拮抗CC趨化因子受體5信號誘導腫瘤細胞凋亡并調節腫瘤微環境抑制腫瘤生長

何偉 劉麗萍 卓靜薇 張小冬 楊通 馮巨濱

廣州醫科大學附屬第二醫院（廣州 510260）

長期以來，肺癌的發病率和病死率在各種惡性腫瘤中一直排在前列，盡管不斷有新的治療方法用于肺癌的治療，但患者的5 年生存率仍然不到15%［1］。因此，迫切需要進行更全面深入的研究來提高患者的預后。腫瘤的生長和轉移是一個多步驟而復雜的生物學過程，其中趨化因子發揮了十分關鍵的作用［2］。

趨化因子是一個包含各種可分泌蛋白質的大家族，它們通過與靶細胞表面的相應受體結合，調節各種與細胞歸巢、遷移相關的病理或生理過程［3］。在生理情況下，趨化因子和受體主要表達于免疫細胞、內皮或上皮細胞、纖維母細胞、角質細胞等表面，其主要作用就是維持機體內環境穩定［4］。近來，越來越多的研究顯示：腫瘤細胞也能夠過表達趨化因子或受體，以自分泌的方式促進腫瘤的存活、增殖、侵襲和轉移［5］。另外，高表達趨化因子的腫瘤細胞還能夠通過配受體相互作用招募表達相應受體的抑制性免疫細胞進入微環境，從而形成抑制性免疫微環境，進一步促進腫瘤的生長和轉移［6］。其中，CCR5 是研究最為廣泛的趨化因子之一。CCR5，也稱為CD195，是G 蛋白偶聯受體超家族成員之一，其主要的配體有3 個，即：CC 趨化因子配體3（CCL3）、CCL4、CCL5［7］。CCR5 與配體結合主要參與人類免疫缺陷病毒（HIV）感染，細胞增殖、遷移、血管生成和細胞存活等病理或生理過程［7］。近來許多研究顯示，腫瘤細胞可高表達CCR5 或其配體［3］，從而激活PI3K/AKT、NF-κB、ERK/MEK 和HIF-α 等信號通路，獲得無限增殖和永生化特性［7］。另外，癌細胞也可以利用CCR5 信號通路，誘導調節性T 細胞（Tregs）、髓系起源抑制細胞（MDSCs）、腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）等免疫抑制細胞異常遷移進入腫瘤微環境（TME），形成有利于癌細胞存活的環境［7-8］。然而，趨化因子在腫瘤發生發展中的作用才剛剛引起關注，很多問題尚未明確［9］。

本項目旨在檢測Maraviroc 拮抗CCR5 信號通路，對Lewis 小鼠肺腺癌細胞存活和增殖的影響，重點關注腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）和Treg 細胞的數量和比例的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體 CCK-8 試劑盒購自Dojindo公司。Maraviroc 由MedChem 公司提供。TSAPLus熒光雙染試劑盒、即用型DAPI 染色液、熒光猝滅劑、抗熒光淬滅封片劑以及AnnexinⅤ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。Alexa Fluor 488 和Alexa Fluor 594 聯結的重組兔抗小鼠CD4 和CD8 單抗、正常山羊血清和兔抗小鼠Foxp3 單抗購自Abcam 公司。兔抗小鼠CCR5 多抗來源于北京博奧森生物技術有限公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔/小鼠二抗購自基因科技有限公司。Trizol RNA分離試劑購自MRC（Molecular Research Center， Inc）。M-MLV逆轉錄酶由Promega提供。ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購自Vazyme Biotech 公司。Caspase 8（Cas8）基因引物序列如下［10］：正向：5'-TGAAGGACAGAAAAGGAACAA-3'；反向：5'-CTTGTTCACCGTGGGATAGATA-3'

1.2 動物和細胞株 Lewis 小鼠肺癌細胞株由廣州呼吸疾病研究所劉明教授惠贈，在添加10%胎牛血清（Gibco），100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養基（Hyclone）中，置于37℃，5% CO2的培養箱中傳代培養。4 周齡雄性C57BL/6 小鼠購買自廣州銳格生物科技有限公司，飼養于廣州永諾醫學實驗動物中心。所有動物實驗均獲得廣州永諾醫學實驗動物中心動物倫理委員會批準，并遵循實驗動物的護理和使用指南。

1.3 細胞毒性實驗 CCK-8實驗如之前所述［11］。收獲生長至70%匯合的Lewis 細胞，按1.0 × 104個/孔接種到96 孔板中培養12 h，然后去除上清液，加入含有5 μmol/L Maraviroc 或DMSO（對照組）的培養基繼續培養24、48、72、96、120、144、168 h。每孔設2 個復孔。在結束培養前4 h，去除上清液，加入含有10 μL CCK-8 溶液的110 μL 培養基，繼續孵育4 h。最后，用酶聯免疫測定儀在450 nm 處檢測每個孔的光密度（OD），并計算2 個復孔的平均OD值。實驗重復3 次。

1.4 凋亡檢測 按前述方法收獲細胞并接種到96孔板中培養12 h，然后除去上清，加入含有5 μmol/L的Maraviroc 或DMSO 的培養基繼續培養144 h 后，收獲細胞進行Annexin V 和PI 染色。使用MoFlo免疫細胞儀系統（Dako）進行流式分析，并使用FlowJo 軟件（TreeStar）分析數據。每孔設2 個復孔，實驗重復3 次。

1.5 RT-PCR 分析Cas8 基因表達 如前所述，將接種至96 孔板中的細胞用Maraviroc 或DMSO 處理144 h 后，收集細胞，分離總RNA，將含有2 μg 總RNA 和1 μg 引物的10 μL 無RNase 水加熱至75℃5 min，然后立即在冰上冷卻5 min。隨后加入反應緩沖液、dNTPs、無RNase 水和逆轉錄酶，將終體積為25 μL 的反應混合物在42 ℃下孵育60 min。在RT-PCR儀（ABI StepOnePlus）上定量分析Cas8基因的mRNA 水平。GAPDH 作為內參照。每孔設2 個復孔。實驗重復3 次。

1.6 同基因小鼠肺癌模型的建立 將1.0 × 106個Lewis 細胞皮下接種至每只小鼠的右側腹。保證所有小鼠只出現一個皮下腫瘤。一旦腫瘤直徑達到0.5 cm，將小鼠隨機分為兩組（每組4 只）。實驗組每2 d 腹腔內注射Maraviroc（30 mg/kg），對照組接受等體積的無菌PBS。每3 d 測量一次腫瘤大小，并根據以下公式計算腫瘤體積：體積=（長×寬2）/2。在第12 天處死所有小鼠，取出腫瘤塊，在室溫下置于4%緩沖的多聚甲醛中固定30 min，然后石蠟包埋。

1.7 免疫熒光染色 將石蠟包埋組織制成5 μm切片，然后脫蠟至水。按操作指南依次進行抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶后，用PBS 洗滌3 次，5 min/次。切片甩干后，滴加正常山羊血清封閉30 min。對于CCR5 和CD4 或CD8 雙染，以1∶1 000 稀釋加入CCR5 多抗以覆蓋組織切片，4℃ 孵育過夜。PBS 清洗3 次。然后滴加50 μL HRP 標記的抗兔二抗，RT 下孵育50 min。3 次清洗后，滴加50 μL TSA555（CD4 和CCR5 染色）或TSA488（CD8 和CCR5 染色）工作液，RT 避光孵育10 min，然后清洗3 次。為了去除已結合的一抗、二抗，將組織切片置于充滿檸檬酸鈉緩沖液的修復盒中，微波加熱至95 ℃，持續15 min。為進行第2 個一抗染色，以1∶200 稀釋加入Alexa-Fluo 聯結的CD4 或CD8 單抗，并如前所述進行孵育。然后PBS 清洗3 次，進行DAPI 細胞核復染和熒光猝滅。清洗甩干切片后封片。最后用BK6000-FL 熒光顯微鏡（重慶奧泰克）觀察免疫熒光。對于CCR5 和Foxp3雙染，將1∶1 000 稀釋的CCR5 多抗用作第1 個一抗，以HRP 標記的抗兔抗體用作二抗。TSA-488染色工作液作為熒光顯示劑。如前所述去除結合的一抗和二抗后，1∶500 稀釋的抗Foxp3 單抗和HRP 標記的抗兔抗體分別用作第2 個一抗和二抗。TSA-555 溶液為熒光顯示劑。其他步驟如前所述。采用Image J 軟件（1.53t，美國國立衛生研究院） 隨機選擇3 個200 倍放大視野測量陽性信號強度或面積。

1.8 統計學方法 所有數據均以均數±標準差表示。GraphPad Prism v.5.01 軟件用于繪圖和統計分析。采用雙側非配對Studentt檢驗對兩個均值進行比較。使用雙向方差分析比較相對細胞活力和腫瘤體積，然后進行Bonferroni 多重比較分析。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外阻斷CCR5 信號可能通過誘導凋亡來抑制Lewis 細胞的增殖 為了探討CCR5 拮抗劑對Lewis 細胞生長的體外影響，建立了Maraviroc 和Lewis 細胞共培養體系，數據表明：與對照組相比，從共培養后72 h 開始，Maraviroc 可明顯（P＜ 0.05）抑制Lewis 細胞的生長（圖1A）。接下來通過流式細胞術分析細胞凋亡。Annexin V 陽性細胞的百分比被用作評估凋亡的指標。見圖1B 和1C，在共培養144 h 后，與對照組相比，實驗組細胞凋亡增加了近3 倍（P＜ 0.001）。隨后基因表達分析顯示：Cas8 基因的表達增加了近3 倍（圖1D）。表明拮抗CCR5 可能通過增強凋亡誘導基因（如Cas8）的表達從而增強細胞凋亡來抑制Lewis 細胞的生長。

圖1 拮抗CCR5 信號可能通過誘導凋亡來抑制Lewis 細胞的體外增殖Fig.1 CCR5 blockade markedly inhibited the in vitro proliferation of Lewis lung cancer cells presumably by apoptosis induction

2.2 拮抗CCR5 信號在體內抑制Lewis 細胞的生長 為了闡明Maraviroc 對Lewis 細胞體內生長的影響，建立了肺癌同基因小鼠模型。見圖2B，實驗組小鼠的腫瘤生長明顯慢于對照組（P＜ 0.001）。在第12 天，測量瘤塊體積顯示：實驗組腫瘤平均體積明顯大于對照組（圖2A，P＜ 0.001）。表明Maraviroc 可抑制Lewis 細胞的體內生長。

圖2 拮抗CCR5 抑制Lewis 細胞的體內生長Fig.2 CCR5 blockade retarded the in vivo growth of Lewis lung cancer cells

2.3 拮抗CCR5 信號可增加TME 中CD4+和CD8+細胞的比例而減少Foxp3+細胞的比例 免疫熒光染色顯示：與對照組相比，實驗組瘤組織中發現了更高比例的CD4+細胞（圖3A-B，P= 0.016 4）和CD8+細胞（圖3C-D，P= 0.011 6）。而Foxp3+細胞的情況正好相反。對照組瘤組織中Foxp3+細胞比例反而比實驗組更高（圖3E-F，P= 0.004）。

圖3 拮抗CCR5 明顯增加腫瘤組織中CD4+和CD8+細胞比例及減少Foxp3+細胞比例Fig.3 CCR5 blockade induced more CD4+ and CD8+ cells but less Foxp3+ cells gathering in tumor tissues

3 討論

近年來，在癌癥診療領域出現的進展中，趨化因子和受體無疑是最具吸引力的發現之一。趨化因子及其受體最初被認為是許多正常生理過程的介質［12］。然而，最近發現許多腫瘤可異常表達趨化因子和（或）其受體，利用趨化因子信號通路支持自身的生長和進展［3］。其中，CCL5/CCR5 是研究最廣泛的配體/受體對之一。

CCL5，也稱為RANTES，是C-C 趨化因子配體5 的縮寫。雖然CCL5 可以與CCR1、CCR3、CCR4和CCR5 結合，但它對CCR5 的親和力最高。在過去的十年里，越來越多的研究數據表明：CCR5/CCL5 信號通路參與了腫瘤的發生、生長和轉移。一方面，腫瘤細胞具有異常升高的CCR5 和（或）CCL5 表達，以自分泌的方式促進腫瘤生存和進展［4］。另一方面，趨化因子的異常表達可以旁分泌的方式將抑制性免疫細胞募集到TME 中，從而導致腫瘤免疫逃逸［13］。TME 是指腫瘤細胞所處的內外環境，它是一種復雜的結構，由多種細胞類型和分子組成，如成纖維細胞、內皮細胞、周細胞、免疫細胞、生長因子、細胞因子和趨化因子等［14］。其中，趨化因子和受體是腫瘤細胞與其他細胞相互作用的主要信使之一。最近發現，一些抑制性免疫細胞，包括Tregs、MDSCs、TAMs 和癌癥相關成纖維細胞（CAFs）等，可高表達CCR5，通過與腫瘤細胞分泌的CCL5 相互作用，異常遷移至TME 中，從而形成免疫抑制環境，阻止腫瘤細胞被免疫系統識別和殺死［6］。

然而，由于趨化因子/受體網絡的復雜性，仍有太多細節未知。目前，CCL5/CCR5 信號軸在腫瘤發展中的作用仍然存在爭議。它既可以促進腫瘤生長，也可能具有抗腫瘤作用。例如在乳腺癌［15］和結直腸癌［16］中，就分別報道了CCR5 信號對腫瘤生長截然相反的影響。此外，研究人員認為：每種腫瘤都有其獨特的TME。結直腸癌和胰腺癌細胞通過分泌CCL5 將大量CCR5+Tregs 募集到TME中，以促進腫瘤侵襲和擴散［17-18］。而胃癌［19］或惡性黑色素瘤［7］的TME 中則發現高表達CCR5的MDSCs 大量積聚。TAMs［8］和TAFs［20］也可以利用CCL5/CCR5 信號通路，幫助形成免疫抑制性TME。但人們對肺癌的TME 卻知之甚少。筆者既往研究［11］表明：CXC 趨化因子受體4（CXCR4）及其特異性配體，CXC 趨化因子配體12（CXCL12），參與了肺癌細胞的增殖、遷移和血管生成，而有關TME 的情況尚不清楚。有研究［21］顯示：肺癌分子靶向治療的耐藥可能與TME 有關，而CCL5 表達與肺腺癌的低生存率相關，這表明：肺癌的TME影響了患者的療效，CCL5/CCR5信號可能通過TME參與肺癌的進展［22］。總之，在CCR5 靶向治療大規模用于臨床之前，還需要更多更深入的研究。

本研究采用小鼠Lewis 細胞作為模型，使用CCR5 選擇性抑制劑阻斷CCR5 的內在化和由此產生的信號轉導，發現可延遲Lewis細胞的生長。隨后FACS 和PCR 證明這可能是靶向CCR5 信號提高了Cas8 基因的表達而增強細胞凋亡的結果。因為該基因的表達和激活是細胞凋亡的重要啟動因子之一。但要注意的是，細胞凋亡是凋亡誘導和凋亡抑制基因共同作用的結果。本研究數據并沒有提供凋亡抑制基因如Bcl-2、Bcl-xL的表達情況。接下來，建立了具有免疫活性的同基因小鼠肺癌模型。本研究發現：拮抗CCR5 延緩了Lewis 癌腫的生長。由于在癌癥患者的腫瘤中發現Treg 細胞增加且與預后相關［23］，因此比較了腫瘤組織中CD4+、CD8+和Foxp3+細胞的百分比，結果發現：在阻斷組中有更多的CD4+和CD8+細胞，Foxp3+細胞則更少。考慮到CD4+和CD8+細胞主要由T淋巴細胞組成，因此可以推測：阻斷CCR5 信號增強了T 淋巴細胞對TME 的浸潤。同樣，Foxp3+細胞主要由Treg 細胞構成，這表明：拮抗CCR5 信號可能抑制了Treg 細胞在瘤組織中的聚集。綜上所述，可以合理地推測：拮抗CCR5信號可增加免疫效應細胞而減少免疫抑制細胞在瘤組織中的聚集，從而重塑腫瘤免疫微環境，激活抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長。TME 中的CD4+和CD8+細胞主要由T 淋巴細胞組成，被稱為TILs，在抗腫瘤免疫中起著關鍵作用。大多數Foxp3+細胞是Tregs，它是最常見的抑制性免疫細胞，對抗腫瘤免疫具有很強的抑制作用。正是基于此發現，推測：CCR5阻斷可能通過削弱TME的免疫抑制來激活抗腫瘤免疫。然而，應特別注意幾點：首先，除了T淋巴細胞外，CD4+細胞還包括少數具有免疫抑制作用的Treg。其次，更多的CD4+和CD8+細胞不一定代表更強的抗腫瘤免疫。Treg 減少并不意味著免疫抑制減弱。因此還需要對免疫細胞的功能進行研究。最后，除了Tregs，其他細胞，如TAM，也可能參與癌癥TME 的免疫抑制［24］。為了解決這些問題，還需要進行更深入和全面的研究。

在過去的二十年里，由于靶向治療和免疫檢查點抑制劑（ICIs）的出現，肺腺癌患者的預后顯著改善。但患者的5年生存率仍低于15%［1］。基于CCR5在癌癥發生和發展中的重要性，一些CCR5 拮抗劑已被測試用于治療某些類型的癌癥，如胰腺癌、乳腺癌、肝細胞癌等，并獲得了一些令人興奮的臨床前數據［6］。目前的研究為CCR5 拮抗劑作為一種新的靶向治療方法在肺腺癌中的未來臨床應用提供了支持性的臨床前數據。此外，雖然ICIs 免疫療法為包括肺癌在內的許多癌癥的治療帶來了突破，但癌細胞總是能夠進化出一些逃避宿主免疫系統攻擊的機制，即免疫逃避［25］。故此，只有一小部分癌癥患者可以從ICIs 療法中最終受益［26］。幸運的是，最近臨床前研究發現：CCR5 拮抗劑與ICIs 聯合可協同抑制胰腺癌［27］和結直腸癌［28］腫瘤的生長，這強烈提示：CCR5 拮抗劑可以在一定程度上逆轉腫瘤細胞對ICIs 的耐藥性，增強其療效。

綜上所述，本研究表明：拮抗CCR5 信號可以重塑肺腺癌的免疫微環境，這將為未來聯合CCR5拮抗劑和ICIs 治療肺癌的研究提供一個良好的開端。

【Author contributions】HE Wei and FENG Jubin conceived the experimental design and wrote the manuscript. HE Wei， LIU Liping，ZUO Jingwei， ZHANG Xiaodong and YANG Tong conducted the experiments. LIU Liping， ZUO Jingwei and ZHANG Xiaodong analyzed the obtained data. All authors read and approved the final manuscript.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.