超臨界萃取甘草黃酮工藝研究及主要成分分析

王鵬 胥維昌 王遠

(沈陽化工研究院，遼寧 沈陽 110000)

引言

甘草屬(Glycyrrhiza)是多年生草本植物，隸屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)[1]。甘草是我國傳統中藥，具有鎮痰去咳、清熱解毒、抗炎、抗變態和抗腫瘤等效果[2]。研究表明，甘草黃酮在上述效果中均發揮著重要作用[3]。由于甘草黃酮種類繁多、含量低、水溶性較差，目前市場上缺少甘草黃酮的相應標準品。超臨界二氧化碳萃取技術是一種先進的萃取分離技術，利用超臨界CO2流體具有的特殊溶解能力進行天然植物有效成分的提取，較傳統溶劑提取具有操作溫度低近于室溫，壓力不高，萃取劑回收方便，臨界點容易達到，不污染環境等優點[4]。與以往研究超臨界二氧化碳萃取甘草黃酮的試驗不同的是，本次試驗全面優化了可能對結果產生影響的所有因素，并對萃取液成分進行了分析，分離鑒定主要化合物，對深入研究甘草黃酮的提取分離有重要作用。

1 試驗部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

10L超臨界萃取裝置，購于貴州航天烏江機電公司；UV-1800型紫外可視分光光度計，Agilent1260系列液相色譜儀等。

1.1.2 材料

寧夏固原人工種植的烏拉爾甘草，蘆丁標準品，純度99%以上的二氧化碳，其余試劑均購于國藥。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘草總黃酮含量的測定方法

采用硝酸鋁比色法測定黃酮含量[5]。以蘆丁作為對照標品進行黃酮含量測定，以吸光度為縱坐標，以對照品溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.2 黃酮萃取率和浸膏中黃酮含量計算

以黃酮萃取率和黃酮含量為標準優化萃取參數，計算公式：

1.2.3 傳統溶劑提取

將甘草烘干粉碎，過40目篩，稱重后置于燒瓶內，加入70%乙醇，物料比為甘草粉∶70%乙醇=1g∶20mL，85℃熱回流提取2h。

1.2.4 超臨界萃取工藝流程

將甘草烘干粉碎，過40目篩，稱重后進行超臨界萃取，待萃取完成后接取萃取液，過濾后測定甘草黃酮萃取率。將萃取液旋蒸烘干至恒重，測定其浸膏中黃酮含量。

1.2.5 工藝優化

1.2.5.1 單因素試驗

試驗主要考察上樣量、攜帶劑種類、攜帶劑用量比、萃取溫度、萃取壓力和萃取時間對甘草黃酮萃取率和浸膏中黃酮含量的影響。

1.2.5.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上選擇萃取溫度、萃取壓力、攜帶劑種類、上樣量為響應變量設計正交試驗得到最佳工藝條件。

1.2.6 HPLC分析

利用HPLC對浸膏進行分析，色譜條件為流動相為甲醇(C)和0.1%磷酸水溶液(D)，梯度洗脫程序：20%C和80%D，1min；100%C和0%D，80min；100%C和0%D，90min；20%C和80%D，95min；20%C和80%D，105min。進樣量5μL，流速1.0mL·min-1，溫度30℃，檢測波長210nm。

1.2.7 主要化合物的分離鑒定

通過硅膠柱層析分離浸膏中主要化合物，將分離純化后的化合物通過核磁共振波譜法鑒定其結構。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

初始萃取條件為上樣量200g，萃取時間3h，萃取溫度50℃，萃取壓力30MPa，攜帶劑為無水乙醇，攜帶劑用量比為1g∶5mL。本工藝參數除了在考察影響因素對萃取率的影響而變化外，其余參數固定同上。

2.1.1 上樣量的優化

上樣量的試驗結果見圖1a，浸膏中黃酮含量幾乎不受上樣量的影響；黃酮萃取率隨上樣量增大而減小，隨著上樣量增大，二氧化碳和攜帶劑與甘草粉的接觸幾率降低而使萃取率下降，在保證萃取率的同時要增大萃取的效率，在該試驗條件下選擇200g的上樣量。

圖1 單因素試驗結果

2.1.2 攜帶劑種類優化

攜帶劑種類優化的試驗結果見圖1b，黃酮萃取率與黃酮含量的趨勢一致，其中氨水與乙醇聯合使用時二者同時最高，85%乙醇作為攜帶劑對甘草黃酮的萃取率高于純乙醇，水作為攜帶劑對甘草黃酮的萃取率最低。不加入任何攜帶劑的超臨界二氧化碳流體僅能對極性較低的親脂性物質及相對分子質量較低的脂肪烴類物質進行萃取，黃酮類物質極性較大，需使用攜帶劑調節極性。使用水作為攜帶劑能調節極性，但甘草黃酮水溶性較差，在萃取階段效果差，在分離階段要使黃酮溶于水一起流出也會使得萃取率低。黃酮能溶于一定濃度的醇溶液，因此85%乙醇較于純乙醇極性更大，更加適合甘草黃酮的萃取。氨水與乙醇聯合使用對甘草黃酮的萃取率最高的原因是甘草黃酮分子中多為酚羥基，顯酸性，易溶于堿性溶液。

2.1.3 萃取溫度對甘草黃酮萃取率的影響

萃取溫度優化的試驗結果見圖1c，50℃為甘草黃酮的最佳萃取溫度，萃取率達到11.8%，增加或者降低溫度都會降低萃取率。隨溫度升高，分子熱運動加快，有效成分擴散、傳質速度加快，流體與有效成分締和機會增加，增大萃取率；溫度升高，CO2密度降低，溶解能力下降，使萃取率降低。

2.1.4 萃取壓力對甘草黃酮萃取率的影響

萃取壓力優化的試驗結果見圖1d，30MPa為該試驗條件下最佳萃取溫度，增加或減少萃取壓力都會降低甘草黃酮的萃取率。隨著萃取壓力的增大，二氧化碳的密度也會隨之增大，溶解能力增強，傳質距離也會減小，甘草黃酮萃取率則相應增加。但隨著萃取壓力的繼續上升，萃取率緩慢增加達到最大值，當壓力超過一定值后，二氧化碳的擴散率會下降，萃取率降低。

2.1.5 萃取時間對甘草黃酮萃取率的影響

萃取時間優化的試驗結果見圖1e，甘草黃酮萃取率隨萃取時間的增長而增加，當萃取時間在3h時，甘草中黃酮已基本被完全萃取，繼續增長時間黃酮萃取率提升緩慢反而使其他物質被萃取出來，減少黃酮含量并增加試驗所需能耗。

2.1.6 攜帶劑用量比對甘草黃酮萃取率的影響

攜帶劑用量比優化的試驗結果見圖1f，浸膏中黃酮含量隨著攜帶劑用量比的增加而增大，甘草萃取率隨著攜帶劑用量比的增大先增大后減少。攜帶劑的量越多，超臨界二氧化碳流體的極性越大，其對黃酮的提取能力越強；過多的攜帶劑融入二氧化碳流體會使其對其余物質的溶解能力降低。因此，攜帶劑用量比為1g∶5mL最佳。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗的結果，正交試驗進一步優化工藝參數，結果如表1所示。以黃酮萃取率為指標，其最佳萃取工藝為A2B2C2D2，以浸膏中黃酮含量為指標，其最佳工藝條件為A1B3C2D2，由于A1B3與A2B2對黃酮含量影響較小，故確定最佳工藝條件為A2B2C2D2，即萃取溫度50℃，萃取壓力30MPa，攜帶劑為乙醇∶氨水=100∶5，上樣量為200g。在最佳條件下重復3次試驗，平均甘草萃取率為18.8%，平均甘草中黃酮含量為36.74%，符合預期結果。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

2.3 不同提取方法的比較

傳統溶劑加熱回流提取對甘草黃酮的提取率為43.7%，浸膏中黃酮含量為6.49%。傳統溶劑提取的提取率高于超臨界二氧化碳萃取，但超臨界二氧化碳萃取得到的浸膏中黃酮含量高于傳統溶劑提取，便于后續分離純化。將2種不同提取方法的萃取液在210nm波長下進行HPLC檢測，結果如圖2所示。超臨界二氧化碳萃取富集了化合物一、化合物二、化合物三，較傳統提取更具有選擇性，利于后續的二次分離。

圖2 2種方式提取浸膏液相色譜分析

2.4 結構鑒定

提取化合物的極性相對較低，采用硅膠柱層析對化合物一、化合物二、化合物三進行硅分離純化，并利用核磁波普鑒定其結構。

2.4.1 化合物一

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：423[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.73(1H，D，H-6′)，6.33(1H，d，H-5′)，6.07(1H，s，H-8)，5.18(2H，m，CH)，4.15(1H，m，H-2)，3.87(1H，m，H-2)，3.32(1H，m，H-3)，3.65(3H，s，OCH3)，3.21，3.25(2H，m，CH2)，2.86，2.70(2H，m，H-4)，1.74，1.64(12H，d，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：157.37(C-5)，154.94(C-4″)，153.40(C-9)，153.41(C-2′)，130.07(C-3″′)，129.74(C-3″)，124.78(C-2″′)，124.14(C-2′)，120.20(C-1′)，116.43(C-3′)，113.61(C-6)，107.66(C-5′)，99.17(C-8)，69.88(C-2)，60.46(C-OCH3)，31.07(C-3)，26.88(C-5″)，26.70(C-4)，26.06(C-2″)，26.03(C-4″′)，22.99(C-1″′)，22.81(C-1″)，18.33(C-5″′)，18.21(C-5″)。以上數據與Fukai等[6]研究結果基本一致，故鑒定化合物一為甘草西定。

2.4.2 化合物二

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：421[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：9.64(1H，s，4′-OH)，9.25(1H，s，8-OH)，6.90(1H，s，H-2′)，6.22(1H，s，H-5′)，6.13(1H，s，H-9)，5.45(1H，d，H-4)，5.20(1H，t，H-2″′)，5.11(1H，t，H-2″)，4.11(2H，m，H-2)，3.78(3H，s，OCH3)，3.14(2H，d，H-2)，2.85(1H，s，H-1″′)，2.69(1H，s，H-1″)，1.59-1.68(12H，d，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：159.94(C-6)，158.55(C-6′)，157.94(C-10)，155.87(C-8)，155.06(C-4′)，131.07(C-3″′)，130.35(C-3″)，125.35(C-2′)，124.21(C-2″′)，124.10(C-2″)，119.77(C-3′)，117.75(C-1′)，115.36(C-7)，106.21(C-5)，99.48(C-9)，97.63(C-5′)，75.46(C-4)，66.40(C-2)，62.61(5-OCH3)，39.20(C-3)，28.31(C-1″′)，26.16(C-5″′)，26.08(C-5″)，22.97(C-1″)，18.31(C-4″)，18.25(C-4″′)。以上數據與王英華等[7]研究結果基本一致，故鑒定化合物二為1-Methoxyficifolinol。

2.4.3 化合物三

白色粉末；Dual AJS ESI-MS m/z：437[M-H]-，1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：9.04(s，1H，6′-OH)，8.20(s，1H，2′-OH)，6.74(d，1H，H-6′)，6.34(d，1H，H-5′)，6.24(s，1H，H-8)，5.15(m，1H，H-2″)，5.08(m，1H，H-2″)，4.13(ddd，1H，H-2)，3.90(t，1H，H-2)，3.71(s，3H，5-OCH3)，3.62(s，3H，7-OCH3)，3.27，3.30(d，2H，1″-CH2)，3.16(m，2H，，1″′-CH2)，2.80(m，1H，H-4)，2.66(dd，1H，H-4)，1.71，1.62(s，12H，4×CH3)。13C-NMR(600MHz，DMSO)δ：162.83(C-5)，157.12(C-7)，155.05(C-4′)，153.94(C-2′)，153.52(C-9)，130.13(C-3″′)，128.09(C-3″)，124.45(C-6′)，124.32(C-2″′)，124.14(C-2″)，120.11(C-1′)，116.56(C-3′)，114.72(C-6)，108.67(C-10)，107.77(C-5′)，95.93(C-8)，70.06(C-2)，60.48(5-OCH3)，55.80(7-OCH3)，36.19(C-3)，31.10(C-4)，25.97(C-5″′)，25.90(C-5″)，23.03(C-1″)，22.73(C-1″′)，18.21(C-4″″)，17.98(C-4″)。以上數據與Tahara等[8]研究結果基本一致，故鑒合物三為甘草異黃烷甲。

2.4.4 3種化合物萃取率對比

超臨界二氧化碳萃取與傳統溶劑提取對化合物一、化合物二、化合物三的萃取率結果見表3，結果表明，超臨界二氧化碳萃取是一種高效的針對甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲的提取方法。

表3 2種方式提取主要化合物萃取率

2.5 結論

超臨界二氧化碳萃取針對甘草中甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲3種化合物的聯合提取效果優于傳統溶劑提取，是一種高效的提取方法，且提取后浸膏中雜質組成較少，利于后續的分離純化，是適合用于制作相應標準品的提取方式。超臨界二氧化碳萃取更具有選擇性，在總黃酮提取方面其提取率不如傳統溶劑提取，而針對甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲3種化合物的提取，超臨界二氧化碳萃取在萃取效率與浸膏中物質含量都優于傳統溶劑提取，因此超臨界二氧化碳萃取更適合對這類物質進行提取。目前超臨界二氧化碳萃取主要用于植物揮發油的萃取，其組成成分大多為單萜類化合物，即由2個異戊二烯構成的化合物，該試驗發現的結果與其吻合，在甘草西丁、1-Methoxyficifolinol、甘草異黃烷甲3個化合物的結構中都具備2個異戊二烯基，推斷異戊二烯基可能為在超臨界二氧化碳中的助溶基團，對含有2個異戊二烯基的化合物的提取分離提供一個新思路。