基于單細(xì)胞測(cè)序分析膿毒癥早期血小板數(shù)量和功能變化

王仙琦 張斌 張琪 代錚 張錦鑫 梁曉麗 李琳 吳林 劉善收

1空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科（西安 710032）；2西安市秦皇醫(yī)院急診科（西安 710699）

膿毒癥是因感染引起宿主炎癥反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，是急診科和重癥醫(yī)學(xué)科常見且高致死率的病種［1］。全球范圍每年膿毒癥相關(guān)死亡病例為1 100萬，占全部死亡人數(shù)的19.7%［2］，重癥患者病死率高達(dá)55.7%［3］；國內(nèi)醫(yī)院ICU膿毒癥患者病死率達(dá)35.5%［4］。最新專家共識(shí)強(qiáng)調(diào)在膿毒癥早期積極治療預(yù)防多臟器功能衰竭［5］，要求醫(yī)生認(rèn)真梳理膿毒癥發(fā)病早期的臨床特征，篩選不良預(yù)后的高危因素預(yù)警危重患者，有效提升膿毒癥治療效果。

膿毒癥早期最顯著的病理特征是固有免疫細(xì)胞活化釋放炎癥因子有助于殺滅病原菌，但過度應(yīng)激時(shí)免疫細(xì)胞死亡釋放大量損傷分子相關(guān)模式（DMAPs）致內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起血小板黏附聚集形成微血栓，誘發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）甚至多臟器功能衰竭［6］。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)血小板減少與膿毒癥患者病死率相關(guān)［7-8］，此外，血小板還可能介導(dǎo)白細(xì)胞功能參與機(jī)體免疫應(yīng)答［9-10］。以前受限于技術(shù)手段，膿毒癥早期血小板內(nèi)核心分子表達(dá)量和功能變化尚未完全闡明；近年學(xué)者們開始借助單細(xì)胞高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)分析疾病狀態(tài)下血小板的病理變化［11-12］。

本課題首先建立膿毒癥單病種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行前瞻性病例對(duì)照研究，比較不同預(yù)后組患者疾病早期的臨床特征，篩選死亡相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然后，采集健康志愿者和膿毒癥患者外周靜脈血，分選富含白細(xì)胞和血小板的樣本做單細(xì)胞高通量測(cè)序；然后，借助生物信息學(xué)技術(shù)，分析膿毒癥早期血小板內(nèi)分子表達(dá)量和核心功能的變化，為膿毒癥精準(zhǔn)治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 倫理聲明 本課題臨床實(shí)驗(yàn)遵守《赫爾辛基宣言》，研究獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：KY20212172 和NCT05229328）；單細(xì)胞測(cè)序組受試者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。質(zhì)控員負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)管理，全程督導(dǎo)并協(xié)調(diào)落實(shí)受試者權(quán)益。為控制誤差偏倚，對(duì)患者采取同質(zhì)化治療，組織學(xué)習(xí)最新膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療規(guī)范［13-14］。

1.2 膿毒癥納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 國內(nèi)外指南尚未明確定義“膿毒癥早期”，一般指炎癥反應(yīng)明顯但尚未出現(xiàn)多臟器功能衰竭的早期階段，常為發(fā)病后數(shù)小時(shí)至數(shù)天。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）膿毒癥 =感染+ 序貫器官衰竭評(píng)分（SOFA） ≥ 2；（2）出現(xiàn)感染癥狀 ＜ 72 h，診斷時(shí)間 ＜ 24 h；（3）18 ～ 80 歲，簽署知情同意書；（4）無嚴(yán)重慢性疾病史（硅沉著病、心功能不全Ⅲ-Ⅳ級(jí)、腫瘤、血液疾病或免疫疾病等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期、哺乳期或新發(fā)現(xiàn)的腫瘤患者；（2）3 個(gè)月內(nèi)服用免疫和凝血功能類藥物；（3）各種原因?qū)е轮委熤袛嗷蛑型就顺稣撸唬?）隨訪脫失（90 d）或資料不全。

1.3 患者臨床特征數(shù)據(jù)采集 臨床科研專職人員負(fù)責(zé)患者入組，收集空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科收治的膿毒癥患者臨床數(shù)據(jù)，包括一般信息、入室生理指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指標(biāo)、疾病評(píng)分（SOFA、NEWS）及90 d預(yù)后。2021年1月至2023年6 月期間共收治605 例，納入257 例，排除30 例，失訪3 例，最終224 例患者入組。男145 例（64.7%），女79 例（35.3%）；感染部位以呼吸系統(tǒng)為主151 例（67.4%），其次為消化系統(tǒng)44 例（19.6 %），泌尿生殖系統(tǒng)27 例（12.1 %），神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚軟組織感染較少，各1 例。139 例（62.1%）患者病情危重入住監(jiān)護(hù)室；發(fā)病90 d 隨訪，158 例（70.5%）存活，66 例（29.5%）死亡，不同預(yù)后組患者的臨床特征比較見表1。

表1 不同預(yù)后組膿毒癥患者疾病早期臨床特征的比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics of sepsis patients in the early stages between different prognostic groups M（P25，P75）

1.4 外周靜脈血采集和處理 自肘靜脈采集健康者和膿毒癥患者血樣8 mL，顛倒混勻后轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離管中（DAKEWE 生物技術(shù)公司，深圳，中國）。室溫下離心15 min（400g），分為3 層：血漿位于上層；白細(xì)胞和血小板位于中層；紅細(xì)胞和分離液在下層。

1.5 單細(xì)胞RNA 測(cè)序 外周血細(xì)胞樣本送至廣州基迪奧生物技術(shù)公司行單細(xì)胞測(cè)序。簡(jiǎn)要步驟：（1）采用10×基因組學(xué)測(cè)序儀（Illumina Novaseq 6000）進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建基因文庫。（2）細(xì)胞注釋分群，篩選疾病組與健康組血小板差異基因（倍數(shù)變化≥ 2 倍且P＜ 0.05）。（3）借助GO 術(shù)語和KEGG 信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集，分析疾病早期血小板功能改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 28.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，借助GraphPad Prism 9.0繪圖。首先采用Kolmogorov-Smirnov對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，Mann WhitnyU檢驗(yàn)比較組間差異；正態(tài)數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。多因素logistic回歸分析膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素，ROC 工作曲線檢測(cè)預(yù)測(cè)效能。P＜ 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)后組患者疾病早期臨床特征及死亡高危因素分析 死亡組患者早期心率、呼吸頻率、NEWS 評(píng)分、SOFA 評(píng)分、血漿總膽紅素、肌酐和乳酸較存活組顯著增高；平均動(dòng)脈壓和血小板計(jì)數(shù)則降低。將上述9 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸（向后法）分析死亡的危險(xiǎn)因素，結(jié)果血乳酸、SOFA、平均動(dòng)脈壓和血小板計(jì)數(shù)進(jìn)入回歸方程，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。采用ROC 曲線評(píng)估預(yù)測(cè)效能，血乳酸、SOFA、血小板計(jì)數(shù)和平均動(dòng)脈壓的ROC 曲線下面積（AUC）分別為0.85、0.73、0.71 和0.69；血小板計(jì)數(shù)+血乳酸+SOFA三因素聯(lián)合預(yù)測(cè)時(shí)AUC = 0.89。

表2 Logistic 回歸納入臨床指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)及其ROC 曲線指標(biāo)Tab.2 Statistical parameters and ROC curve indicators for clinical indicatorsthat included in logistic regression

2.2 單細(xì)胞測(cè)序組受試者的臨床特征 為系統(tǒng)分析膿毒癥時(shí)血小板功能的變化，課題組收集3 例健康志愿者和3 例膿毒癥早期患者的外周血細(xì)胞樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。3 例膿毒癥患者感染部位及病原微生物培養(yǎng)結(jié)果：病例1 系雙下肺感染，痰培養(yǎng)見銅綠假單胞菌生長(zhǎng)；病例2 為胰腺炎合并左下肺感染，痰培養(yǎng)和血培養(yǎng)均回報(bào)大腸埃希菌；病例3 系急性腎盂腎炎，尿液培養(yǎng)見大腸埃希菌生長(zhǎng)。獲得細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，主管醫(yī)生從早期經(jīng)驗(yàn)性治療轉(zhuǎn)為敏感抗生素的精準(zhǔn)治療，90 d 隨訪均存活。

2.3 細(xì)胞注釋分群及其膿毒癥時(shí)差異基因數(shù)量借助標(biāo)志性分子對(duì)細(xì)胞注釋分為6 群，單核細(xì)胞-CD14/CD16/CD68/CD163/CSF1R/S100A12；樹突狀細(xì)胞-CD11b/CD11c/CD15/CD83/CLEC4C/CD83/LYZ；中性粒細(xì)胞-S100A8/S100A9；B 細(xì)胞-CD19/CD79a/CD79b/BLNK/MS4A1；T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）-CD3d/CD3e/CD8a/CD27/CD28/NKG7/GZMB；血小板-CD41/CD42a/CD61（圖1）。重點(diǎn)關(guān)注參與固有免疫反應(yīng)的炎性細(xì)胞（單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）以及與凝血功能密切相關(guān)的血小板，發(fā)現(xiàn)膿毒癥早期固有免疫細(xì)胞數(shù)量占比較健康組顯著升高（2.15∶1）；與之相反，血小板數(shù)量占比則顯著下降（0.31∶1）。

圖1 細(xì)胞注釋分群及膿毒癥早期各細(xì)胞亞群差異基因數(shù)量Fig.1 Annotation and grouping of cells using biomarkers and the number of differentially expressed genes in various cell subpopulations during early sepsis

比較各亞群細(xì)胞膿毒癥早期較健康狀態(tài)時(shí)顯著差異的基因數(shù)量，單核細(xì)胞差異基因最多1 969 種，其次為血小板（1 872 種）和中性粒細(xì)胞（1 798 種），再次為T 細(xì)胞NK 細(xì)胞和B 細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞差異基因數(shù)量最少為536種（圖1）。

2.4 血小板標(biāo)志分子的特異性分析 本研究將ITGA2B（CD41）、GP9（CD42a）和ITGB3（CD61）作為血小板的標(biāo)志性分子，聯(lián)合診斷能較好地注釋血小板使其獨(dú)立成群。上述3 種分子在血小板特異性豐度表達(dá)，且膿毒癥時(shí)血小板內(nèi)表達(dá)量進(jìn)一步顯著上調(diào)；與之不同，無論在健康組還是膿毒癥組受試者，CD41/CD42a/CD61 在外周血各類型免疫細(xì)胞中的表達(dá)量均極低，圖2。以上提示CD41/CD42a/CD61 可作為血小板的特異性標(biāo)志分子。

圖2 血小板標(biāo)志分子（CD41/CD42a/CD61）特異性的分析Fig.2 Analysis of the specificity of platelet marker molecules（CD41/CD42a/CD61）

2.5 膿毒癥時(shí)血小板內(nèi)表達(dá)量顯著差異的基因膿毒癥時(shí)，血小板內(nèi)771 種基因顯著上調(diào)，按照差異顯著性依次為HPSE、TIMP1、CLEC1B、PF4、HBB、S100A8、PPBP、ZYX、SELP 和FCGR2A；1101種基因顯著下調(diào)，按照差異顯著性依次為EEF1A1、RPS3、TXNIP、RPS6、CD3E、H3-3B、PTPRC、IL32、GZMA 和IFITM1（圖3）。其中ZYX、SELP和PTPRC與細(xì)胞黏附功能密切相關(guān)；PF4、PPBP 和IL32 是細(xì)胞因子互作以及趨化作用相關(guān)信號(hào)通路的核心分子；CLEC1B、S100A8 和IFITM1 參與免疫功能調(diào)節(jié)；FCGR2A 和RPS3 與致病性大腸桿菌感染相關(guān)。

圖3 膿毒癥時(shí)血小板內(nèi)表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào)的基因Fig.3 Genes significantly up-regulated and down-regulated in platelets during sepsis

2.6 血小板差異基因的功能富集分析 課題組借助生物信息學(xué)分析技術(shù)，進(jìn)一步探索了膿毒癥發(fā)病早期血小板的功能變化情況。差異基因富集的TOP-20 信號(hào)通路多與人類疾病相關(guān)（8 條），其次為器官系統(tǒng)變化（7 條），4 條為基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路，另外包括1 條涉及機(jī)體代謝功能的信號(hào)通路（圖4）。

圖4 膿毒癥時(shí)血小板差異基因富集的信號(hào)通路（TOP-10）Fig.4 Signal pathways enriched with differentially expressed genes in platelets during sepsis （TOP-10）

GO 功能分析提示膿毒癥早期血小板差異基因富集于多種凝血相關(guān)功能（血小板生成、活化、脫顆粒、聚集以及凝血過程），并且還與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)（固有免疫反應(yīng)、白細(xì)胞黏附、趨化作用、淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)菌感染應(yīng)答），見圖5。KEGG 功能富集進(jìn)一步提示膿毒癥早期血小板參與細(xì)胞氧化磷酸化、白細(xì)胞趨化、抗原提呈和腸道感染相關(guān)信號(hào)通路，此外血小板還參與鐵死亡以及焦亡相關(guān)的NOD 樣受體信號(hào)通路（圖5）。以上功能分析提示膿毒癥早期血小板介入凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及炎性細(xì)胞病理性死亡。

圖5 膿毒癥早期血小板差異基因GO 和KEGG 功能富集分析（列出通路均P ＜ 0.05）Fig.5 Functional enrichment analysis of GO and KEGG for differentially expressed genes in platelets during early sepsis（P ＜ 0.05 for all pathways listed）

3 討論

膿毒癥發(fā)病率高病情進(jìn)展快，本組224 例患者中62.1%需要入住監(jiān)護(hù)室進(jìn)行治療，90 d 病死率為29.5%，稍低于國內(nèi)多中心調(diào)查數(shù)據(jù)（35.5%）［4］。提示膿毒癥目前仍是急診科和重癥醫(yī)學(xué)科醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)，需要認(rèn)真開展真實(shí)世界臨床研究，尋找膿毒癥疾病早期與死亡相關(guān)的高危因素，預(yù)警危重病例并及時(shí)給予加強(qiáng)監(jiān)護(hù)治療，阻斷疾病進(jìn)展為多臟器功能衰竭，從而有效改善患者預(yù)后。

本研究不同預(yù)后組患者發(fā)病早期的9 項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高乳酸、高SOFA、低平均動(dòng)脈壓和低血小板計(jì)數(shù)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；血乳酸的預(yù)測(cè)效能較好，乳酸+SOFA+血小板計(jì)數(shù)三者聯(lián)合診斷時(shí)效能更高。血乳酸增高是因微循環(huán)灌注不足，細(xì)胞缺血缺氧所致，血乳酸被推薦為評(píng)估膿毒癥病情嚴(yán)重程度和指導(dǎo)臨床治療的核心指標(biāo)［15-16］。多項(xiàng)研究證實(shí)高乳酸血癥與患者高病死率密切相關(guān)［17-18］，這也與本研究結(jié)果一致。

本課題借助單細(xì)胞測(cè)序和生信分析技術(shù)，鑒定出CD41、CD42a 和CD61 特異性豐度表達(dá)于血小板，且膿毒癥時(shí)含量進(jìn)一步顯著上調(diào)，可以作為血小板的標(biāo)志性分子。CD41 又名ITGA2B，中文名稱整合素α2b，通過調(diào)節(jié)血小板聚集在血液凝固過程中起著至關(guān)重要的作用，可用做鑒別血小板來源外泌體［19］。CD42a 又名GP9，中文名稱血小板膜糖蛋白IX，該基因缺陷時(shí)血小板形態(tài)異常增大且功能障礙，臨床患者有出血傾向。Martins 將CD42a 作為標(biāo)志分子，借助共聚焦激光掃描顯微鏡觀察癌細(xì)胞攝取血小板的過程［20］。CD61 又名ITGB3，中文名稱整合素亞單位β3，參與細(xì)胞黏附以及細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)，該基因缺陷將導(dǎo)致血小板無力癥［21］。此外，CD41、CD42a 和CD61 抗體常被用作流式細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)來探索疾病狀態(tài)下血小板功能變化［22-23］。

本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥早期血小板占比較健康組顯著降低（0.31∶1）；血小板內(nèi)差異基因數(shù)量與主要固有免疫細(xì)胞內(nèi)差異基因數(shù)量相當(dāng)（單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）。血小板內(nèi)顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因包括介導(dǎo)細(xì)胞黏附、趨化作用和免疫應(yīng)答等重要功能的核心分子。進(jìn)一步探索差異基因富集的TOP-20 信號(hào)通路，與人類疾病、器官功能變化和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；GO 和KEGG 功能分析提示膿毒癥早期血小板密切參與凝血級(jí)聯(lián)、免疫應(yīng)答以及免疫細(xì)胞死亡等重要的病理變化，以上病理過程均消耗外周血小板導(dǎo)致其數(shù)量顯著減少。

膿毒癥炎癥應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞死亡，引發(fā)免疫抑制或二次感染造成不良預(yù)后。近年，膿毒癥時(shí)免疫細(xì)胞內(nèi)多種死亡相關(guān)分子上調(diào)和死亡信號(hào)通路激活引起學(xué)者對(duì)免疫細(xì)胞程序性死亡的關(guān)注，包括焦亡、鐵死亡、自噬和胞外陷阱相關(guān)細(xì)胞死亡（METosis/NETosis）［24-25］。膿毒癥早期巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在血小板介導(dǎo)下變得扁平，細(xì)胞膜破裂胞內(nèi)染色質(zhì)、組蛋白和細(xì)胞質(zhì)成分被擠壓成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即胞外陷阱網(wǎng)（METs/NETs），能夠捕獲并殺死病原菌；然而，BOE 和YIPP 研究指出胞外陷阱網(wǎng)殺菌時(shí)細(xì)胞裂解成游離DNA 和組蛋白而死亡，即METosis/NETosis，釋放的DNA 和組蛋白是DAMPs 的主要來源［26-27］，激活凝血引發(fā)DIC 和MODS［28］。多項(xiàng)研究提示血小板介導(dǎo)的METosis/NETosis 與免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)［29］，在膿毒癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

總之，本研究通過臨床前瞻性病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥早期血小板計(jì)數(shù)減少是不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；借助先進(jìn)的單細(xì)胞高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)，鑒定出CD41/CD42a/CD61 是血小板的標(biāo)志分子；并發(fā)現(xiàn)疾病早期血小板不僅介導(dǎo)細(xì)胞黏附和凝血級(jí)聯(lián)，還參與免疫細(xì)胞趨化、炎性應(yīng)答和細(xì)胞病理性死亡等功能變化。不足之處：臨床研究為單中心，僅是觀察性研究；單細(xì)胞測(cè)序納入病例數(shù)較少，未開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。因此，有必要開展多中心隨機(jī)對(duì)照性研究進(jìn)一步證實(shí)疾病早期血小板計(jì)數(shù)與膿毒癥預(yù)后的關(guān)系；需要更深入的基礎(chǔ)研究繼續(xù)探索膿毒癥早期血小板核心功能變化并開發(fā)相關(guān)靶向治療策略。

【Author contributions】WANG Xianqi performed the experiments and wrote the article. ZHANG Bin， ZHANG Qi， DAI Zheng， ZHANG Jinxin， and LIANG Xiaoli performed the experiments. LI Lin and WU Lin revised the article. LIU Shanshou designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.