個氨基酸組成，分子量較大不易表達，目前關于AKAV抗原表位的研究也較少。【擬解決的關鍵問題】本研究對G1蛋白進行生物信息學分析，應用大腸桿菌表達系統制備重組G1蛋白，進而制備多克隆抗體，同時根據抗原表位分析結果，真核表達具有天然結構的G1b（Thr189-Val397）抗原結構域，進行抗原性分析，旨在為建立AKAV檢測方法以及研究AKAVG1蛋白生物學功能，深入探索AKAV感染和致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞、病毒和血清

Vero細胞、BHK-21細胞、293T細胞、新型AKAV毒株（GXLCH16-70）、AKAV陽性血清由廣西壯族自治區獸醫研究所畜禽疫病專家診治中心（下稱“本實驗室”）保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態細胞均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；新西蘭大白兔購自南寧市研誠生物科技有限公司；Endo-FreePlasmidMidiKit購自Omega 公司；FastPure EndoFree Plasmid MiniKit-BOX2購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；NheI、XhoI、BamHI內切酶、兔抗 6× His多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗兔IgG、異丙基 ？β -D-硫代半乳糖苷（isopropyl β -D-1-thioga-lactopyranoside，IPTG）、磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）、碳酸鹽緩沖溶液（carbon-atebuffersolution，CBS）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）、3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma-Al-drich公司。

1.2AKAVG1蛋白氨基酸序列特征分析

通過多種在線工具，對新型AKAVM基因序列（GenBank登錄號：KY381280.1）進行生物信息學分析。分別通過Protparam（https：//web.ex-pasy.org/protparam/）、ProtScale（https：//web.ex-pasy.org/protscale/）、NetPhos-3.1（https： //services.healthtech.dtu. dk / service.php？ NetPhos-3.1）、TMHMM2.0（https： //services.healthtech.dtu.dk /services.php？TMHMM-2.0）、SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk / services / SignalP-4.1/）、IEDB （http： /imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預測AKAVG1蛋白的理化性質、親疏水性、磷酸化位點、跨膜結構和信號肽以及抗原表位。

1.3重組AKAVG1蛋白誘導表達條件的優化及可溶性分析

根據生物信息學分析結果，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成去除了跨膜區和膜內區域的G1基因片段，同時進行密碼子優化，構建pET-30a-G1質粒。篩選IPTG誘導濃度（0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2mmol/L）和誘導時間（0、2、4、6、8、10、18、 24h） ，通過原核表達系統表達重組AKAVN蛋白；用 $0.01＼mathrm{＼mol/L}$ PBS（pH7.4）重懸菌體并超聲破碎，收集上清液和沉淀物，通過SDS-PAGE判斷重組蛋白可溶性。經Ni柱純化后，獲得純化重組AKAVG1蛋白，并進行SDS-PAGE、Westernblot鑒定。

1.4重組AKAVG1蛋白表達、純化及鑒定

用含有 6mol/L 鹽酸胍的包涵體溶解液處理包涵體，經Ni柱純化后，進行復性，使用 $30＼mathrm{＼kDa}$ 超濾離心管濃縮復性蛋白。最后使用 透析袋，將重組AKAVG1蛋白溶解緩沖液置換成PBS，測定蛋白濃度并進行Westernblot鑒定。

1.5AKAVG1多克隆抗體制備及鑒定

取復性的重組AKAVG1蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化均勻后，按照 （只·次）采用肌肉多點注射免疫新西蘭大白兔，同時設PBS免疫組為對照；首次免疫后選擇弗氏不完全佐劑乳化重組G1蛋白，在第14d、28d進行第2次、第3次免疫，免疫劑量和免疫途徑與首次免疫相同。第3次免疫后14d通過頸動脈采血、分離血清，通過間接ELISA、IFA、Westernblot和中和試驗評價多克隆抗體特異性和效價。

1.5.1 間接ELISA鑒定

用 0.05mol/LCBS（ ）將純化的重組AKAVG1蛋白稀釋到 0.2～mL，按 100uL孔 包被過夜，用 1% BSA 封閉 ，將待檢血清及陰性血清分別以 1：500 倍進行倍比稀釋，每個樣品設2個重復， 反應 ，加入 100～uL1：10000 稀釋的HRP-山羊抗兔IgG， 反應45min ，加入TMB避光顯色 10min 后，終止反應，測定各孔在 處的OD值。

1.5.2 IFA鑒定

用GXLCH16-70毒株感染BHK-21細胞，并同時設正常細胞為陰性對照， 后棄上清液，用4% 多聚甲醛固定后，用 0.5% TritionX-100反應15 ，然后用 1% BSA封閉，分別按 1：50 稀釋AKAVG1多克隆抗體和陰性血清， 孵育90 ，以 1：100 稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG， 孵育 ，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 Westernblot鑒定

將純化的GXLCH16-70毒株進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉后，先后經抗AKAVG1蛋白多克隆抗體 （1：1000） 、HRP標記的羊抗兔IgG（1：5000）孵育，進行Westernblot分析。

1.5.4中和效價測定

培養BHK-21細胞單層，待長至 80% ，采用固定病毒稀釋血清法測定多克隆抗體中和效價，將血清以2倍比稀釋，每一稀釋度設4個重復與200 的AKAV等體積混合，在 下孵育 0然后將病毒一抗體混合物加入到96孔板的BHK-21細胞中，并在 、 5% 培養箱培養。 后，記錄每組出現CPE的細胞孔數，按Reed-Muench法計算該血清的中和效價。

1.6重組AKAVG1b真核表達質粒的構建

根據生物信息學分析，發現G1蛋白（Thr189-Val397）涵蓋9個AKAVG1基因抗原表位的片段。由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成特異性引物，AKAVG1b/F：5'-CGCGGATCCATGTCATTGCAT-GTCCTAAATAAG-3'；AKAVG1b/R：5'-CCGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGGTAGCAATCTACATCG-3'，以GXLCH16-70毒株cD-NA為模板擴增目的片段G1b（Thr189-Val397）。純化PCR產物與pcDNA3.1/Hygro（+）載體連接，鑒定后，命名為pcDNA3.1-G1b。

1.7重組AKAVG1b真核表達及鑒定

按照去除內毒素的質粒大提試劑盒說明書，抽提重組質粒pcDNA3.1-G1b，測定核酸濃度，按照LipofectamineM3000轉染試劑說明書轉染293T細胞表達。 培養 后，收集細胞上清液和沉淀物，分別使用 6× His多克隆抗體、AKAV陽性血清進行Westernblot分析，鑒定重組蛋白抗原性。

2 結果與分析

2.1AKAVG1蛋白生物信息學分析

G1蛋白由936個氨基酸組成，相對分子量為 ，是等電點為8.42的堿性蛋白，其不穩定指數35.17，平均親水性指數為-0.249，表明是一種穩定的親水蛋白（表1、圖1A）。通過Net-Phos-3.1、TMHMM2.0、SignalP-5.0分析，顯示G1蛋白不含信號肽，推測為非分泌蛋白；存在一個跨膜螺旋，1-888aa位于膜外側，在889-911 aa、912-936aa分別為跨膜螺旋和膜內區域，推測G1蛋白可能是一種非分泌的跨膜蛋白（圖1B-C）；此外，G1蛋白有102個磷酸化修飾位點，包括35個蘇氨酸稀釋位點、48個絲氨酸修飾位點和19個酪氨酸修飾位點（圖1D）。

2.2AKAVG1蛋白抗原表位及預測

通過DNAStar軟件和在線工具IEDB分別對G1氨基酸序列進行親和力分析和抗原表位預測，結果顯示G1蛋白有37個B細胞優勢抗原表位，蛋白的抗原表位區域與親水區、表面可及區大致相同，發現G1蛋白（Thr189-Val397）涵蓋9個

AKAVG1基因抗原表位的片段（圖2）。由于G1蛋白分子量較大且存在跨膜結構域，因此挑選抗原性較高的區域，同時保留兩端 螺旋、 β 折疊或無規則卷曲，即將G1蛋白第 位氨基酸的截短區域進行真核表達，并分析其抗原性。

2.3重組AKAVG1蛋白誘導表達

將重組表達質粒pET-30a-G1轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞后，優化重組AKAVG1誘導表達條件，發現在IPTG濃度為 0.25mmol/L

誘導 時，在 101.1kDa 處可見與預計相符的條帶，表達量最高（圖3）；目的蛋白主要存在于菌體破碎沉淀物中，以包涵體形式表達（圖4）。

Fig.3 Optimization of induced expression conditions for the recombinant G1 fusion protein

A：不同誘導時間的產物（M：蛋白質分子質量標準；1＼～8：pET-30a-G1誘導0、2、4、6、8、10、18、24h產物）；B：不同誘導濃度的產物（9：pET-30a-G1未誘導；10＼～16：pET-30a-G1使用0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/LIPTG誘導6h產物）

A：productsinducedfordifferenttimes（Mproteinarker；＼～8proctsnducedbypE-aGfor，46，80h）；

B：productsunderdiffrentinductionconcentrations（9：notinducedbypET-30aG1；0＼～16：pET-30a-GlinducedbyIPTGof0，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0mmol/L for 6h）

M：蛋白質分子質量標準；1：G1融合蛋白表達菌破碎前；2：G1蛋白表達菌破碎上清液；3：G1蛋白表達菌破碎沉淀物M：proteinmarker；1：Glfusionproteinexpressonbacteriabeforecrushing；2supernatantafterGlproteinexpressionbacteriacrushing； 3： precipitate after G1 protein expression bacteria crushing

2.4重組AKAVG1蛋白的純化及鑒定

根據優化的誘導條件，大量表達重組AKAVG1蛋白。重組蛋白經純化、復性、超濾及透析后，進行Westernblot鑒定，結果顯示純化的重組AKAVG1蛋白可以分別與兔抗 多克隆抗體（圖5A）、AKAV陽性血清反應（圖5B），說明該蛋白有較好的反應性。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定純化濃縮后的G1蛋白濃度為 $0.425＼mathrm{＼mg/mL}$ ，可用于免疫動物制備多克隆抗體。

A： 標簽抗體鑒定（M：蛋白質分子質量標準；1： 標簽抗體鑒定純化后G1蛋白）；B：AKAV陽性血清鑒定（M：蛋白質分子質量標準；2：AKAV陽性血清鑒定純化后G1蛋白）

A： 6× His tag antibody identification （M： protein molecular quality standard； 1： purified G1 protein identified by tag antibody）；B：AKAV-postiveserumdentification（M：proteinmolecularqualitystandardpurifiedG1proteinidentifiedbyAKAVpositive serum）

2.5AKAVG1蛋白多克隆抗體制備及鑒定

以純化的重組AKAVG1蛋白作為免疫原，免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。通過間接ELISA測定抗體效價達 1：512000 （圖6A），說明重組蛋白具有較好的免疫原性、多克隆抗體具有較高效價。IFA和Westernblot結果證實，AKAVG1多克隆抗體可與AKAVGXLCH16-70毒株發生特異性反應，分別出現與預計一致的 條帶和特異性的綠色熒光（圖6B、C），證實制備的AKAVG1多克隆抗體能夠特異性識別AKAV。

A：G1多克隆抗體血清效價測定；B：Westernblot鑒定；C：IFA鑒定

A：G1 polyclonalantibody serum potency assay；B：Western blot identification； C：IFA identification

采用固定病毒一稀釋抗血清法對本實驗制備的AKAVG1重組蛋白的兔源多克隆抗體進行中和效價測定，結果如表2所示：該抗體中和效價為1：251.19，AKAVG1多克隆抗體具有體外中和活性。

2.6重組AKAVG1b蛋白真核表達及鑒定

構建pcDNA3.1-G1b真核表達質粒，經鑒定后（圖7），轉染至293T細胞表達。經Ni柱純化后，通過SDS-PAGE分析，獲得較純的重組AKAVG1b（Thr189-Val397）蛋白（圖8A）。Westernblot鑒定顯示濃縮后的重組AKAVG1b蛋白可以分別與兔抗 6×His 多克隆抗體、AKAVG1多克隆抗體、AKAV陽性血清反應，在 處均可見與預計相符的單一條帶（圖8B-D），說明該重組蛋白具有良好的抗原性。

A：G1b目的片段擴增（M：DNA marker 2000；1＼～2：G1b；3：陰性）；B：重組質粒雙酶切鑒定（M：DNA marker 2000；1：pcDNA3.1-G1b雙酶切）

A：amplificationoftheGlbtargetfragment（M：DNAmarker200；1＼～2：Glb；3，negative）；B：doubleenzymedigestionoftherecombinant plasmid（M，DNA marker 5000； 1： pcDNA3.1-G1b double digestion）

A：純化重組AKAV G1b蛋白SDS-PAGE 分析（M：蛋白 marker；1：pcDNA3.1空載；2：G1b蛋白）；B：His 標簽抗體WB 驗證（M：蛋白marker；1：Glb蛋白；2：AKAV全病毒）；C：G1多克隆抗體驗證（M：蛋白 marker；1：G1b蛋白）；D：AKAV陽性血清WB驗證（M：蛋白marker；1：G1b蛋白；2：AKAV全病毒）

A：SDS-PAGE analysis ofpurifiedrecombinantAKAVGlb protein（M：protein marker；1：pcDNA31empty vector；2：Glb pro-

tein）；B：WBverificationwithHis agantibody（M：protein marker；1：Glbprotein；2：AKAVwholevirus）；C：Glpolyclonalantibody verification（M：protein marker； 1： G1b protein）；D：WB validation of AKAV positive serum（M： protein marker；1：Glb protein； 2：whole AKAV）

3 討論

AKA作為一種蟲媒病，廣泛流行于全球溫帶、熱帶地區，我國在該病的流行區域內，目前全國28個省（市、自治區）檢出該病（WANGetal.，2017）。AKA傳播性強、危害大，曾給日本、韓國和澳大利亞的牛、羊產業造成巨大的經濟損失。近年來在我國華南、西南、東北、西北地區陸續發生AKA病例，相繼在內蒙古和貴州分離出國內首株AKAVIb亞型和Ⅱ型毒株，并在廣西邊境地區的蚊蟲中檢出AKAV，說明我國AKAV流行日趨復雜，并存在跨區域傳播的風險（TANGetal.，2017；宋頌，2018；朱沛等，2021；章凡等，2022；鮑顯偉等，2023；ZANetal.，2023；貴州省動物疫病預防控制中心等，2024）。目前，尚無針對該病的有效治療方法，一旦發病，往往會造成嚴重的經濟損失，危害我國家養和野生動物安全，因此亟需開展針對AKAV的研究。

AKAVG1蛋白由936個氨基酸組成，為囊膜糖蛋白，具有型特異性，在病毒的附著哺乳動物細胞中發揮重要作用，G1和G2糖蛋白共同組成病毒表面突起，G2位于基部，G1三聚體位于頂部，形成免疫結構域，可以與B細胞受體結合，刺激B細胞產生體液免疫，從而強烈誘導宿主特異性免疫反應（何凱鋒等，2023；陳赫威，2023）。由于AKAVG1蛋白天然形式的糖基化程度較高，徐樹蘭等（2008）使用桿狀病毒表達系統，表達了重組AKAVG1蛋白，目前尚無通過原核表達系統表達該蛋白的報道。本研究采用多種生物信息學分析軟件，系統分析AKAVG1蛋白理化特性、結構、功能及抗原表位等，結果顯示AKAVG1蛋白是一種穩定的親水蛋白，有102個磷酸化修飾位點，無信號肽，有跨膜螺旋，是一種非分泌的跨膜蛋白，推測該蛋白在原核表達系統中主要以包涵體形式存在。由于蛋白跨膜結構不利于蛋白表達及抗體識別，本研究在構建原核表達質粒時去除跨膜區和膜內區域，并對誘導表達條件進行探索和優化，發現當IPTG濃度為 $0.25＼mathrm{＼mmol/L}$ 誘導 蛋白大量表達，獲得重組AKAVG1蛋白包涵體，與預測結果一致。本研究選用變性能力更強的 6mol/L 鹽酸胍溶解，獲得可溶性蛋白。在純化可溶性蛋白時，常規的方法是通過透析逐漸降低變性劑濃度，但使用該方法純化重組AKAVG1蛋白極易產生沉淀，因此本研究采用稀釋復性后超濾濃縮的純化方式，可以較好地控制復性過程中變性劑的去除速度，減少蛋白質聚集，獲得了純化的可溶性重組AKAVG1蛋白。隨后，以該蛋白為免疫原，成功制備了效價較高的多克隆抗體，該抗體可以分別與AKAV毒株、重組AKAVG1蛋白發生特異性反應，并具有較好的中和活性，說明本研究表達的重組AKAVG1蛋白具有較好的免疫原性和反應原性，制備的多克隆抗體可以識別天然病毒。國內目前尚無AKAV的商品化診斷試劑盒，G1蛋白有望成為ELISA、免疫熒光（IFA）或膠體金試紙條等檢測技術的理想靶標抗原。

已有研究證實，AKAVG1蛋白包含至少5個抗原結構域、9個抗原表位（AKASHIandIN-ABA，1997）。OGAWA等（2022）利用原核表達系統表達一系列截短的AKAVG1蛋白，通過Dotblot和中和試驗，篩選可以與9株單克隆抗體發生特異性反應的重組AKAVG1蛋白，發現其中1株單克隆抗體可以與G1N端截短蛋白反應、4株單克隆抗體可以與中部截短蛋白反應，進而發現位于N端的1-97aa和中部的189-397aa包含抗原表位，以這2個截短蛋白免疫小鼠，能誘導產生中和抗體。胡世享等（2023）通過桿狀病毒表達系統成功表達AKAVG1189-397aa，并證實該蛋白具有較好的反應原性。本研究通過分析抗原表位發現，AKAVG1蛋白有37個B細胞優勢抗原表位，其中9個位于189-397aa，該肽段含有208個氨基酸、多個潛在磷酸化位點、 β -折疊和無規則卷曲，為優勢抗原肽段（陳虎等，2024）。選取該片段通過真核表達系統表達，且為分泌表達，獲得的重組AKAVG1b蛋白與兔抗 6×His 多克隆抗體、AKAVG1多抗血清、陽性血清均發生特異性反應，表明重組蛋白具有較好的抗原性（王彩霞等，2024）。本研究與上述研究結果一致，共同證實AKAVG1189-397aa中存在AKAV抗原表位。AKAV的N蛋白或G1蛋白的穩定性較好，在多數病毒中同源性更高，普遍應用N蛋白或G1蛋白作為赤羽病疫苗開發的靶標抗原。重組AKAVG1b蛋白與G1蛋白相比，蛋白小且為分泌表達，蛋白質不僅具有天然構象和生物活性，還易于純化。相比原核系統，真核系統表達的蛋白質糖基化模式與人類細胞相似，更少引起免疫反應，且蛋白質更穩定，適合作為重組亞單位疫苗的核心抗原和檢測方法的開發。

4結論

本研究成功獲得表達良好且具有較好的免疫原性的重組AKAVG1蛋白以及特異性強、效價高、具有較高中和活性的多克隆抗體，同時證實G1b具有抗原性，為進一步建立AKAV檢測方法，深入探索AKAV感染和致病機制奠定了基礎。

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（責任編輯 謝紅輝）