銅離子激活MAPK-ERK通路調(diào)控鼻咽癌放射敏感性

黃秀婷 林頡 葉曉心 蔡佳佐 袁亞維

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州 510095）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是一種在中國(guó)南方地區(qū)高發(fā)的惡性上皮性腫瘤，放射治療是其最主要的治療手段［1-2］。然而，放療抵抗的存在導(dǎo)致約20%的患者治療后出現(xiàn)腫瘤局部殘留及復(fù)發(fā)［3］，其治療方式有限，預(yù)后不佳［4］。因此，需要探究NPC 的放療抵抗機(jī)制，尋找有效的增敏策略。研究［5-7］表明，快速分裂的腫瘤細(xì)胞需要更高水平的Cu2+以滿(mǎn)足其代謝需求，Cu2+能夠參與致癌信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。包括NPC 在內(nèi)的多種腫瘤患者血清及腫瘤組織內(nèi)Cu2+含量顯著升高［8-12］。此外，肝癌患者血清Cu2+水平與放療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)［13］，應(yīng)用銅螯合劑或阻斷銅轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以逆轉(zhuǎn)多種腫瘤的放化療抵抗性［13-16］。這些線(xiàn)索表明靶向Cu2+可能成為NPC 放射增敏的新方向。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-ERK）通路是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路，其過(guò)度活化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［17］。既往研究顯示，Cu2+對(duì)腫瘤細(xì)胞中MAPKERK 通路的活化具有調(diào)控作用［18］，MAPK-ERK 通路的激活又與淋巴細(xì)胞白血病的放射抗性相關(guān)［19］。但在NPC細(xì)胞中，關(guān)于Cu2+對(duì)MAPK-ERK通路的調(diào)控及其對(duì)放療敏感性的影響，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以NPC 細(xì)胞內(nèi)Cu2+含量為研究對(duì)象，旨在探究其對(duì)放射敏感性的潛在影響及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人鼻咽上皮細(xì)胞NP69 及人NPC細(xì)胞系CNE1、CNE2、5-8F、HONE1、SUNE1 由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要材料與試劑 PBS 緩沖液、1640 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries 公司；4%多聚甲醛溶液購(gòu)自永津生物科技有限公司；2.5%結(jié)晶紫甲溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；銅離子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Cohesion BIOSCIENCES 公司；葡萄糖酸銅及四乙烯五胺（TEPA）購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自美國(guó)GlpBio 公司；RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；HRP 直標(biāo)GAPDH 單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)Proteintech 公司；γH2AX 多克隆抗體、RAS 單克隆抗體、ERK1/2 多克隆抗體、Phospho-ERK1/2（PERK1/2）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；Phospho-C-RAF（P-C-RAF）多克隆抗體、C-RAF 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司；MAPK-ERK 通路抑制劑SCH772984 購(gòu)自美國(guó)Med-ChemExpress 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的完全培養(yǎng)基中，置于CO2濃度5%、溫度37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞Cu2+檢測(cè) 收集細(xì)胞后加入細(xì)胞測(cè)定緩沖液，超聲破碎細(xì)胞后離心收集上清液。將140 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品分別加入酶標(biāo)板中，每孔依次加入40 μL 反應(yīng)緩沖液、10 μL 掩蔽劑及10 μL 染料試劑，37℃孵育15 min 后在酶標(biāo)儀605 nm 處測(cè)定各孔OD值。

1.2.3 Cu2+溶液配制 精確稱(chēng)取453.84 mg 葡萄糖酸銅粉末，溶于10 mL 無(wú)菌PBS 緩沖液中。充分溶解后，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾得到濃度為0.1 mol/L 的Cu2+儲(chǔ)存液，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.4 細(xì)胞藥物處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NPC 細(xì)胞進(jìn)行傳代鋪板。首先分別加入0、5、10、20、50、100、200 μmol/L Cu2+溶液及0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L TEPA 溶液，通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)確定藥物的最佳作用濃度。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，各組細(xì)胞分別接受了不同的藥物處理：Cu2+組加入20 μmol/L Cu2+溶液；TEPA 組加入0.2 mmol/L TEPA 溶液；Cu2++ SCH772984 組同時(shí)加入20 μmol/L Cu2+溶液及300 nmol/L SCH772984；對(duì)照組不作任何處理。藥物處理24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究這些處理對(duì)細(xì)胞的影響。

1.2.5 細(xì)胞輻照 使用廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心直線(xiàn)性加速器（型號(hào)：Clinic iX， Varian，Pali Alto， CA， USA）產(chǎn)生的6 MV X 射線(xiàn)進(jìn)行照射，源軸距（SAD）為1.5 cm，劑量率為200 cGy/min，照射野大小為10.0 cm × 15.0 cm。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在96 孔板加入5 000 細(xì)胞/孔。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)藥物處理后在適宜環(huán)境培養(yǎng)24 h，進(jìn)行射線(xiàn)輻照。輻照后24 h，洗凈孔板中原有培基后每孔加入10 μL CCK-8 溶液和90 μL 完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD值。

1.2.7 細(xì)胞克隆形成 將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種于6 孔板中。0、2、4、6、8 Gy 的照射劑量對(duì)應(yīng)的接種細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為1 000、1 500、2 000、3 000、4 000 個(gè)，待細(xì)胞貼壁后按分組加入相應(yīng)藥物處理，24 h 后進(jìn)行射線(xiàn)輻照處理。約14 d后終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)基并用PBS 清洗，用4%多聚甲醛充分固定后結(jié)晶紫染色30 min。流水洗凈染料后晾干并拍攝圖片。使用Image J 統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)，利用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線(xiàn)，公式為：SF=1-（1-e-D/D0）N。

1.2.8 蛋白提取及蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot） 細(xì)胞輻照24 h 后，使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算出相應(yīng)的上樣體積。電泳分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜在5% BSA 溶液中室溫封閉1 h 后，置于相應(yīng)一抗溶液4℃下孵育過(guò)夜。用TBST 充分洗滌后將膜與HRP 標(biāo)記的相應(yīng)種屬的二抗于室溫下孵育1 h。洗膜后用ECL 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并制作統(tǒng)計(jì)圖表，所得結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。其中，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常鼻咽上皮細(xì)胞及NPC 細(xì)胞中的Cu2+含量 與NP69 相比，各NPC 細(xì)胞株的Cu2+含量均明顯升高。其中，高分化NPC 細(xì)胞系CNE1 的Cu2+含量最低，低分化NPC 細(xì)胞系SUNE1 中Cu2+含量最高（表1）。

表1 檢測(cè)不同細(xì)胞株的Cu2+含量Tab.1 Detected the contents of the copper ions in different cell lines ±s

表1 檢測(cè)不同細(xì)胞株的Cu2+含量Tab.1 Detected the contents of the copper ions in different cell lines ±s

注：取正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69為參照

細(xì)胞NP69 CNE1 5-8F CNE2 HONE1 SUNE1 Cu2+含量1.07 ± 0.11 1.57 ± 0.14 1.77 ± 0.17 2.07 ± 0.16 2.78 ± 0.17 3.48 ± 0.24 P值0.016 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

2.2 Cu2+含量引起NPC 細(xì)胞的放射敏感性改變CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)暴露于50 ～ 200 μmol/L銅水平時(shí)CNE1細(xì)胞發(fā)生了毒理學(xué)反應(yīng)，添加外源性Cu2+濃度低于50 μmol/L 時(shí)細(xì)胞則出現(xiàn)了放療抵抗（表2）。在SUNE1 細(xì)胞中，添加0.1 ～ 0.2 mmol/L TEPA 能提高其放射敏感性，添加0.50 mmol/L 以上TEPA 則會(huì)引起細(xì)胞毒性（表3）。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，Cu2+組的CNE1 細(xì)胞對(duì)電離輻射的抵抗性增強(qiáng)，TEPA 組在SUNE1 細(xì)胞則產(chǎn)生了放療增敏效果（圖1A）。Western Blot 結(jié)果顯示，相比未作處理的CNE1 細(xì)胞和SUNE1 細(xì)胞，接受同等劑量的電離輻射后Cu2+組細(xì)胞γH2AX 的蛋白表達(dá)量下降，TEPA 組γH2AX 表達(dá)升高（圖1B）。

圖1 NPC 細(xì)胞中Cu2+含量與放射敏感性的關(guān)系Fig.1 Relationship between copper ions and radiosensitivity in NPC cells

表2 添加Cu2+溶液后CNE1 的細(xì)胞存活率Tab.2 Cell viability of CNE1 after addition of copper ion solution ±s，%

表2 添加Cu2+溶液后CNE1 的細(xì)胞存活率Tab.2 Cell viability of CNE1 after addition of copper ion solution ±s，%

注：取未添加Cu2+溶液組為參照，#表示未放射組間P 值；*表示5Gy放射組間P值

Cu2+濃度（μmol/L）0 5 10 20 50 100 200細(xì)胞存活率未放射100.00 ± 3.93 99.00 ± 5.47 96.79 ± 4.75 98.78 ± 6.27 86.99 ± 2.21 62.13 ± 4.09 33.35 ± 4.24 5Gy放射40.41 ± 3.48 52.56 ± 2.24 63.91 ± 1.87 67.80 ± 2.96 51.84 ± 2.84 29.92 ± 1.13 13.05 ± 1.01 P值#0.999 0.653 0.999＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 P值*＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

表3 使用TEPA 后SUNE1 的細(xì)胞存活率Tab.3 Cell viability of SUNE1 after TEPA administration ±s，%

表3 使用TEPA 后SUNE1 的細(xì)胞存活率Tab.3 Cell viability of SUNE1 after TEPA administration ±s，%

注：取未添加TEPA 組為參照，#表示未放射組間P 值；*表示5Gy放射組間P值

TEPA濃度（mmol/L）0 0.05 0.10 0.20 0.50 1.00 2.00細(xì)胞存活率未放射100.00 ± 3.26 102.70 ± 3.72 101.80 ± 1.94 99.57 ± 4.73 82.37 ± 9.66 77.64 ± 3.52 66.12 ± 4.43 5Gy放射61.78 ± 4.40 58.20 ± 2.10 50.89 ± 2.96 41.57 ± 2.77 31.30 ± 3.48 26.09 ± 2.68 22.48 ± 2.08 P值#0.856 0.976 1.000＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 P值*0.193＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

2.3 添加外源性Cu2+后NPC 細(xì)胞MAPK-ERK 通路的活化情況 Western Blot 結(jié)果顯示，無(wú)論放療前后，與對(duì)照組相比，Cu2+組的CNE1 細(xì)胞內(nèi)RAS蛋白、磷酸化的RAF 蛋白（P-RAF）和磷酸化的ERK1/2 蛋白（P-ERK1/2）蛋白表達(dá)上調(diào)，P-RAF/RAF 比值和P-ERK/ERK 比值升高（圖2）。

圖2 NPC 細(xì)胞內(nèi)Cu2+引起MAPK-ERK 通路活化Fig.2 Copper ions activate MAPK-ERK pathway in NPC cells

2.4 MAPK-ERK 通路抑制劑逆轉(zhuǎn)Cu2+介導(dǎo)的NPC放療抵抗 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用MAPKERK 通路抑制劑SCH772984 可以逆轉(zhuǎn)Cu2+引起的NPC 放療抵抗性（表4）。克隆形成實(shí)驗(yàn)中，與Cu2+組相比，Cu2++ SCH772984 組在放療后存活分?jǐn)?shù)下降（圖3A）。Western Blot 結(jié)果顯示，與Cu2+組相比，聯(lián)合使用Cu2+與SCH772984 能加劇放療引起的NPC 細(xì)胞DNA 雙鏈損傷（圖3B）。

圖3 抑制MAPK-ERK 通路逆轉(zhuǎn)了Cu2+依賴(lài)性放療抵抗Fig.3 Inhibition of MAPK-ERK pathway reverses copper ion-dependent radioresistance

表4 MAPK-ERK 通路抑制劑對(duì)CNE1 細(xì)胞存活率的影響Tab.4 Effect of MAPK-ERK pathway inhibitors on the cell viability of CNE1 ±s，%

表4 MAPK-ERK 通路抑制劑對(duì)CNE1 細(xì)胞存活率的影響Tab.4 Effect of MAPK-ERK pathway inhibitors on the cell viability of CNE1 ±s，%

組別Cu2+組Cu2++SCH772984組t值P值細(xì)胞存活率未放射100.00 ± 2.66 99.94 ± 3.78 0.03 0.977 5 Gy放射69.56 ± 2.47 45.12 ± 3.83 3.14＜ 0.001

3 討論

放射治療是NPC 最主要的治療方式［2］，探索NPC 放療抵抗的機(jī)制不僅可以保證腫瘤局控率，還能夠減少正常組織的放射損傷［20］。既往研究顯示，Cu2+含量是調(diào)節(jié)腫瘤放射敏感性的重要因素。HSU 等［8］發(fā)現(xiàn)NPC 患者的血清銅水平明顯高于正常人，在放療期間和放療后血清銅水平下降。TESSMER 等［21］發(fā)現(xiàn)患者血清Cu2+水平與霍奇金淋巴瘤的放射治療效果密切相關(guān)，靶向Cu2+能有效降低腫瘤放射抵抗性。在肝細(xì)胞癌中，細(xì)胞內(nèi)Cu2+通過(guò)促進(jìn)銅相關(guān)蛋白的表達(dá)影響放射敏感性［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，NPC 細(xì)胞內(nèi)Cu2+水平較正常鼻咽上皮細(xì)胞顯著升高，且Cu2+含量與NPC 的放療抵抗性具有密切關(guān)系。然而，過(guò)量的Cu2+攝取也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。本研究發(fā)現(xiàn)NPC 細(xì)胞CNE1 在暴露于50 μmol/L 及以上的Cu2+時(shí)，會(huì)受到明顯的毒性作用。之前的研究［22］也表明，當(dāng)體內(nèi)的Cu2+含量過(guò)高，可能通過(guò)引發(fā)活性氧（ROS）的產(chǎn)生或抑制蛋白酶體的功能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除此之外，細(xì)胞內(nèi)Cu2+的積累還可能誘導(dǎo)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）自噬降解，進(jìn)而引發(fā)鐵死亡［23］。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了過(guò)量的Cu2+對(duì)細(xì)胞正常功能的影響，同時(shí)也為探索相關(guān)疾病的發(fā)生提供了新的視角。

此外，Cu2+水平的上升在促進(jìn)腫瘤氧化磷酸化和生長(zhǎng)、促進(jìn)血管生成及抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡中起著不可或缺的作用［24-26］。研究顯示，銅與腫瘤細(xì)胞中的多個(gè)信號(hào)通路相關(guān)。HE 等［27］發(fā)現(xiàn)Cu2+可以直接結(jié)合并激活受體酪氨酸激酶（RTK），促進(jìn)下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞遷移。Cu2+還能通過(guò)作用于PI3K-AKT 信號(hào)通路的數(shù)個(gè)不同分子引起下游激活［28］。此外，MAPK 信號(hào)通路的激活依賴(lài)于Cu2+。BRADY 等［29］證實(shí)Cu2+通過(guò)直接結(jié)合激活MAPK 激酶，促進(jìn)了下游ERK 的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成，突變MEK1 的銅結(jié)合位點(diǎn)可以抑制ERK 的激活，這與較早前TURKISH 等［30］的研究結(jié)果一致。ZHANG等［31］發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞對(duì)銅的攝取或使用特異性MAPK 抑制劑均可阻斷銅誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。這些研究表明，Cu2+可以通過(guò)激活MAPK-ERK 信號(hào)通路發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)。在本研究中，一系列的實(shí)驗(yàn)證明Cu2+能夠激活MAPK-ERK 通路，降低NPC 對(duì)放射線(xiàn)的敏感性。使用MAPK-ERK 通路抑制劑可以逆轉(zhuǎn)Cu2+介導(dǎo)的放療抵抗性。因此，降低NPC患者體內(nèi)Cu2+水平可能是增強(qiáng)其放射敏感性、預(yù)防局部殘留及復(fù)發(fā)的有效途徑。

隨著“銅死亡”這一新概念的提出及對(duì)其機(jī)制的深入研究，調(diào)節(jié)Cu2+水平已逐漸成為抗癌研究的新靶點(diǎn)［32］。體內(nèi)應(yīng)用銅螯合劑能夠直接降低Cu2+水平，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。CHAN等［33］對(duì)75例通過(guò)口服銅螯合劑四硫鉬酸鹽（TM）進(jìn)行銅耗竭治療的乳腺癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示銅耗竭治療組患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）和賴(lài)氨酰氧化酶樣蛋白2（LOXL-2）含量明顯下降。在小鼠乳腺癌模型中，經(jīng)TM 處理后的小鼠肺中的賴(lài)氨酸氧化酶（LOX）和膠原沉積均減少，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著下降。當(dāng)TM 用于聯(lián)合治療時(shí)，可顯著增強(qiáng)激酶抑制劑藥物對(duì)致癌信號(hào)通路的作用，尤其是MAPK 信號(hào)通路［29，34］。然而，目前大部分銅螯合劑均是采用全身給藥，容易導(dǎo)致體內(nèi)Cu2+濃度過(guò)低，產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，使用靶向銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或銅伴侶蛋白的藥物或許是更加安全的治療手段［35］，應(yīng)成為未來(lái)研究的重點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)Cu2+在正常鼻咽上皮細(xì)胞及NPC細(xì)胞中存在濃度差異，證實(shí)了在極量以?xún)?nèi)Cu2+能激活MAPK-ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)NPC 放療抵抗，這些發(fā)現(xiàn)為NPC 放療增敏治療提供了新的觀點(diǎn)。但本研究尚未在動(dòng)物模型中驗(yàn)證Cu2+對(duì)NPC放射敏感性的影響，對(duì)MAPK-ERK 通路在NPC 細(xì)胞中調(diào)控放射敏感性的具體作用機(jī)制仍未完全闡明，后續(xù)仍需更深層次的探索。此外，MAPK-ERK通路的激活不僅與細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)［17，36］，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)［37-38］。因此，后續(xù)研究可以綜合考量MAPK-ERK 通路的復(fù)雜調(diào)控作用，進(jìn)一步探索Cu2+促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，以期為臨床治療NPC 提供新的思路。

【Author contributions】HUANG Xiuting performed the experiments and wrote the initial draft of the paper. LIN Jie performed the experiments and data analysis. YE Xiaoxin and CAI Jiazuo performed the validation and revised the article. YUAN Yawei designed the study， interpreted the results and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.