膠質淋巴系統晝夜節律紊亂在腦小血管病相關認知功能障礙中的研究進展

肖熾 綜述， 范玉華 審校

腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）是指各種病因影響腦內小動脈及其遠端分支、微動脈、毛細血管、微靜脈和小靜脈所導致的一系列臨床、影像、病理綜合征。CSVD常見的病因分型包括：Ⅰ型，小動脈硬化；Ⅱ型，散發性或遺傳性腦淀粉樣血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）；Ⅲ型，其他遺傳性CSVD；Ⅳ型，炎癥或免疫介導的小血管病；Ⅴ型，靜脈膠原病；Ⅵ型，其他小血管病［1］。目前CSVD的發病機制涉及到神經血管膠質單元（neurovascular glial unit，NVU）功能和結構的異常，而高血壓是其最常見的病因和最重要的發病始動環節。

1 CSVD認知功能障礙和睡眠障礙

1.1 CSVD認知功能障礙 腦小血管病是老年人最常見的腦血管疾病之一，可以引起急性癥狀（如腔隙性腦梗死、腦出血等），占癥狀性卒中的20%，同時也可隱匿起病，如癡呆、步態異常、尿潴留及情緒障礙等［2］。流行病學研究發現：20%～40%的老年性癡呆與小血管病有關［3］，腦小血管病的存在提升14%的未來認知功能受損及全部類型癡呆的風險，其中提升25%的未來罹患AD的風險，以及75%的未來罹患血管性癡呆的風險［4］。CSVD引起的認知損害主要涉及注意力、處理速度、執行功能等認知域，而記憶的損害相對較輕。血管性癡呆是認知損害累積發展的結果，最終導致日常生活、學習、工作以及社交能力顯著下降。

目前關于CSVD所致認知功能障礙的機制，包括以下幾個方面。首先，大腦白質纖維破壞所致大腦網絡連接出現中斷和繼發性皮質萎縮變薄。CSVD中腔隙性梗死可破壞額葉-皮質下纖維鏈，而我們的額葉-皮質下神經環路參與記憶、執行以及信息處理等多個認知域的調控［5］。此外，腦白質病變（white matter hyperintensity，WMH）能夠引起膽堿能神經元纖維束損傷或缺失，從而破壞大腦認知網絡完整性，進而產生認知障礙［6］。腦微出血（cerebral microbleeds，CMB）也與CSVD相關認知障礙有關，其中潛在的機制可能與炎癥、血腦屏障功能障礙、小膠質細胞激活以及大腦結構網絡破壞有關［7］。皮質變薄萎縮常為大腦白質纖維破壞的結果，常出現在腔隙性梗死或腦白質變性病灶部位的遠處［8］。

其次，β淀粉樣蛋白沉積。CSVD所致認知功能障礙與AD的病理生理過程有著高度的相似性，有研究發現AD患者中有不少患者伴有腦小血管淀粉樣病變（CAA），也屬于CSVD的一類。關于二者的關系尚無定論，但可以明確的是Aβ淀粉樣蛋白在CSVD中也起著重要的作用［9］。β淀粉樣蛋白沉積機制中包括血腦屏障的破壞導致異常蛋白滲漏、星形膠質細胞功能障礙導致膠質淋巴系統功能下降以及營養和支持神經元功能下降、小膠質細胞吞噬異常蛋白功能障礙等均導致了β淀粉樣蛋白過度沉積，導致神經元變性壞死，從而導致了認知功能障礙的發生。這種潛在的相互作用途徑被認為在CAA和阿爾茨海默病中起著關鍵作用，并可能導致惡性循環，其中神經退行性病變和血管病變相互強化和加重［10］。

1.2 CSVD與睡眠障礙 CSVD患者的睡眠障礙是一個很容易被人們忽略的問題，而且目前關于CSVD與睡眠障礙的研究知之甚少。我們應該正確認識到，睡眠障礙是CSVD患者病程中的常見癥狀或早期的癥狀，包括失眠、日間過度思睡、睡眠呼吸暫停低通氣、快動眼期睡眠行為紊亂、不寧腿綜合征等。睡眠障礙甚至可能是CSVD的始動因素，二者可以相互加強，造成惡性循環。與CSVD相關的睡眠障礙，可分為呼吸性與非呼吸性睡眠障礙，前者以睡眠低通氣為主要表現，后者則以為睡眠剝奪、日間思睡、入睡困難、覺醒次數增多、早醒等為主要表現，后者的發生率其實更高，但更容易被忽視。已有研究證實，CSVD患者的高覺覺醒指數表現出與腦室旁 WMH 及擴大的血管周圍間隙（perivascular space，PVS）呈正相關性［11］，且發生認知障礙的風險更高［12］。CSVD導致睡眠障礙的機制尚不清楚，推測可能與掌管睡眠相關的腦區缺血缺氧出現功能障礙有關，其中下丘腦的視交叉上核（SCN）缺血缺氧導致其與睡眠-覺醒相關的激素分泌節律紊亂，此外微血管病變和白質病變可破壞皮質與大腦深部結構的白質聯絡纖維，影響涉及睡眠-覺醒的多條神經環路，進而造成睡眠-覺醒周期紊亂，出現各種睡眠障礙的表現。

2 CSVD與膠質淋巴系統

2.1 膠質淋巴系統 2012 年，Jeffrey Iliff和Maiken教授團隊采用雙光子顯微鏡和熒光示蹤技術，發現了腦組織液（interstitial fluid，ISF）與腦脊髓液（cerebrospinal fluid，CSF）相互交流置換的方式，并將其命名為膠質淋巴系統（glymphatic systems，GS）［13］，并已經成為近年來神經科學領域的一個開拓性進展，它是大腦內代謝廢物、毒性物質清除的新途徑。該系統依賴星形膠質細胞血管側“終足”（endfeet）上的水通道蛋白4（aquaporin protein 4，AQP4），通過血管旁（perivascular）和“終足”途徑，完成CSF和ISF的交換，清除腦代謝廢物，為神經系統正常神經活動提供最佳內環境［14］。其功能障礙會造成神經毒性物質的累積，與衰老或病理衰老（阿爾茨海默病等）、睡眠障礙、慢性應激、偏頭痛、腦卒中等多種疾病密切相關［15］。所以膠質淋巴系統的提出，為眾多神經系統疾病，尤其是神經系統退行性疾病和腦血管病的病理機制研究提供了嶄新視角。提高異常代謝物質在膠質淋巴系統的清除率，也已經被提到神經退行性疾病領域藥物靶點研究的日程中來。

2.2 GS與AQP4的極性分布 GS是一個以星形膠質細胞足突末端水通道蛋白也即AQP4所介導的腦脊液與腦組織間液相互交流的系統。GS的基本結構包括：動脈周圍間隙腦脊液流入通道、血管周隙星形膠質細胞終足上的AQP4蛋白介導的腦脊液-腦組織液交換通道、組織間隙液體由動脈周隙向靜脈周隙的整體流（bulk flow）以及靜脈周隙液體流出通道［16］。它的作用機制是從動脈端腦脊液經AQP4所形成的通道流入腦組織間隙，再通過AQP4所形成的通道流入靜脈端，在從動脈端向靜脈端流動的過程中，順帶將神經細胞活動產生的代謝廢物以及有害物質清除出神經系統，以防止其蓄積。由此可看出，AQP4是GS正常運作的核心成分之一。

所謂AQP4的極性分布，是指AQP4分布在星形膠質細胞膜上的位置，正常情況下絕大多數分布在星形膠質細胞的足突末端。當AQP4極性出現紊亂，即AQP4除了出現在足突末端，還出現在胞體以及突起上，可能伴有表達量的降低，會導致GS的清除功能產生障礙，導致異常物質堆積，導致某些疾病的發生發展，比如阿爾茨海默病已被證實有AQP4的極性紊亂導致β淀粉樣蛋白清除障礙［14］。既然GS的功能與AQP4極性密切相關，那么AQP4是如何準確錨定在星形膠質細胞的足突末端呢？目前已知的機制可能有2種。一個是AQP4由肌營養不良相關蛋白復合物（dystrophy-associated protein complex，DAC）錨定在細胞膜上，此機制可能占主導作用［17］。DAC包括α-syntrophin、α-Dystrobrevin、Dystrophin、Dystroglycan組成，它們通過相互連接的方式，將AQP4錨定在細胞膜上［18］。另一種是AQP4的極性分布受到自身結構和表達的調控。AQP4是由兩種亞基M1和M23按照一定的比例與排列組合形成的膜蛋白復合物，當采用基因編輯技術減少M23亞基的表達，使AQP4形成僅以M1組合而成的膜蛋白，與野生型老鼠相比，其在星形膠質細胞足突末端的表達量減少［19］。

2.3 驅動GS清除功能的生理因素 目前已知的影響GS清除功能的生理因素包括：心率、呼吸、脈搏強度、睡眠［16］。在這4種生理因素中，睡眠如何影響GS清除功能的研究目前是最少的，已知的機制有睡眠時細胞外間隙擴大從而減輕CSF流入細胞間隙的阻力［20］，睡眠時AQP4極性分布比日間活動時增強［21］。此外，長期睡眠剝奪的大鼠會表現出記憶力的下降，同時發現其海馬及皮質區域β淀粉樣蛋白增多，病理表現類似于阿爾茨海默病，而增加大鼠的慢波睡眠可加速β淀粉樣蛋白的清除，明顯改善大鼠的記憶力與學習能力［22］；一晚的完全睡眠剝奪抑制了人腦分子的清除，而第2天隨后的睡眠并不能彌補這種清除的缺失［23］。睡眠作為一個有晝夜節律的生理活動，其對GS清除功能的影響目前知之甚少，而相關研究揭示了AQP4的極性分布也存在晝夜節律［21］，但其深層的機制尚未有研究發現和證實。

2.4 CSVD與GS功能障礙 隨著GS的發現以及相關機理機制的完善，人們在CSVD疾病模型中，通過頭顱的增強MRI及腦脊液熒光示蹤技術也觀察到了GS的功能障礙。針對CSVD大鼠模型研究證實，自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats， SHR）的腦脊液總流量顯著減少，造影劑進入組織的流量亦有所減少（約占全腦的15%）。使用更高的空間分辨率MRI捕捉與Willis動脈環和大腦中動脈相關的PVS血流顯示，SHR中Gd-DOTA從大腦中動脈向組織周圍血管周圍空間的轉移受阻［24］，并觀察到擴大的PVS與GS的流入量呈顯著負相關，同時清除能力出現下降，伴有血管周圍AQP4極性的缺失［25］。臨床上觀察到CAA患者的血管周圍空間擴散指數（ALPS指數）降低，提示GS功能受損［26］。同時，較低的ALPS指數與基底神經節血管周圍間隙增大、腔隙增多、白質高強度Fazekas評分、CSVD總磁共振成像負荷升高、MMSE以及MoCA認知評估有關，而長期隨訪發現ALPS指數越高，疾病復發率越低［26］。CSVD如何導致GS功能障礙，目前尚未有明確的機制，可能是微血管損傷的繼發性結果，包括PVS水腫、蛋白物質增多可能干擾GS的清除功能；周細胞功能障礙導致PDGF-β減少，使星形膠質細胞AQP4失去極性分布；CSVD晚期小血管壁硬化、閉塞，NVU缺血缺氧，星形膠質細胞功能障礙，AQP4失去極性分布，同時，小動脈端壓力下降，GS始發動力不足。

3 CSVD與晝夜節律

如前文所述，CSVD患者普遍存在容易被忽視的睡眠障礙問題，而睡眠是一種高度遵循晝夜節律的生物活動。晝夜節律的產生，涉及到諸多生理機制的調節，包括激素的調節（褪黑素、兒茶酚胺等）、環境因素的影響（光照、社交、用餐時間和工作時間等）。晝夜節律產生的更深層次生理機制，涉及到生物體內的一系列生物鐘蛋白，包括腦和肌肉ARNT樣蛋白-1（brain and muscle ARNT-like protein-1，BMAL1）、CLOCK蛋白、PERIOD蛋白、CRY蛋白等的共同參與和調節，其中BMAL1蛋白是生物晝夜節律的起始點和調節點。

3.1 BMAL1蛋白 BMAL1蛋白也被稱為MOP3，屬于含有堿性螺旋-環-螺旋/Per-Arnt-SIM（bHLH-PAS）結構域的轉錄因子家族，是哺乳動物生物鐘的核心驅動因素，被認為是調節節律行為不可替代的時鐘基因［27］。BMAL1驅動24 h自主晝夜節律波動的分子機制涉及轉錄-翻譯反饋回路（transcription-translation feedback loop，TTFL）：

BMAL1和CLOCK蛋白結合形成異二聚體，與E-Box結合，并驅動PERIOD蛋白（PER1/2/3）、cryptochrome蛋白（CRY1/2）、反向紅細胞增生病毒α蛋白（REVERBα）和維甲酸相關孤兒受體α蛋白（RORα）的表達；隨后，PER和CRY這2種蛋白質相互作用，在細胞質中形成異二聚體，然后轉移到細胞核，抑制BMAL1/CLOCK的表達，而RORα和REV-ERBα分別促進和抑制BMAL1的表達［28］。在這種負反饋調節機制的作用下，形成了穩定的24 h晝夜波動節律。

BMAL1的表達異常與許多病理生理過程相關，例如BMAL1基因缺失的AD模型小鼠會加劇β淀粉樣蛋白在皮質及海馬的沉積［29］，加速tau蛋白的磷酸化和沉積［30］，上述病理變化可能加劇了阿爾茨海默病的疾病進展。此外，BMAL1也可能參與了2型糖尿病（β細胞中BMAL1的表達是出生后胰島細胞成熟的特征，有助于建立葡萄糖刺激胰島素分泌的晝夜節律控制［31］）、帕金森病（在MPTP誘導的PD小鼠模型中，BMAL1的失活可導致明顯的運動功能障礙、黑質致密部多巴胺能神經元損傷、多巴胺遞質缺乏和神經炎癥反應加重，提示BMAL1可能通過調節小膠質細胞介導的神經炎癥反應對多巴胺能神經元的存活產生有益影響［32］）、高血壓（BMAL1的缺失增強了由IL4觸發的STAT6的磷酸化和核易位，這促進了STAT6及其靶基因轉錄的激活，導致血管壁中MMP9和MMP13的表達增加，促進了血管重塑［33］）等慢性疾病的病理生理過程。

3.2 BMAL1蛋白與星形膠質細胞的功能狀態有關 關于BMAL1與GS的關系，尤其是BMAL1與AQP4的極性分布關系，目前尚未有實驗探究過。前文提到AQP4的極性分布以及與錨定AQP4的相關基因的表達（DAG、DTNA）具有晝夜節律性［21］，GS的清除功能也表現出明顯的晝夜節律，在睡眠時其清除功能達到最佳。因此，屬于生物鐘蛋白的BMAL1或許在其中起著重要的作用。

因為AQP4在中樞神經系統內高度表達于星形膠質細胞，而予敲除BMAL1基因后，星形膠質細胞出現了過度激化表現，表現為GFAP、AQP4表達增多，且對氧化應激能力的自我調節能力下降，這一系列病理生理過程似乎是BMAL1通過谷胱甘肽轉移酶介導的蛋白谷胱甘肽基化介導的細胞自主機制調節星形膠質細胞增生所致［34］。似乎BMAL1可影響AQP4的表達，且有研究證實在BMAL1基因敲除的小鼠心肌組織中觀察到與AQP4錨定相關的dystrophin蛋白表達隨之減少［35］，但對AQP4極性分布缺少免疫組織化學/熒光的分析以及對GS的清除功能缺少熒光示蹤劑的分析，BMAL1基因缺失導致AQP4表達量增多可能是星形膠質細胞膠質增生的伴隨結果。所以，完善BMAL1與AQP4極性分布的關系，將有助于揭示GS清除功能存在晝夜節律的機制。

3.3 BMAL1與CSVD及睡眠障礙 但我們更想知道，CSVD患者出現睡眠節律紊亂是否也與BMAL1有關？目前發現BMAL1基因敲除的小鼠可表現出睡眠節律的紊亂［36］，自發性高血壓大鼠的腎上腺BMAL1表達下降［37］，在高血壓患者口腔內皮細胞檢測到BMAL1的轉錄水平降低［38］，但也存在相矛盾的情況，比如有研究在腎性高血壓大鼠模型中觀察到其代償性肥厚的心肌檢測到BMAL1蛋白水平的增高以及節律性的消失［39］。總之，目前尚缺乏對SHR神經系統BMAL1檢測以及對其睡眠情況的估的相關實驗以進一步證實。

3.4 BMAL1與褪黑素 前述我們已知CSVD存在膠質淋巴系統的功能障礙和睡眠障礙，而睡眠障礙又可導致膠質淋巴系統功能障礙，三者之間可能存在相互促進和惡性循環的過程。睡眠障礙似乎是連接CSVD與膠質淋巴系統功能障礙的橋梁，而目前針對CSVD的有效治療手段有限，如控制高血壓，但療效甚微；而改善膠質淋巴系統功能的治療手段目前還未問世，因此我們猜想改善睡眠是否可以打斷這一惡性循環的過程。目前針對睡眠障礙的藥物治療主要有巴比妥類、藥物苯二氮?類藥物、佐匹克隆、唑吡坦、褪黑素等，其中褪黑素作為一種激素類藥物，除了起改善睡眠障礙的作用外，還有清除自由基、抗氧化、保護神經元、降低血壓等作用。然而CSVD患者神經系統的內源性褪黑素分泌節律如何變化，以及補充外源性褪黑素對生物鐘蛋白BMAL1是否具有調節作用，目前研究甚少，已知褪黑素可通過PI3K/AKT信號通路上調BMAL1基因的表達，可減少MCAO模型小鼠腦梗死區域神經元的死亡［40］，但其是否可通過上調BMAL1表達進而上調AQP4錨定蛋白復合物DAC中DMD的表達［35］，從而改善AQP4極性分布和改善膠質淋巴系統的功能障礙，尚未有研究證實，即補充外源性褪黑素是否可改善CSVD患者的膠質淋巴系統功能是個值得探討的有趣問題。

4 總結與展望

總結上述，CSVD患者存在睡眠障礙以及GS的清除功能障礙，可能導致β淀粉樣蛋白沉積增多，進而導致患者的認知功能受損，而BMAL1是否參與在此病理生理過程中，是個值得探討的問題。已有研究證實，自發性高血壓大鼠（SHR）存在BMAL1基因表達減少［37］。因此，探究BMAL1與AQP4極性分布的關系，明確膠質淋巴系統功能的晝夜節律性，并在此基礎上，進一步探究BMAL1在CSVD中的作用，可以完善CSVD相關認知障礙的發病機制。同時可以期望找到明確的干預靶點，比如通過褪黑素提高睡眠質量可否調節BMAL1可能參與的信號通路如PI3K/AKT，進而調節AQP4極性分布的變化來調節GS清除β淀粉樣蛋白的功能，從而改善CSVD所致的認知功能障礙。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：肖熾負責論文設計、撰寫論文、文獻收集、論文修改；范玉華負責擬定寫作思路、指導撰寫論文并最后定稿。