circRNA SIPA1L1修飾牙髓干細(xì)胞來(lái)源外泌體促血管生成能力的機(jī)制

劉景 冷春濤 王艷

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院口腔科（烏魯木齊 830011）

牙髓病和根尖周病是兩種最常見的口腔疾病，通常是由于劇烈刺激如齲齒、意外創(chuàng)傷、醫(yī)源性感染等原因?qū)ρ浪柙斐刹豢赡鎿p傷［1-2］。牙髓是一種高度血管化和神經(jīng)支配的組織，位于剛性牙本質(zhì)壁內(nèi)，能夠執(zhí)行多種功能，例如提供營(yíng)養(yǎng)和通過(guò)礦化修復(fù)牙髓來(lái)改善神經(jīng)元敏感性［3］。因此，牙髓損傷會(huì)導(dǎo)致牙齒活力喪失，需要及時(shí)進(jìn)行牙髓治療。存在于牙髓組織中心的牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cell， hDPSC）在牙髓組織損傷修復(fù)中扮演重要角色，已成功應(yīng)用于牙髓再生［4］。然而，干細(xì)胞的體內(nèi)移植具有一定風(fēng)險(xiǎn)，例如誘導(dǎo)心肌梗死和促進(jìn)腫瘤發(fā)展，此外，其臨床應(yīng)用還面臨獲取、擴(kuò)增、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等因素的限制［5-7］。外泌體（exosome， Exo）是一種細(xì)胞外囊泡，其中包含多種信號(hào)分子，例如蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA 和脂質(zhì)等，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。此外，Exo 還具有與其親本細(xì)胞相似的生物學(xué)功能，由于其不增殖和低免疫原性［8-9］，在牙髓再生中具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種生物活性核酸分子，以閉環(huán)RNA 形式存在，屬于內(nèi)源性非編碼RNA。circRNA 參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞活動(dòng)和多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展，并通過(guò)協(xié)調(diào)多種分子和信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)牙髓再生［10-12］。信號(hào)誘導(dǎo)增殖相關(guān)蛋白1 樣蛋白1（SIPA1L1）是由人類14 號(hào)染色體上編碼circSIPA1L1 的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生，能夠促進(jìn)hDPSC的成骨分化［13］。然而，關(guān)于SIPA1L1 對(duì)牙髓血管生成是否具有促進(jìn)作用尚未明確。基于此，本研究通過(guò)將circSIPA1L1 轉(zhuǎn)染至hDPSC 后分離出Exo，觀察circSIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源的Exo 對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集我院口腔科2021 年8 月至2022 年6 月10 例患者因正畸治療拔除的恒牙，年齡在12 ～ 18 歲。在無(wú)菌條件下取離體牙的牙髓組織，進(jìn)行hDPSC 的分離培養(yǎng)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核與批準(zhǔn)實(shí)施（倫理批號(hào)：K-2021128）。

1.2 主要試劑 HUVEC 購(gòu)于武漢諾普賽生命科技有限公司，Ⅰ型膠原酶購(gòu)于無(wú)錫欣潤(rùn)生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素、胎牛血清、胰蛋白酶及DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，外泌體提取試劑盒購(gòu)于上海翌圣生物科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本Takara 公司，RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑液及硝酸纖維素膜購(gòu)于上海碧云天生物科技公司，血管生成載玻片購(gòu)于德國(guó)ibidi 公司，Matrigel 膠購(gòu)于美國(guó)BD 公司，抗體CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、CD9、HSP70、TSG101、VEGF、VEGFR2、PGF、GAPDH 及生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司。circSIPA1L1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體交由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)與合成。

1.3 方法

1.3.1 hDPSC 分離與培養(yǎng) 使用眼科剪將牙髓組織剪成約1 mm × 1 mm × 1 mm 的組織塊，移入無(wú)菌培養(yǎng)瓶底部，加入3% Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃、5% CO2條件下消化培養(yǎng)1 h，每10 min 取出晃動(dòng)1 次，加速消化過(guò)程。待組織徹底分散后，70 目過(guò)目篩，移入無(wú)菌離心管內(nèi)，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，在沉淀中加入含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每隔1 d 更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%以上時(shí)，0.25%胰酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)，期間通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記物表達(dá) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3 代hDPSC，0.25%胰酶消化，PBS 洗滌，以4 000 r/min離心5 min，將沉淀重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為6 × 106/mL，吸取100 μL 細(xì)胞懸液加到流式檢測(cè)管內(nèi)，接著在管內(nèi)依次加入10 μL的干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD105、CD90、CD73、CD45、CD34 抗體，室溫避光孵育30 min，再以4 000 r/min離心5 min，PBS 洗脫并重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面各標(biāo)記蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將hDPSC 按照每孔5 × 103個(gè)接種到96 孔板內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。將hDPSC 分為兩組，一組細(xì)胞正常培養(yǎng)，另一組轉(zhuǎn)染circSIPA1L1 過(guò)表達(dá)載體，具體根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書將circSIPA1L1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至hDPSC，轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 外泌體分離及表征鑒定 收集未轉(zhuǎn)染的hDPSC 和轉(zhuǎn)染circSIPA1L1 的hDPSC 于無(wú)菌離心管內(nèi)，4 ℃下以4 500 r/min 離心15 min，吸取上清，將此上清通過(guò)4 ℃、12 000 r/min離心20 min，再吸取上清。將獲得的上清與提取液A 混合，渦旋混勻，4 ℃下靜置過(guò)夜。次日，再在4 ℃下以12 000 r/min離心60 min，棄上清，保留沉淀，即為Exo，吸取保存液B 吹打沉淀將其重懸，置于-20 ℃冰箱保存。吸取Exo 樣品10 μL 加到銅網(wǎng)上，再加入磷鎢酸，吸去多余浮液，干燥后在透射電鏡下觀察形態(tài)，通過(guò)納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)直徑。

1.3.5 Western blot測(cè)定Exo標(biāo)志蛋白CD9、HSP70、TSG101 及HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF 蛋白表達(dá)水平 在Exo或HUVEC中加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA 蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。通過(guò)100 ℃金屬浴煮沸蛋白進(jìn)行變性處理，吸取等量20 μg 蛋白樣品上樣至凝膠孔內(nèi)，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離。結(jié)束后，160 mA 恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，浸入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，在Exo 標(biāo)志蛋白檢測(cè)中加入兔抗CD9、HSP70、TSG101 多克隆抗體，在HUVEC 蛋白樣品中加入兔抗VEGF、VEGFR2、PGF 多克隆抗體，抗體均按1∶1 000 稀釋，將膜與抗體共置于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。次日，取膜復(fù)溫，TBST 洗滌，加入對(duì)應(yīng)標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體，按照1∶5 000 稀釋，室溫下共孵育2 h，TBST 再次清洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑液顯色，曝光顯影后，進(jìn)行圖像掃描與分析，觀察Exo 各標(biāo)志蛋白條帶，并以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，Image Analyst 軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Exo中circSIPA1L1及HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF mRNA 表達(dá)水平 在Exo 或HUVEC 中加入Trizol 試劑提取總RNA，通過(guò)核酸微量測(cè)定儀檢測(cè)總RNA 濃度與純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系，合成底物cDNA。再通過(guò)qRT-PCR 法檢測(cè)Exo 中circSIPA1L1表達(dá)或HUVEC中VEGF、VEGFR2、PGF mRNA 表達(dá)，參照SYBR Green 法qRT-PCR 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，配制20 μL 的反應(yīng)體系，在Bio-Rad CFX96 系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置兩步法PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火/延伸30 s，循環(huán)40 次。重復(fù)操作3 次，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法分析各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將凍存的HUVEC 經(jīng)過(guò)37 ℃水浴復(fù)蘇，添加含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組與處理具體如下：（1）對(duì)照組，使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC；（2）hDPSC Exo 組，在培養(yǎng)基中添加50 μL hDPSC 來(lái)源的Exo 培養(yǎng)HUVEC；（3）circ-SIPA1L1-hDPSC Exo 組，在培養(yǎng)基中添加50 μL 轉(zhuǎn)染circSIPA1L1 的hDPSC 來(lái)源的Exo 培養(yǎng)HUVEC。置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h 后收集各處理組HUVEC，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 Matrigel 基質(zhì)膠血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC血管形成能力 將Matrigel 膠放入4 ℃冰箱過(guò)夜融化，吸取10 μL 加到血管生成載玻片上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)待膠凝固。將各處理組HUVEC 濃度調(diào)整為2 × 105個(gè)/mL，吸取50 μL 細(xì)胞懸液接種于鋪好Matrigel 膠的玻片孔內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察成管情況，采集培養(yǎng)24 h 的圖像，并對(duì)管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析均使用Graph-Pad Prism 7.0 軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析法，組間兩兩比較分析采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hDPSC 培養(yǎng)與鑒定結(jié)果 通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察到，培養(yǎng)3～5 d 后細(xì)胞從組織塊周圍邊緣爬出，呈集落式生長(zhǎng)，形態(tài)為長(zhǎng)梭形或紡錘樣。10 d 后細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)滿瓶底，似成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞呈旋渦狀排列。見圖1。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果顯示，CD105、CD90、CD73 呈陽(yáng)性表達(dá)，CD45與CD34 呈陰性表達(dá)，見圖2。以上結(jié)果均符合hDPSC 特征，說(shuō)明成功分離培養(yǎng)到hDPSC。

圖2 hDPSC 表面標(biāo)志物表達(dá)水平Fig.2 Expression level of hDPSC surface markers

2.2 含circRNA SIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源Exo鑒定結(jié)果 從未轉(zhuǎn)染的hDPSC 與轉(zhuǎn)染circSIPA1L1的hDPSC 中分離的顆粒物均為橢圓形，呈囊泡狀，直徑分布在45 ～ 135 nm，見圖3A、3B。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，從未轉(zhuǎn)染的hDPSC 與轉(zhuǎn)染circ-SIPA1L1 的hDPSC 中分離的顆粒物中均檢測(cè)到Exo 表面標(biāo)志蛋白CD9、HSP70 及TSG101 蛋白明顯表達(dá)，見圖3C。以上結(jié)果表明，成功分離到hDPSC 來(lái)源的Exo 與轉(zhuǎn)染circSIPA1L1 的hDPSC 來(lái)源的Exo。且qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，hDPSC Exo和circSIPA1L1-hDPSC Exo 中的circSIPA1L1相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.05、2.45 ± 0.26，circSIPA1L1-hDPSC Exo 中的circSIPA1L1 相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（t= 27.478，P＜ 0.001）。

圖3 Exo 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of Exo

2.3 含circ SIPA1L1修飾hDPSC 來(lái)源Exo對(duì)HUVEC 血管生成的影響 鏡檢觀察各組HUVEC 血管生成情況，3 組管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)目之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 157.846，P＜ 0.001）。hDPSC Exo 組HUVEC 的管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)目顯著多于對(duì)照組（P＜ 0.05）；circSIPA1L1-hDPSC Exo 組HUVEC的管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)目又顯著多于hDPSC Exo 組（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 各組HUVEC 管形成情況比較Fig.4 Comparison of HUVEC tube formation in each group

2.4 含circ SIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源Exo 對(duì)HUVEC 中VEGF、VEGFR2 及PGF 表達(dá)水平的影響 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，3 組HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 74.521、54.228、49.576，P＜ 0.001）。與對(duì)照組比較，hDPSC Exo 組HUVEC中VEGF、VEGFR2以及PGF mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜ 0.05）；與hDPSC Exo組比較，circSIPA1L1-hDPSC Exo組HUVEC中VEGF、VEGFR2、PGF mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步顯著上調(diào)（P＜ 0.05），見圖5。

圖5 各組HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF mRNA 表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of mRNA expression levels of VEGF， VEGFR2 and PGF in HUVEC in each groups

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，3 組HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF 的蛋白相對(duì)表達(dá)量之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 42.157、39.442、32.058，P＜ 0.001）。hDPSC Exo組HUVEC中VEGF、VEGFR2、PGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）；circSIPA1L1-hDPSC Exo 組HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步又顯著高于hDPSC Exo 組（P＜ 0.05），見圖6。

圖6 各組HUVEC 中VEGF、VEGFR2、PGF 蛋白表達(dá)水平比較Fig.6 Comparison of protein expression levels of VEGF， VEGFR2 and PGF in HUVEC in each groups

3 討論

牙髓疾病的傳統(tǒng)治療方法為根管治療，該方法是基于受感染的牙髓切除和生物惰性材料進(jìn)行根管填充，但會(huì)導(dǎo)致牙齒失活，更容易再次感染和發(fā)生牙折［14］。隨著學(xué)者們對(duì)牙髓病學(xué)的深入研究，再生牙髓病學(xué)的出現(xiàn)被認(rèn)為是牙齒保護(hù)和活化的前瞻性方法，該方法能夠通過(guò)組織學(xué)技術(shù)產(chǎn)生或形成新組織代替壞死牙髓組織，以達(dá)到重建牙髓的目的，與傳統(tǒng)根管治療相比優(yōu)勢(shì)更為明顯［15］。然而，由于根管結(jié)構(gòu)的特殊性，血管網(wǎng)絡(luò)再生成為牙髓再生中面臨的一大難題。牙髓血管能夠?yàn)檠浪杞M織輸送氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并清除代謝產(chǎn)物，對(duì)于維持正常的牙髓組織功能非常關(guān)鍵。因此，探究促進(jìn)或提高牙髓血管再生的策略對(duì)于牙髓疾病治療具有重大意義。

Exo 作為旁分泌機(jī)制中的關(guān)鍵元素，表現(xiàn)出良好的安全性和穩(wěn)定性，其中所含的復(fù)雜貨物可以反映親本細(xì)胞的狀態(tài)，以上這些特點(diǎn)均使其成為一種極具潛力的再生治療工具。此外，已有大量研究報(bào)道指出，hDPSC 來(lái)源的Exo 在多種牙齒疾病中起到治療效果，例如，SHEN 等［16］的研究表明了hDPSC 來(lái)源的Exo 摻入殼聚糖凝膠通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞從促炎表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡妆硇停瑥亩种蒲乐苎装Y并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來(lái)改善小鼠牙周病變；GANESH 等［17］研究指出hDPSC 來(lái)源的Exo 促進(jìn)了細(xì)胞增殖和遷移，增強(qiáng)了血管生成標(biāo)志物的表達(dá)，對(duì)牙髓再生具有顯著的治療潛力；SHIMIZU等［18］研究發(fā)現(xiàn)hDPSC 來(lái)源的Exo 能夠刺激hDPSC和小鼠成骨細(xì)胞的遷移，有效減輕牙周炎引起的骨質(zhì)流失；ZENG 等［19］的研究還說(shuō)明hDPSC 來(lái)源的Exo 能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖的抑制作用，并抑制細(xì)胞凋亡與降低促炎細(xì)胞因子釋放的能力。此外，在炎癥環(huán)境下，hDPSC來(lái)源的Exo 具有較強(qiáng)的促血管生成作用［20］。這些結(jié)果均提示，hDPSC 來(lái)源的Exo 在生物組織工程牙髓治療及血管再生中發(fā)揮積極作用。本研究成功從牙髓組織中分離出類成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，且CD105、CD90、CD73 呈陽(yáng)性表達(dá)，CD45、CD34 呈陰性表達(dá)，表明該細(xì)胞為hDPSC；并從未轉(zhuǎn)染的hDPSC 與轉(zhuǎn)染circSIPA1L1 的hDPSC 中分離出橢圓形的囊泡狀顆粒物，檢測(cè)到直徑分布在45 ～ 135 nm，Exo 標(biāo)志蛋白CD9、HSP70、TSG101均高表達(dá)，以上結(jié)果說(shuō)明成功獲得hDPSC 來(lái)源的Exo。

circRNA 參與各種生理和病理過(guò)程，也與血管生成密切相關(guān)。circRNA-001175 能夠抑制高糖誘導(dǎo)下HUVEC 活性的降低，減少HUVEC 凋亡，并促進(jìn)HUVEC 的管樣結(jié)構(gòu)形成能力［21］；circGSE1 可以在體外促進(jìn)衰老內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及管形成，此外，在股動(dòng)脈結(jié)扎和缺血的小鼠模型中，circGSE1 能夠促進(jìn)衰老小鼠缺血肢體的血流恢復(fù)和血管生成能力［22］。然而，關(guān)于circRNA 在牙髓再生中血管形成的作用研究報(bào)道卻相對(duì)較少。由于血管系統(tǒng)重建是營(yíng)養(yǎng)和氧氣運(yùn)輸?shù)南葲Q條件，因此血管生成對(duì)于牙髓再生中至關(guān)重要。血管生成是一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的過(guò)程，涉及幾個(gè)重要步驟，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管形成，此外，該過(guò)程受到多種血管生成生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)［23］。其中，VEGF是最有效和特異性的血管生成因子，可促進(jìn)血管舒張，增加血管通透性，并誘導(dǎo)毛細(xì)血管形成［24］。VEGF 的生物學(xué)功能主要通過(guò)其受體VEGFR2 所介導(dǎo)，VEGF 與VEGFR2 結(jié)合導(dǎo)致VEGFR2 酪氨酸磷酸化，隨后招募關(guān)鍵蛋白和激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)通路，以誘導(dǎo)多種血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［25］。PGF 是VEGF 超家族的成員，通過(guò)與VEGFR1 的結(jié)合阻斷了VEGFA 與該受體的結(jié)合，從而增強(qiáng)了VEGFA 與VEGFR2 的結(jié)合，產(chǎn)生更有效的促血管生成信號(hào)［26］。本研究結(jié)果顯示，相較于hDPSC來(lái)源的Exo，經(jīng)過(guò)circSIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源的Exo 顯著促進(jìn)了HUVEC 的管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)目，并提高了VEGF、VEGFR2 及PGF 的表達(dá)水平。

綜上所述，本研究成功分離到circSIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源的Exo，并表明了circSIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源的Exo 對(duì)于HUVEC 血管生成具有促進(jìn)效應(yīng)，該作用可能是通過(guò)上調(diào)VEGF、VEGFR2 及PGF 表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，這為牙髓修復(fù)重建提供了新見解。然而，本實(shí)驗(yàn)只是從體外初步驗(yàn)證了circSIPA1L1 修飾hDPSC 來(lái)源的Exo 的促血管生成能力，其在體內(nèi)牙髓再生中是否也發(fā)揮同樣作用有待后續(xù)進(jìn)行研究。

【Author contributions】LIU Jing designed this study and conducted experiments and wrote an article. LENG Chuntao and WANG Yan conducted experiments and made revisions to the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.