未足月胎膜早破孕婦血清中miR-223-3p的表達水平及臨床意義

胡玉瑩 朱錦明 劉潔 潘亞文 張倩 馮錦秋

1徐州醫科大學（江蘇徐州 221006）；2徐州醫科大學附屬徐州婦幼保健院（江蘇徐州 221009）

孕婦分娩前發生的胎膜的自發性破裂即胎膜早破（premature rupture of membranes， PROM），根據破膜時間可分為足月胎膜早破（time-premature rupture of fetal membranes， TPROM）和未足月胎膜早破（pre-premature rupture of fetal membranes，PPROM）［1］。PROM 發生的原因有很多，其中與感染有關的胎膜早破占60%以上［2］。病原體感染胎盤的絨毛膜羊膜導致的炎癥性疾病即絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis， CA），是臨床胎膜早破、早產及母兒圍生期感染的重要病因，可分為組織學絨毛膜羊膜炎（his-tological chorioamnionitis， HCA）及臨床絨毛膜羊膜炎，HCA 是一種發病隱匿的炎癥，往往導致新生兒發病率和病死率的增加［3-4］。研究［5］表明未足月胎膜早破感染率明顯高于足月胎膜早破，母嬰結局明顯較足月胎膜早破差。因此，尋找一個與炎癥有關可用于預測組織學絨毛膜羊膜炎的指標尤為重要。

微小RNAs（miRNA）是一類新發現的非編碼RNA，在人類基因組中占比甚少，但可調控多達60%的蛋白質基因編碼［6］，參與細胞生物學過程，調控炎癥反應［7］。miRNA 可在多種標本（如血液 、汗液和尿液等）中被檢測到，可抑制轉錄后基因的表達或靶向促進mRNA 的降解，已廣泛應用于多種感染/炎癥性疾病中［8］。在這些miRNA 中，miRNA-223（miR-223）在炎癥過程中的作用尤為突出［9］。目前，miR-223-3p 在孕婦血清中的表達情況研究較少。本研究旨在探討miR-223-3p 在PPROM孕婦血清中的表達水平，并分析其與炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的相關性，以明確miR-223-3p 在未足月胎膜早破發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2023 年4～9 月徐州醫科大學附屬徐州婦幼保健院產科收治的無臨床CA、行剖宮產術終止妊娠的孕婦60 例作為觀察組，根據胎膜病理檢查結果分為兩組：未足月胎膜早破（PPROM）未合并HCA 組（PPROM 組，n= 37）；PPROM 合并HCA 組（PPROM + HCA 組，n= 23），選取同期足月正常剖宮產孕婦31 例作為正常組。三組孕婦的年齡、孕次、產次比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05），PPROM+HCA組中性粒細胞計數（NEU）較PPROM 組及正常組顯著升高（P＜ 0.05），見表1。排除標準：妊娠＜ 28 周或≥ 37 周；非單胎妊娠；有全身感染的臨床征象；存在羊水過多、多胎妊娠等可能導致胎膜早破的機械性因素；患有妊娠合并癥或并發癥；隨訪資料不完整或中途退出。本研究經徐州醫科大學附屬徐州婦幼保健院醫學倫理委員會討論并同意，批準號：徐州市婦幼保健院［2023］倫審第（21）號。

表1 各組孕婦一般資料比較Tab.1 Comprision of general information of pregnant women in each group ±s

表1 各組孕婦一般資料比較Tab.1 Comprision of general information of pregnant women in each group ±s

注：與PPROM+HCA組相比，aP ＜ 0.05

組別PPROM組PPROM+HCA組正常組F值P值例數37 23 31年齡（歲）30.108 ± 3.695 29.826 ± 3.939 30.871 ± 3.905 0.567 0.569孕次（次）1.973 ± 0.957 2.087 ± 1.240 2.000 ± 1.211 0.075 0.927產次（次）0.487 ± 0.607 0.522 ± 0.665 0.613 ± 0.615 0.356 0.701 NEU（×109/L）5.532 ± 1.422a 8.357 ± 1.325 5.203 ± 0.908a 49.744 0.001

1.2 診斷標準 PROM 的診斷標準參考第9 版《婦產科學》［10］。HCA 診斷標準參考《婦產科病理學》［11］。

1.3 方法

1.3.1 胎膜收集 在剖宮產術中胎盤娩出后取自胎膜破裂口處2.0 cm × 2.0 cm 大小胎膜，經DEPC水沖洗后放置-80 ℃冰箱保存，然后送病理檢查，根據HCA 診斷標準將觀察組分為兩組。

1.3.2 酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清中miR-223-3p 的表達水平 收集孕婦入院后治療前肘靜脈血5 mL，靜置冰箱4 ℃過夜，然后12 000 r/min離心5 min，取上清液存放-80 ℃冰箱保存。通過酶聯免疫吸附法測定血清中 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎癥因子表達水平，酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），根據標準曲線得出各樣品對應濃度值。試劑盒均選擇武漢新啟迪生物科技有限公司產品。

1.3.3 實時熒光定量PCR 測定血清miR-223-3p的表達水平 采用Trizol 法處理血清樣品，提取總RNA 逆轉錄為cDNA，進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，目的基因miR-223-3p 的引物序列，上游：5′-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3′，下游：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGGGGTAT-3′，目的基因擴增40 個循環，以U6 作為內參對照，上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，計算相對含量。最后通過2-ΔΔCT法計算各組表達水平的倍數差異。

1.4 統計學方法 使用SPSS 26.0軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示。多個樣本均數之間的比較采用方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗；繪制受試者臨床特征（ROC）曲線分析miR-223-3p 對PPROM 的診斷價值。miR-223-3p 與炎癥因子之間的相關性分析用線性相關（Pearson 相關系數）表示。以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組受試者血清中miR-223-3p 水平的比較PPROM+HCA 組孕婦血清中miR-223-3p 含量較PPROM 組、正常組顯著增加（P＜ 0.05），PPROM 組與正常組相比差異無統計學意義（P＞ 0.05），見表2。

表2 3 組孕婦血清中miR-223-3p 的表達量Tab.2 Expression levels of miR-223-3p in serum of three groups of pregnant women ±s

表2 3 組孕婦血清中miR-223-3p 的表達量Tab.2 Expression levels of miR-223-3p in serum of three groups of pregnant women ±s

注：與PPROM+HCA組相比，#P ＜ 0.05

組別PPROM組PPROM+HCA組正常組F值P值例數37 23 31 miR-223-3p 0.372 ± 0.114#1.002 ± 0.341 0.277 ± 0.121#100.724 0.001

2.2 血清miR-223-3p 水平對PPROM 疾病的診斷價值 ROC 結果顯示，miR-223-3p 對PROM 疾病診斷的AUC為0.823（95%CI：0.739 ～ 0.907，P＜ 0.05），miR-223-3p ≥ 0.325 診斷PROM 疾病的敏感度為80%，特異度為71%，見圖1。

圖1 孕婦血清中miR-223-3p 水平診斷PPROM 疾病的ROC 曲線Fig.1 The ROC curve of serum miR-223-3p levels in pregnant women with PPROM disease

2.3 各組受試者血清炎癥因子比較 PPROM +HCA 組孕婦血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 表達水平較PPROM 組、正常組顯著增加（P＜ 0.05），與正常組比較，PPROM 組孕婦血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 表達水平顯著增加（P＜ 0.05），見表3。

表3 3 組孕婦血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 的表達水平比較Tab.3 Comparison of the expression levels of IL-6， IL-8， IL-1β， and TNF-α in the serum of three groups of pregnant women ±s

表3 3 組孕婦血清中IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 的表達水平比較Tab.3 Comparison of the expression levels of IL-6， IL-8， IL-1β， and TNF-α in the serum of three groups of pregnant women ±s

注：與PPROM組、正常組相比，*P ＜ 0.05；與正常組相比，#P ＜ 0.05

組別PPROM組PPROM+HCA組正常組F值P值例數37 23 31 IL-6 203.486 ± 18.746#224.121 ± 23.825*96.304 ± 17.634 353.329 0.001 IL-8 136.453 ± 12.000#147.743 ± 16.746*61.289 ± 11.100 383.094 0.001 IL-1β 93.756 ± 10.149#107.726 ± 8.174*43.310 ± 6.836 444.129 0.001 TNF-α 95.773 ± 10.324#107.387 ± 12.225*48.814 ± 13.122 200.247 0.001

2.4 PPROM+HCA 組孕婦血清miR-223-3p 水平與炎癥因子水平的相關性 PPROM + HCA 組孕婦血清miR-223-3p 與炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 表達水平呈正相關，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表4。

表4 PPROM+HCA 組孕婦血清中miR-223-3p 與炎癥因子水平的相關性分析Tab.4 Analysis of the Correlation between miR-223-3p and inflammatory factor levels in the serum of PPROM +HCA group

3 討論

胎膜早破極易引起胎兒窒息、窘迫、早產以及難產等，影響母嬰結局，具有發病率高及病情危害大的特征。胎膜早破和感染之間互為因果，一方面，胎膜早破可能是宮內感染的一種表現形式；另一方面，胎膜早破為病原菌入侵提供了機會從而造成宮內感染［12-13］。miR-223 最先在造血系統中被發現與細胞增殖分化有關，序列非常保守［14］。miR-223 的生物學靶標包括胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R），單核細胞增強因子2C，stathmin1和FOXOIA等［15-16］，證明miR-223可參與調節機體免疫反應及多種炎癥過程［17］。近年來，其在妊娠相關疾病中的作用越來越被人們關注［18］。miR-223由miR-223-3p 和miR-223-5p 組成，可調節下游促炎細胞因子如IL-6 和IL-1β 等的表達，進一步促進相關疾病的發生、發展［19］。

本研究發現，PPROM+HCA 組血清miR-223-3p表達水平顯著高于PPROM 組及正常組，PPROM組miR-223-3p 的表達水平稍高于正常組，但差異無統計學意義，這表明miR-223-3p 在未足月胎膜早破孕婦中呈上調趨勢，當炎癥反應越明顯時，其表達水平越高。ROC 曲線分析發現，血清miR-223-3p 對PROM 疾病診斷的AUC 為0.823，表明檢測血清miR-223-3p 水平可有效區分PPROM 孕婦和正常妊娠孕婦，miR-223-3p 在PPROM 合并HCA的發生發展中具有重要作用，可能成為預防胎膜早破的新的治療靶點。

急性絨毛膜羊膜炎的存在是母體和胎兒對妊娠囊內細菌感染的急性炎癥反應［20-21］。研究［22］表明，孕期絨毛膜羊膜炎的發生風險和母嬰不良結局的危險性與血清炎癥細胞因子水平有關。臨床上常用中性粒細胞計數、IL-6 等炎癥性指標對HCA 進行預測［23］。孫廣等［24］研究證明在miR-223在類風濕關節炎（RA）患者血清外泌體中顯著升高，且與RA 患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β 水平呈正相關。

IL-6 可增強中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬和殺傷能力［25］。IL-1β 可增強黏膜屏障功能，從而發揮抗感染作用［26］。既往研究［27］表明miR-223可從中性粒細胞轉移至肺上皮細胞從而抑制急性肺損傷。本研究發現NEU 水平、炎癥因子及miR-223-3p 表達水平在PPROM+HCA 組中均高于PPROM 組及正常組，且在PPROM+HCA 組中，miR-223-3p 與炎癥因子呈正相關，表明miR-223-3p 是一個與炎癥相關的miRNA，其參與炎癥反應的機制可能與中性粒細胞有關。

本研究只研究了miR-223-3p 在PPROM 中的表達情況，還需探究在TPROM 組及合并HCA 的TPROM 組和PPROM 組之間的炎癥機制是否相同。未來可以在擴大樣本量的基礎上，利用動物模型進行體內試驗，進一步說明miR-223-3p 在預測羊膜腔感染的作用。既往研究［28］表明，miR-223通過調控RHOB 蛋白表達可能對TLR4/NF-κB 通路激活產生影響，從而改善肺部損傷。未來可從miR-223-3p 的機制通路進行研究，尋找miR-223-3p 的拮抗劑，從而減少炎癥反應，降低胎膜早破的發生。

綜上所述，miR-223-3p 參與了未足月胎膜早破發生，miR-223-3p ≥ 0.325 可作為PPROM 的早期預測指標，對預防未足月胎膜早破的發生具有重要的指導意義。

【Author contributions】HU Yuying performed the experiments，wrote the article and collected specimens. ZHU Jinming instructed the experiments and the paper writing. LIU Jie and FENG Jinqiu revised the article. PAN Yawen and ZHANG Qian collected the specimens.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.