白芷全基因組測(cè)序分析及BGLU基因家族分析

摘"要： "白芷為常用的藥食同源物種，既是臨床常用中藥，又是香料，用途十分廣泛。為獲取白芷全基因組序列信息，該研究首次以杭白芷葉片DNA為材料，采用 Nanopore 測(cè)序技術(shù)構(gòu)建杭白芷全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的核苷酸序列進(jìn)行組裝、功能注釋以及進(jìn)化分析研究。結(jié)果表明：（1）原始測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后獲得662 Gb三代數(shù)據(jù)，Read N50約為32 932 bp，經(jīng)過(guò)組裝得到杭白芷基因組大小為5.6 Gb，Contig N50 約為806 638 bp。（2）組裝后的序列通過(guò)與 KOG、GO、KEGG 等功能數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到了功能注釋的基因占66.47%，KOG功能注釋結(jié)果表明杭白芷的蛋白功能主要集中在一般功能預(yù)測(cè)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；GO功能分類(lèi)表明杭白芷的基因集中在生物學(xué)過(guò)程及細(xì)胞組分；KEGG通路注釋表明參與代謝途徑的基因占主要地位。（3）杭白芷中鑒定到45個(gè)BGLU家族基因。該研究首次利用第三代測(cè)序技術(shù)對(duì)杭白芷全基因組進(jìn)行解析，為杭白芷的系統(tǒng)生物學(xué)研究和BGLU在杭白芷生長(zhǎng)發(fā)育中的后續(xù)功能研究提供了重要的理論參考。

關(guān)鍵詞： 杭白芷， 基因組， 第三代測(cè)序技術(shù)， BGLU基因家族， 藥用植物

中圖分類(lèi)號(hào)： "Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： "A

文章編號(hào)： "1000-3142（2024）04-0777-16

Complete genome sequencing and BGLU gene

family analysis of Angelica dahurica

WANG Yalan， ZHOU Luojing， ZHANG Lingyu， ZHANG Jing，

BIAN Jinhui， GAO Jihai

（ Key Laboratory of Distinctive Chinese Medicine Resources in Southwest China， Chengdu Universityof Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China ）

Abstract： "Angelica dahurica is a common species of medicine and food homology， which is not only a common clinical traditional Chinese medicine， but also a spice， with a wide range of uses. In order to obtain the whole genome sequence information of A. dahurica， we used A. dahurica var. formosana leaf DNA as material， and the Nanopore sequencing technology was used to establish its nucleotide sequences database， then genome assembly， function annotation and evolution analysis were carried out by bioinformatic methods. The results were as follows：（1） A total of 662 Gb of the third-generation data were obtained after fittering the original sequencing data， with the Read N50 about 32 932 bp. The assembled A. dahurica genome size was 5.6 Gb， Contig N50 was about 806 638 bp. （2） The genes were with gene annotations accounted for 66.47% after being compared with functional databases such as NR， KOG and KEGG. The result of KOG gene annotation was that the protein function of A. dahurica concentrated in the general functional prediction， posttranslational modification， protein turnover， chaperones and signal transduction mechanisms. GO functional classification indicated that the genes of A. dahurica concentrated on cell biological processes and components. KEGG analysis found that the A. dahurica genes mostly involved in metabolic pathways. （3） And 45 genes of BGLU family were identified in A. dahurica. In this study， the whole genome of A. dahurica is resolved by the third-generation sequencing technology for the first time， which provides "important theoretical references for the systematic biological study "and the further study of the function of BGLU in the growth and development of A. dahurica.

Key words：

Angelica dahurica var. formosana， genome， the third-generation sequencing technology， BGLU gene family， medicinal plant

白芷為傘形科（Apiaceae）植物白芷（Angelica dahurica）或杭白芷（A. dahurica var. formosana）的干燥根，主產(chǎn)于四川、杭州等地，多為栽培品。白芷是常見(jiàn)的藥食同源藥材，在臨床上可用于感冒頭痛、眉棱骨痛、牙痛、瘡瘍腫痛等各種類(lèi)型的疼痛癥狀（國(guó)家藥典委員會(huì)，2020），在日常生活中也可以作為香料使用。同時(shí)，因其氣味芳香，被廣泛應(yīng)用于化妝品、洗護(hù)用品等方面（于靜和朱艷華，2014）。白芷含有多種活性成分，如香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)等（Li et al.， 2014; Zhao et al.， 2022），現(xiàn)代研究表明其主要有效成分是香豆素類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤、降壓、保肝等多種藥理作用（吉慶等，2020；王蕊等，2020）。

白芷的應(yīng)用前景十分廣泛，但近年對(duì)白芷的研究多數(shù)集中在化學(xué)成分、栽培技術(shù)、藥理藥效的解析等方面，而少有關(guān)于白芷遺傳信息的研究，目前只見(jiàn)對(duì)白芷轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析（吳萍等，2020）的研究，對(duì)白芷COSNTANS-like（蔣翼杰等，2021）、NAC（黃文娟等，2021）、MYB-related（姚菲等，2022）基因家族的研究以及白芷中香豆素合成關(guān)鍵基因的挖掘均是依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行（劉洋，2019），白芷基因組數(shù)據(jù)的缺乏導(dǎo)致無(wú)法獲取白芷完整的遺傳信息，更多的研究無(wú)法開(kāi)展或進(jìn)一步深入，因此對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序顯得十分重要。

香豆素類(lèi)成分既是白芷的藥效成分，又是香氣成分，香豆素類(lèi)化合物廣泛存在于自然界的多種植物中，如傘形科、蕓香科、桑科等的植物（Venugopala et al.， 2013），近年來(lái)對(duì)香豆素的生物合成途徑研究較多，一些關(guān)鍵酶及功能作用的解析也較為清晰（段珍等，2022）。其中，就包括β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase， BGLU），β-葡萄糖苷酶家族不僅在香豆素的生物合成中起到重要調(diào)控作用，而且廣泛參與植物激素信號(hào)激活（Sun et al.， 2014）、次生代謝（Sampedro et al.， 2017）等多種重要生理過(guò)程。有研究表明β-葡萄糖苷酶家族在草木樨的香豆素合成中起到重要調(diào)控作用（吳凡，2021），在玉米中能通過(guò)催化碳水化合物部分和香豆素核心結(jié)構(gòu)間的β-葡萄糖苷鍵的水解，進(jìn)而產(chǎn)生香豆素苷元形式；黑曲霉來(lái)源的β-葡萄糖苷酶對(duì)丁公藤粗提物中的東莨菪苷可特異性水解，并使其含量提高47%（于坤朋等，2023）；從擬南芥中分離的3種β-葡萄糖苷酶能特異性水解東莨菪苷成東莨菪內(nèi)酯，東莨菪內(nèi)酯屬于香豆素類(lèi)成分，在白芷中也有存在，課題組推測(cè)在白芷的香豆素成分合成中，BGLU基因也起到關(guān)鍵作用。

目前未見(jiàn)關(guān)于白芷高質(zhì)量基因組的研究，對(duì)白芷中香豆素合成途徑的解析也較少，為了進(jìn)一步豐富白芷遺傳進(jìn)化的研究資料，本研究通過(guò)對(duì)杭白芷進(jìn)行第二代、第三代基因組測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝、注釋等，獲得杭白芷的高質(zhì)量基因組，并進(jìn)行功能注釋、基因家族聚類(lèi)等分析，然后挖掘香豆素合成途徑關(guān)鍵基因BGLU，通過(guò)在線軟件對(duì)基因組中提取的BGLU序列進(jìn)行基本的特征分析，擬探討以下問(wèn)題：（1）杭白芷基因組概況； （2）基因功能主要集中在哪些生物學(xué)過(guò)程及代謝通路；（3）BGLU基因家族的基本特征是什么。以期為白芷的后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及分子基礎(chǔ)，為后續(xù)深入研究BGLU基因家族在白芷香豆素合成途徑中的功能提供前期基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1 材料及DNA提取

杭白芷植株采自成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)國(guó)家中藥種質(zhì)資源庫(kù)專家高繼海副教授鑒定為傘形科植物杭白芷（Angelica dahurica var. formosana）。采摘新鮮、幼嫩、無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，先用蒸餾水清洗表面，再用75%乙醇清洗3次，擦干后置于-80 ℃凍存，備用。

參照沙麗萍（2018）采用CTAB法提取杭白芷葉片DNA。提取的DNA需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Qubit Fluorometer檢測(cè)濃度，以及Nanodrop檢測(cè)純度和完整度。

1.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

（1）MGISEQ-200測(cè)序：提取的杭白芷基因組DNA經(jīng)檢測(cè)合格以后，通過(guò)酶解隨機(jī)打斷成片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟構(gòu)建插入片段長(zhǎng)度為150 bp的DNA文庫(kù)。將構(gòu)建好的文庫(kù)在MGISEQ-200平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

（2）Nanopore測(cè)序：利用磁珠對(duì)檢測(cè)合格的DNA進(jìn)行富集和純化，并對(duì)純化后的DNA進(jìn)行損傷修復(fù)、末端修復(fù)、加A尾后再純化；將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序相關(guān)的連接及純化，得到最終上機(jī)文庫(kù)；用Qubit對(duì)建好的DNA文庫(kù)進(jìn)行精確的定量檢測(cè)，取一定量的DNA文庫(kù)混合上機(jī)相關(guān)試劑后加入流動(dòng)槽中；在GridION測(cè)序儀上進(jìn)行單分子測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)。

1.3 基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

二代原始測(cè)序數(shù)據(jù)中包含的接頭信息，低質(zhì)量堿基，未測(cè)出的堿基（以N表示）等會(huì)對(duì)后續(xù)的信息分析造成很大的干擾，這些干擾信息需要利用FastQC v0.11.9軟件和Trimmomatic v0.39軟件進(jìn)行過(guò)濾，最終得到有效數(shù)據(jù)（clean reads）用于后續(xù)分析。

使用NanoPlot v1.20.0軟件對(duì)三代Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)的測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，再利用NanoFlit v2.8.0軟件進(jìn)行低質(zhì)量和短片段數(shù)據(jù)的過(guò)濾。

1.4 基因組大小和雜合度評(píng)估

利用MGISEQ-200測(cè)序得到的reads數(shù)據(jù)，采用Jellyfish v1.1.10做Survey分析來(lái)預(yù)估基因組大小、雜合率及重復(fù)序列占比，以判斷基因組復(fù)雜情況。采用基因K-mer的分析方法來(lái)估計(jì)杭白芷基因組特征。

1.5 基因組組裝及評(píng)估

為得到高準(zhǔn)確性的三代組裝結(jié)果，先采用Canu v2.1.1（Koren et al.， 2017）軟件對(duì)Clean Reads進(jìn)行糾錯(cuò)，然后將糾錯(cuò)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，用Racon v1.0.0（Senol et al.， 2019）軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行糾錯(cuò)，再用Pilon v1.22軟件使用二代數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，最后利用BUSCO v5.1.2（Simo et al.， 2015）軟件對(duì)組裝完成的基因組進(jìn)行完整性評(píng)估。

1.6 序列預(yù)測(cè)

首先，基于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和從頭預(yù)測(cè)（Ab initio）的原理，使用LTR Finder v1.05（Xu amp; Wang， 2007）、RepeatScout v1.0.6、PILER-DF v2.4軟件構(gòu)建重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，利用PASTEClassifier v2.0對(duì)構(gòu)建好的重復(fù)序列庫(kù)進(jìn)行分類(lèi)；然后，基于重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)Repbase（https：//www.girinst.org/repbase/）合并作為最終的杭白芷基因組的重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)；最后，基于構(gòu)建好的數(shù)據(jù)庫(kù)采用RepeatMasker v4.1.2軟件對(duì)杭白芷進(jìn)行重復(fù)序列的預(yù)測(cè)。

基于從頭預(yù)測(cè)和同源物種預(yù)測(cè)（Homolog）兩種原理對(duì)杭白芷基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。首先，利用Genscan v1.0、Augustus v3.3.1、GlimmerHMM v3.0.4、GeneID v1.4、SNAP v8.0.0進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)；然后，使用GeMoMa v1.3.1進(jìn)行基于同源物種的預(yù)測(cè)；最后，利用EvidenceModeler v1.1.0整合和校正上述方法得到的預(yù)測(cè)結(jié)果。針對(duì)非編碼RNA預(yù)測(cè)，包括microRNA、rRNA及tRNA等已知功能的RNA，分別基于Rfam（Finn et al.， 2006）數(shù)據(jù)庫(kù)和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)并利用Infenal v1.1.3進(jìn)行rRNA和microRNA預(yù)測(cè)；利用tRNAscan-SE v2.0.7識(shí)別tRNA。

1.7 功能基因注釋

對(duì)預(yù)測(cè)得到的基因序列與NR（Non-Redundant Protein Database）、KOG（EuKaryotic Orthologous Groups）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、TrEMBL等功能數(shù)據(jù)庫(kù)做BLAST v2.2.31比對(duì)，設(shè)置比對(duì)篩選閾值（e-value＜1e-5），得到基因功能注釋。基于NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，應(yīng)用軟件 Blast2GO v5.2.5進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋。

1.8 基因家族聚類(lèi)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用杭白芷和其同科物種的對(duì)比來(lái)尋找基因家族，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載杭白芷同科植物芹菜（Apium graveolens）（Song et al.， 2021）、胡蘿卜（Daucus carota subsp. sativus）（Iorizzo et al.， 2016）的蛋白序列，從CGDB（http：//cgdb.bio2db.com）下載芫荽（Coriandrum sativum）（Song et al.， 2020）蛋白序列。通過(guò)OrthoMCL v2.0（Li et al.， 2003）軟件對(duì)all-vs-all blastp獲得的所有物種蛋白序列間的相似性關(guān)系進(jìn)行聚類(lèi)分析。將從OrthoMCL聚類(lèi)結(jié)果中提取單拷貝蛋白序列，通過(guò)Muscle v3.8.31（Edgar， 2004）軟件進(jìn)行對(duì)比后，再通過(guò)RAxML v8.2.12（Guindon amp; Gascuel， "2003）軟件采用最大似然法（ML TREE）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.9 杭白芷BGLU基因家族成員挖掘

利用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得擬南芥BGLU基因家族的典型結(jié)構(gòu)域序列tBLASTN （P=0.001），并搜索杭白芷基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)得到杭白芷中所有BGLU基因家族成員。

1.10 BGLU基因家族理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守域分析

利用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）（Wilkins et al.， 1999）在線軟件對(duì)BGLU家族蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）及WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/） 在線軟件綜合分析其亞細(xì)胞定位；使用SOMPA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線軟件分析保守結(jié)構(gòu)域。

1.11 BGLU家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA軟件中的Clustal W v2.0（Larkin et al.， 2007）程序?qū)及总坪蛿M南芥的BGLU家族蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，將對(duì)比結(jié)果采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2"結(jié)果與分析

2.1 基因組測(cè)序

通過(guò)測(cè)序平臺(tái)對(duì)杭白芷葉片進(jìn)行全基因組測(cè)序，對(duì)原始數(shù)據(jù)的Reads質(zhì)量值進(jìn)行初步過(guò)濾，去掉低質(zhì)量和短片段的Reads，統(tǒng)計(jì)得到150 Gb二代原始數(shù)據(jù)、662 Gb三代原始數(shù)據(jù)。三代數(shù)據(jù)中，Read N50為32 932 bp，最長(zhǎng)Reads的長(zhǎng)度為422 833 bp，平均長(zhǎng)度為27 750 bp，測(cè)序質(zhì)量符合后續(xù)組裝要求。Survey分析得出杭白芷基因組的大小約為5.2 Gb。

2.2 基因組組裝及評(píng)估

借助Canu軟件對(duì)杭白芷進(jìn)行糾錯(cuò)組裝，基因組大小約為5.6 Gb，Contig N50為806 638 bp，最長(zhǎng)的Contig為21 677 961 bp，GC含量為35.73%。組裝后的基因組采用BUSCO v5.1.2 軟件評(píng)估，在組裝的基因中共找到1 580個(gè)完整的BUSCO基因，其中完整單拷貝的1 272個(gè)，F(xiàn)ragmented BUSCO 18個(gè)基因，有16個(gè)基因在Embryophyta_odb10數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有找到，BUSCO評(píng)估基因組完整度為97.9%，表明該組裝結(jié)果較為完整。

2.3 基因預(yù)測(cè)結(jié)果

利用RepeatMasker v4.1.2軟件進(jìn)行重復(fù)序列預(yù)測(cè)得到包含5.4 Gb重復(fù)序列的杭白芷基因組，占比91.36% 。其中，長(zhǎng)散在重復(fù)序列（LINE）數(shù)目為21 726 條，占比0.41%；短散在重復(fù)序列（SINE）數(shù)目為0條；長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）數(shù)目為3 550 524 條，占比69.07%；copyia數(shù)目為1 083 004條，占比30.01%；gypsy數(shù)目為989 985條，占比24.56%；Roling-circles數(shù)目為2 893條，占比0.03%；簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）數(shù)目為7 710條，占比0.03%。

在獲得的67 004個(gè)基因中，有34 119 （50.92%）個(gè)基因得到了其他物種同源性鑒定或RNA-seq數(shù)據(jù)的支持。共鑒定出2 749個(gè)非編碼RNA （ncRNA），其中核糖體RNA （rRNA）20個(gè)、轉(zhuǎn)移RNA （tRNA）781個(gè)、小分子RNA （microRNA）97個(gè)和小核RNA （snRNA）1 505個(gè)。

2.4 基因功能注釋與分析

通過(guò)KOG功能注釋（圖1）可得出，杭白芷基

因組共29 788個(gè)基因獲得注釋，占預(yù)測(cè)到的總基因數(shù)的44.46%。從圖1中可以看出，杭白芷的蛋白功能主要集中在翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶，占比為10.8%；其次為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，占比為10.1%，轉(zhuǎn)錄，占比為6.7%；碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，占比為3.7%；一般功能預(yù)測(cè)，占比為22.8%。這些基因的差異性表達(dá)可以為今后杭白芷的深入研究提供數(shù)據(jù)支持。

A. RNA加工和修飾; B. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué); C. 能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換; D. 細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞分裂，染色體分配; E. 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; F. 核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; G. 碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; H. 輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; I. 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; J. 翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成; K. 轉(zhuǎn)錄; L. 復(fù)制，重組和修復(fù); M. 細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/胞外被膜生物合成; N. 細(xì)胞運(yùn)動(dòng); O. 翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，伴侶; P. 無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; Q. 次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; R. 一般功能預(yù)測(cè); S. 功能未知; T. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制; U. 胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸; V. 防御機(jī)制; W. 胞外結(jié)構(gòu); Y. 細(xì)胞核結(jié)構(gòu); Z. 細(xì)胞骨架。

A. RNA processing and modification; B. Chromatin structure and dynamics; C. "Energy production and conversion; D. Cell cycle control， cell division， chromosome partitioning; E. Amino acid transport and metabolism; F. Nucleotide transport and metabolism; G. Carbohydrate transport and metabolism; H. Coenzyme transport and metabolism; I. Lipid transport and metabolism; J. Translation， ribosomal structure and biogenesis; K. Transcription; L. Replication， recombination and repair; M. Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N. Cell motility; O. Posttranslational modification， protein turnover， chaperones; P. Inorganic ion transport and metabolism; Q. Secondary metabolites biosynthesis， transport and metabolism; R. General function prediction; S. Function unknown; T. Signal transduction mechanisms; U. Intracellular trafficking， secretion， and vesicular transport; V. Defense mechanisms; W. Extracellular structure; Y. Nuclear structure; Z. Cytoskeleton.

杭白芷基因組GO注釋（圖2）表明，共有44 540個(gè)基因具有GO注釋功能，占預(yù)測(cè)到的總基因數(shù)的66.47%。功能主要分布在生殖、細(xì)胞過(guò)程、脅迫應(yīng)答、細(xì)胞、細(xì)胞部位等的基因占優(yōu)勢(shì)，其中在生殖的基因占比最多。

KEGG通路注釋（圖3）對(duì)杭白芷的15 263個(gè)基因進(jìn)行了通路注釋，占預(yù)測(cè)到的總基因數(shù)的22.78%。其注釋結(jié)果表明其中主要為參與代謝的基因，并且微生物在不同環(huán)境中的代謝、碳代謝、氨基酸生物合成為主要代謝通路。

2.5 基因家族聚類(lèi)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將杭白芷與同科植物芫荽、芹菜、胡蘿卜的蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，在杭白芷基因組的67 004個(gè)蛋白序列中共鑒定出24 335個(gè)基因家族，其中4 004個(gè)基因家族包含18 151個(gè)基因特異存在于杭白芷中，4種植物所共有的基因家族有1 030個(gè)（圖4）。

為進(jìn)一步研究杭白芷的種屬關(guān)系，以96條單拷貝蛋白序列進(jìn)行比較分析，選擇擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、無(wú)油樟（Amborella trichopoda）以及同為傘形科的芫荽、芹菜、胡蘿卜、當(dāng)歸（Angelica sinensis）共7個(gè)已知基因組信息的物種，與杭白芷構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖5），結(jié)果表明杭白芷與芫荽聚為一支，兩物種間親緣關(guān)系較近。

2.6 杭白芷BGLU基因家族理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位分析

在杭白芷全基因組中共鑒定到45個(gè)BGLU家族基因，分別命名為AdBGLU01～AdBGLU45，利用Protparam Tool進(jìn)行理化性質(zhì)分析，Plant-mPLoc及WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位（表1）。結(jié)果表明，杭白芷的[JP+3]45個(gè)BGLU基因編碼的氨基酸數(shù)目在51～930之間，最長(zhǎng)包含930個(gè)氨基酸殘基（AdBGLU32），最短包含51個(gè)氨基酸殘基（AdBGLU30）；不穩(wěn)定指數(shù)在11.18～61.86之間，其中38個(gè)的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，推測(cè)其為穩(wěn)定蛋白，其余7個(gè)為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為56.76～113.25，說(shuō)明蛋白的熱穩(wěn)定性較好；平均親疏水性在-0.643～0.35之間，其中7個(gè)為正值，38個(gè)為負(fù)值，說(shuō)明主要為親水性蛋白；等電點(diǎn)在4.24～10.35之間，說(shuō)明氨基酸大多為弱酸或弱堿性；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明AdBGLU家族成員分別定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、液泡中。AdBGLU基因家族的不同成員間理化性質(zhì)差異較大且亞細(xì)胞定位較多，推測(cè)該基因家族成員功能較為多樣，在生物體內(nèi)參與不同的生理過(guò)程。

2.7 杭白芷BGLU基因家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守域分析

在線分析網(wǎng)站對(duì)杭白芷BGLU家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（表2）表明，BGLU家族中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，其中α-螺旋所占比例最大的有27個(gè)，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大的有18個(gè)。無(wú)規(guī)則卷曲為蛋白中的不穩(wěn)定編碼區(qū)，因此可推測(cè)無(wú)規(guī)則卷曲越多，該家族成員的功能越多樣（姚菲等，2022）。

保守域分析結(jié)果（圖6）表明，Motif 8為最短，含有29個(gè)氨基酸殘基；Motif 6稍長(zhǎng)，含35個(gè)氨基酸殘基；Motif 2、Motif 3和Motif 7較長(zhǎng)，含有41個(gè)氨基酸殘基；Motif 1、Motif 4、Motif 5最長(zhǎng)，均含有50個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)保守基序結(jié)構(gòu)可看出Motif 5的保守性較高。通過(guò)保守域分析發(fā)現(xiàn)，不同基因含有的保守域數(shù)量不同，在所有基序中，Motif 1出現(xiàn)的頻率最高，推測(cè)其為特征基序。

基于杭白芷和擬南芥的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖7），AdBGLU基因被分為6個(gè)亞家族（A-F），AdBGLU和AtBGLU基因同時(shí)存在于B-F亞族中，表明這些亞族中基因功能保守（張曼等，2023）。A亞族中，有3個(gè)AtBGLU，無(wú)AdBGLU；B亞族有1個(gè)AdBGLU和4個(gè)AtBGLU；C亞族有13個(gè)AdBGLU和14個(gè)AtBGLU；D亞族有5個(gè)AdBGLU和8個(gè)AtBGLU；E亞族有14個(gè)AdBGLU和17個(gè)AtBGLU；F亞族有12個(gè)AdBGLU和2個(gè)

AtBGLU。在C亞族中，杭白芷和擬南芥的基因數(shù)量相似，推測(cè)此亞族中的同源基因在擬南芥和杭白芷中可能發(fā)揮相似的作用；而在其余亞族中，數(shù)量差異較大，可能存在調(diào)控杭白芷內(nèi)香豆素合成的關(guān)鍵基因，此結(jié)論還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3"討論與結(jié)論

有研究表明物種的基因組大小與其倍性水平及相應(yīng)的染色體數(shù)目存在一定的正相關(guān)性（Mank amp; Avise， 2006），通過(guò)對(duì)禾本科282種植物基因參數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著染色體倍性從二倍體到八倍體之間增加，其對(duì)應(yīng)的基因組大小也顯著增大，其基因組大小與倍性、染色體數(shù)呈極顯著正相關(guān)（李桂雙等，2012）。本研究獲得約為 5.6 Gb的杭白芷基因組，其他已完成基因組測(cè)序的傘形科植物有積雪草（約為430 Mb）、芹菜（約為3.33 Gb）、當(dāng)歸（約為2.37 Gb）（Han et al.， 2022）、水芹（約為1.28 Gb）、北柴胡（約為621.42 Mb）、胡蘿卜（約為421.5 Mb）、野胡蘿卜（約為371.6 Mb）、芫荽（約為2 130.29 Mb），其中白芷、芹菜、當(dāng)歸、芫荽的染色體數(shù)目為2n=22條，積雪草和胡蘿卜、野胡蘿卜的染色體數(shù)目為2n=18條，北柴胡的染色體數(shù)目為2n=12條，除北柴胡以外，符合染色體數(shù)目與基因組大小呈正相關(guān)關(guān)系，表明本次測(cè)得的杭白芷基因組大小符合染色體數(shù)目。白芷、芹菜的植株生長(zhǎng)可達(dá)1.5 m，而其余植物均不超過(guò)1 m，初步推測(cè)傘形科植物基因組大小與植株高度呈正相關(guān)關(guān)系（邵晨等，2021），可為后續(xù)同屬或同科植物基因組的研究提供參考。

香豆素類(lèi)化合物是一類(lèi)具有重要藥用價(jià)值的天然化合物，分為簡(jiǎn)單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他香豆素四類(lèi) （王榮香等，2022）。在植物中，香豆素通過(guò)苯丙烷代謝途徑進(jìn)行合成，目前已有較多研究揭示參與該生物合成途徑的關(guān)鍵基因。例如，從明亮發(fā)光桿菌中提取的PAL基因能將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，將L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸（Zhang et al.， 2021）；在對(duì)向日葵的研究中發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)C4H基因具有催化肉桂酸生成對(duì)香豆酸，用同樣方法對(duì)白花前胡和紫花前胡的C4H基因功能進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)都具有相同的催化功能（Wang et al.， 2020）；在白花草木樨的研究中也發(fā)現(xiàn)MaBGLU1基因?qū)τ跂|莨菪苷形成東莨菪內(nèi)酯具有關(guān)鍵作用（Wu et al.， 2022）；在白芷同屬植物當(dāng)歸的研究中，發(fā)現(xiàn)PT基因?qū)τ谶秽愣顾氐男纬煽赡芷鸬疥P(guān)鍵決定作用。PAL、C4H等在香豆素生物合成途徑中屬于較為上游的基因，對(duì)于此類(lèi)基因的研究較多，但是相對(duì)下游的BGLU基因的研究較少，尤其在白芷中更為缺乏。研究表明BGLU通過(guò)激活植物激素和防御化合物，與植物生理過(guò)程中的多個(gè)方面有關(guān)，尤其是對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)。例如，陸地棉中5個(gè)GhBGLU或能正向調(diào)控棉花黃萎病抗性（張曼等，2023），擬南芥中的AtBGLU10可以催化游離ABA的產(chǎn)生（Lee et al.， 2006），AtBGLU21-23調(diào)控根中東莨菪苷的水解（Ahh et al.， 2010），AtBGLU42參與誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)細(xì)胞疾病的抵抗力（江舟，2022）。本研究所獲得的杭白芷基因組，可為后續(xù)進(jìn)行白芷中香豆素類(lèi)成分合成相關(guān)基因的挖掘提供基礎(chǔ)，具有重要價(jià)值及意義。

目前，已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)48個(gè)BGLU家族基因，玉米中發(fā)現(xiàn)26個(gè)（Gómez-Anduro et al.， 2011），水稻中發(fā)現(xiàn)40個(gè)（Opassiri et al.， 2006），大豆中發(fā)現(xiàn)42個(gè)（柯丹霞等，2019），陸地棉中發(fā)現(xiàn)53個(gè)（張曼等，2023），苜蓿發(fā)現(xiàn)51個(gè)（Yang et al.， 2021），本研究在杭白芷中鑒定出45個(gè)BGLU家族基因，并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等分析，發(fā)現(xiàn)其亞細(xì)胞定位多在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、液泡中，這一結(jié)論與玉米中的β-葡萄糖苷酶定位基本一致（Kristoffersen et al.， 2000），AdBGLU基因家族的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等特征差異較大，說(shuō)明該基因家族的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，推測(cè)其功能較為多樣，各基因在功能分工上有所不同，在生物體內(nèi)參與多種不同代謝過(guò)程。杭白芷中存在多種香豆素類(lèi)化合物，如歐前胡素、異歐前胡素、白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯等等，其生物合成途徑也較為復(fù)雜，這可能是與AdBGLU基因功能的多樣有關(guān)。AdBGLU的初步分析對(duì)杭白芷香豆素生物合成具有重要作用，可為進(jìn)一步揭示和利用杭白芷香豆素類(lèi)成分合成途徑關(guān)鍵基因的功能提供前期理論基礎(chǔ)。

4"數(shù)據(jù)獲得

原始測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至國(guó)家基因庫(kù)生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)（CNGBdb，https：//db.cngb.org/），項(xiàng)目編號(hào)為CNP0003549。

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（責(zé)任編輯"李"莉"王登惠）

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WANG YL， ZHOU LJ， ZHANG LY， et al.， 2024.Complete genome sequencing and BGLU gene family analysis of Angelica dahurica ［J］.Guihaia， 44（4）： 777-792.

王雅蘭等： 白芷全基因組測(cè)序分析及BGLU基因家族分析

收稿日期： "2023-04-06"接受日期： 2023-07-17

基金項(xiàng)目： "中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）; 國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（ZYYCXTD-D-202209）; 四川省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020YFN0152，22CXTD0009）; 四川省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2022C001）; 成都中醫(yī)藥大學(xué)人才提升項(xiàng)目（QNXZ2018017，QNXZ2019001）。

第一作者： 王雅蘭（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幱行С煞址治鰬?yīng)用，（E-mail）wangyalan @stu.cdutcm.edu.cn。

通信作者： "高繼海，博士，副教授，主要從事分子生藥學(xué)研究，（E-mail）gaojihai@cdutcm.edu.cn。