基于靜電相互作用的卵白蛋白與巖藻多糖相行為分析及流變學分析

張 婷，袁一心，嵇競弘，龔泠靈，吳昕玲，劉靜波，尚曉敏

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林省營養與功能食品重點實驗室，吉林 長春 130062）

蛋白質和多糖是食物中的兩種重要生物大分子，二者的相互作用可以調控食物結構、穩定乳液、制備脂肪替代物和設計微膠囊等[1–4]。在水溶液中，蛋白質與多糖通過靜電力驅動形成復合凝聚體[5-6]。靜電相互作用強度主要取決于蛋白質和多糖的種類、電荷密度、分子質量，以及溶液體系pH值、溫度、離子強度、蛋白質/多糖復配比和生物聚合物濃度等[7-8]，通過調節這些因素可以有效獲得多尺度的復合凝聚體。濁度滴定法常用于監測不同pH值條件下蛋白質/多糖復合凝聚相行為變化過程。隨著pH值降低，復合體系會經歷3 個臨界pH值，對應4 種不同的相行為：當pH＞pHc時，復合體系共溶；當pHc＜pH＜pHφ1時，可溶性復合凝聚體形成；當pHφ2＜pH＜pHφ1時，不溶性復合凝聚體發生宏觀相分離；當pH＜pHφ2時，復合凝聚體完全解離回到共溶狀態[5,9]。雖然蛋白質和多糖之間的相互作用機制已被廣泛研究，但對于特定來源的蛋白質和多糖，其復合凝聚相行為和凝聚體的結構變化仍有較大差異。

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）是蛋清蛋白中含量最高的蛋白質（約占54%）[10]，由385 個氨基酸組成（分子質量為45 kDa），是影響蛋清蛋白加工特性的主要物質。研究者們針對不同種類的OVA/多糖復合體系開展了系統研究，闡明了復合體系的相行為及物性變化[9,11-12]。Niu Fuge等[13]發現添加阿拉伯膠顯著改善了OVA溶液的乳化穩定性，這是由于OVA與阿拉伯膠相互作用產生了高電荷的表面層，靜電排斥減少了液滴之間的相互作用。Xiong Wenfei等[14]發現電荷密度較高的羧甲基纖維素可以增強復合體系的網絡交聯和黏彈性。綜上所述，蛋白質和多糖之間的相互作用強度可以調控復合體系的結構，進而影響復合體系的透明度、穩定性和凝膠特性[15-16]。有研究發現，硫酸化多糖（如硫酸葡聚糖和κ-卡拉膠等）可以調控蛋清蛋白分子的電荷密度和構象，從而調節其加工特性[17-18]。但這些硫酸化多糖在食品加工的實際應用中存在一定的問題，如硫酸葡聚糖不能用于食品加工；κ-卡拉膠是一種凝膠化多糖，在食品熱加工過程中會先于蛋白質形成凝膠阻礙食品結構調節。巖藻多糖（fucoidan，FUC）是一種天然的硫酸化多糖，具有無毒和高生物相容性的特點，其碳鏈結構主要由含有硫酸基團的巖藻糖殘基組成[19]。FUC是一種高電荷的水溶性陰離子聚合物，在生物學和醫學領域有著廣泛的應用[20-21]，如抗傳染性非典型肺炎病毒、降血脂、抗動脈粥樣硬化等[22-23]。因此，OVA/FUC不僅可作為安全、大容量的載體用于靶向給藥，還可作為具有生物活性的營養物質使用，在制備蛋白質納米顆粒方面表現出充足的潛力[24]。目前針對FUC的研究仍局限于分離純化、結構鑒定、活性檢測等方面，而關于FUC調控蛋白質物性變化的研究較少。

目前針對OVA/FUC的相行為變化及相互作用機制鮮有研究，嚴重限制了OVA/FUC復合體系在食品加工中的應用。因此，本研究采用濁度滴定法、Zeta電位測量等分析方法，測定OVA/FUC復合體系在不同蛋白質/多糖復配比和鹽濃度下的相行為變化，明確二者復合凝聚的臨界pH值；利用圓二色光譜（circular dichroism，CD）、熒光光譜和流變學等手段，解析FUC對蛋白構象和物性的影響，闡釋OVA和FUC相互作用的機制。以期為理解硫酸化多糖與蛋白質相互作用機制奠定良好理論基礎，并為開發基于硫酸化多糖/蛋白質復合凝聚體的功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OVA（純度≥98%）美國Sigma-Aldrich公司；FUC（純度85%）北京源葉生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外-可見分光光度計、F-7000熒光分光光度計 日本島津公司；Discovery HR-1流變儀 美國TA儀器公司；MOS-450 CD儀 法國Bio-Logic公司；Starter2C pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA和FUC儲備液的制備

準確稱取適量OVA和FUC樣品分別溶解于去離子水中，制備得到質量濃度為1 mg/mL的儲備液，在室溫條件下攪拌2 h后，置于4 ℃冰箱中過夜以保證樣品充分水合。添加質量分數為0.02%的疊氮化鈉溶液避免細菌生長。

1.3.2 OVA/FUC復合物的制備

將OVA與FUC的儲備液按不同質量比（1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1）進行混合得到OVA/FUC復合溶液，同時保證復合溶液中生物聚合物的總質量分數為1%，此時溶液中的pH值為6.0。為了研究離子強度對OVA/FUC復合物形成的影響，向OVA/FUC復合溶液（20∶1）中添加不同質量的NaCl得到不同鹽離子濃度（c（NaCl）＝0、50、100、200、400 mmol/L）的OVA/FUC復合溶液。

1.3.3 濁度測定

利用濁度滴定法觀察樣品溶液復合凝聚過程中的濁度與pH值的關系。參照Yang Lan等[25]的方法，利用紫外-可見分光光度計在600 nm波長處對OVA/FUC復合溶液的濁度進行表征，比色皿的夾縫寬度為1 cm。用HCl溶液（0.1、0.5、1.0 mol/L）將OVA/FUC復合物的pH值從6.0調整到2.0，溶液的pH值每變化0.25時，取樣進行濁度測定，并記錄其對應pH值。

1.3.4 Zeta電位測定

參考Liu Jingbo等[9]的方法，將OVA儲備液、FUC儲備液、不同質量比（1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1）的OVA/FUC復合溶液和不同鹽離子濃度（c（NaCl）＝0、50、100、200、400 mmol/L）的OVA/FUC復合溶液稀釋10 倍后，利用激光納米粒度儀測定酸化過程中復合凝聚物表面的Zeta電位，平衡時間為120 s。

1.3.5 內源熒光光譜測定

參照Antonov等[26]的方法，將不同pH值（4.5和6.0）樣品中的蛋白質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在室溫條件下測定復合溶液熒光光譜。發射光譜范圍為300～450 nm，激發波長為270 nm，激發和發射的狹縫寬度均為3 nm，狹縫寬度為5 nm，激發電壓為400 V。

1.3.6 CD測定

根據Greenfield[27]的方法。將不同pH值（4.5和6.0）樣品中的蛋白質量濃度稀釋到0.5 mg/mL，在室溫條件下用CD儀測定樣品溶液在200～250 nm范圍的CD。用不含蛋白質溶液的光譜進行校正。使用BESTSEL軟件（https://bestsel.elte.hu/index.php）分析光譜并對樣品二級結構含量進行計算。

1.3.7 流變特性測定

參照Wang Chenying等[28]的方法，使用配備直徑40 mm夾具的流變儀進行流變測試。將大約1.5 mL樣品置于旋轉流變儀樣品盤上，夾具與樣品盤之間的間隙為1 mm，25 ℃穩定30 min，以1%的應變從0.1 rad/s到100 rad/s進行頻率掃描得到樣品的儲能模量（G’）。

1.4 數據處理和分析

2 結果與分析

2.1 OVA/FUC復合凝聚相行為分析

2.1.1 pH值對OVA/FUC復合凝聚的影響

多糖和蛋白質之間產生復合凝聚現象是由于帶相反電荷的生物聚合物之間的靜電引力驅動[29]。復合體系的pH值是決定生物聚合物表面電荷密度的關鍵。如圖1所示，在酸性滴定過程中，OVA/FUC復合物的濁度明顯高于OVA或FUC單一溶液，這主要歸因于靜電引力作用促進了蛋白質和多糖之間形成復合凝聚體。在酸滴定過程中單一的FUC溶液相對澄清，其濁度低且相對恒定，這歸因于FUC分子表面的硫酸基團產生了抑制多糖分子間聚集的強靜電斥力[30]。OVA的濁度取決于pH值，在OVA的等電點（pH 4.72）附近達到最大。對于OVA/FUC復合物，有4 個關鍵的pH值臨界點（pHc、pHφ1、pHmax和pHφ2），pHc為濁度曲線斜率初次變化時的pH值，pHφ1是濁度曲線斜率突然增大時的pH值，pHmax是濁度達到峰值時的pH值，而pHφ2值是濁度曲線下降至穩定時的pH值[5]。當pH＞pHc時，OVA與FUC在溶液中都帶負電，由于復合物之間的靜電排斥作用，OVA和FUC之間無法形成復合物（共溶區）。當pHφ1＜pH＜pHc時，復合溶液濁度開始增加，表明溶液中OVA和FUC形成了具有一定散射光線能力的可溶性復合物[31]。當pH值高于蛋白質等電點時，依然可以通過靜電相互作用形成可溶性復合物，這主要是蛋白質表面少量帶正電的氨基酸與聚陰離子多糖帶負電的硫酸基團相互作用的結果，也稱之為“正電補丁”效應[9]。隨著進一步滴定，濁度急劇上升，當pH＜pHφ1時，出現明顯的相分離，形成不溶性復合凝聚體。OVA和FUC之間的靜電相互作用在pHmax時達到最強，導致不溶性OVA/FUC復合凝聚體的積累量達到最大。而后，隨著pH值的不斷降低，由于多糖的質子化，OVA/FUC復合凝聚物開始出現解離，乳濁液逐漸變澄清。但并未觀察到OVA/FUC復合凝聚物完全解離（即未出現pHφ2）[32]。主要原因在于含有硫酸基團的FUC酸解離常數（pKa）較低，在強酸條件下仍然未被全部質子化，因此即便在較低pH值時，OVA與FUC仍然存在強靜電吸引力，較難解離。OVA/硫酸葡聚糖互作體系及OVA/果膠體系在酸化過程中均存在類似現象[9,33]。

圖1 OVA、FUC和OVA-FUC復合溶液濁度隨pH值的變化Fig.1 pH-Dependent changes in turbidity of OVA,FUC and OVA-FUC mixed solutions

2.1.2 蛋白質/多糖復配比對復合凝聚相行為的影響

蛋白質/多糖復配比是影響復合物形成的關鍵因素之一，對復合體系的臨界pH值影響顯著[34]。本研究進一步探討了無鹽添加條件下OVA/FUC復配比對復合凝聚體形成的影響。如圖2所示，隨著OVA/FUC質量比的增加（從1∶1增加至50∶1），OVA/FUC復合體系的濁度曲線逐漸趨于正態分布（圖2a），臨界pH值向更高pH值遷移（圖2b）。當蛋白質/多糖質量比為1∶1時，復合溶液濁度較低，表明FUC處于過量狀態，體系內蛋白分子可完全結合到糖鏈上，此時體系靜電斥力較強，進一步抑制了蛋白質-蛋白質分子相互作用。當蛋白質/多糖質量比從5∶1增加到50∶1時，復合溶液的濁度曲線逐漸呈現先上升后下降的趨勢，表明在較高蛋白質濃度條件下促進了復合凝聚體的形成，此時FUC糖鏈可結合多個OVA分子。圖2c為不同蛋白質/多糖復配比復合凝聚物的外觀，質量比為50∶1與20∶1的樣品隨著pH值降低出現了明顯的宏觀相分離，而在5∶1的體系中未觀測到類似現象。相分離由熱力學不相容而產生的排除體積效應影響，而非絮凝作用[35]。綜上所述，當OVA/FUC質量比為20∶1時，OVA和FUC的結合達到飽和，二者在復合凝聚過程中形成最穩定的復合凝聚體。

圖2 不同生物聚合物質量比OVA-FUC復合溶液的濁度（a）、臨界pH值（b）和外觀（c）隨pH值的變化Fig.2 pH-Dependent changes in turbidity (a),critical pH (b) and appearance (c) of OVA-FUC mixed solutions with different mass ratios

2.1.3 離子強度對OVA/FUC復合凝聚的影響

鹽離子可通過靜電屏蔽作用調控生物聚合物之間的相互作用。本實驗以OVA/FUC質量比20∶1為條件制備復合溶液，分析NaCl濃度對OVA與FUC復合凝聚過程的影響。如圖3a所示，隨著NaCl濃度的增加，復合體系的濁度曲線在pH＜pHmax后逐漸趨于平緩。特別是當鹽濃度大于50 mmol/L時，復合溶液的濁度曲線有一個較寬的平臺期。當鹽濃度大于200 mmol/L時，濁度由于強靜電屏蔽效應而顯著提升，溶液的表觀形貌進一步證明了該變化趨勢（圖3a、c）。如圖3b所示，隨著鹽濃度的增加，pHc與pHφ1均呈現先上升后下降的趨勢，而pHmax在鹽濃度提升至100 mmol/L時消失。這一現象可解釋為在低鹽濃度（0～100 mmol/L）條件下，鹽離子可在一定程度上提高生物聚合物的溶解度，促進形成生物聚合物之間的靜電引力，誘導凝聚體形成。在高鹽濃度下，NaCl的競爭性吸附抑制了OVA和FUC之間的靜電引力，導致臨界pH值的降低。Liu Jingbo等[9]對OVA/硫酸葡聚糖的相行為研究中同樣觀測到類似變化趨勢。

圖3 不同NaCl濃度OVA-FUC復合溶液的濁度（a）、臨界pH值（b）和外觀（c）隨pH值的變化Fig.3 pH-Dependent changes in turbidity (a),critical pH (b) and appearance (c) of OVA-FUC mixed solutions with different NaCl concentrations

2.2 OVA/FUC復合凝聚物的Zeta電位分析

靜電引力是水溶液中復合凝聚體形成的主要驅動力[36]。此外，蛋白質和多糖的表面電荷種類與大小受溶液中環境條件的影響。通過測定OVA、FUC和OVA/FUC復合物的Zeta電位解析OVA/FUC復合物在復合凝聚過程中的靜電復合機理。如圖4a所示，在酸滴定過程中所有樣品的Zeta電位均逐漸增加。本研究中測得OVA的等電點為4.58，與之前的研究結果接近（等電點為4.5）[37]。當溶液的pH值大于OVA的等電點時，OVA分子帶負電，溶液pH值小于OVA等電點時則帶正電。FUC的pKa值極低，因此FUC溶液在整個酸性滴定過程中帶較高的負電荷[24]。當溶液pH值小于OVA等電點時，二者帶相反電荷，可在靜電引力的驅動下形成復合凝聚體。當pH值從6.0降至5.0時，所有樣品的Zeta電位均未發生明顯變化，且帶有一定量的負電荷（Zeta電位＜-20 mV），結合濁度滴定結果可知，可溶性復合物形成時（pH＝pHφ1）體系的凈電荷相對較高。此外，當溶液pH＜5.0時，OVA/FUC復合物（質量比為20∶1和50∶1）的表面電位迅速增加，在酸滴定過程中經歷了從帶負電到帶正電的過程。同時，OVA/FUC復合物（質量比為20∶1和50∶1）的等電點與pHmax幾乎相同（圖2a），表明當OVA/FUC復合物的凈電荷接近0時，凝聚體的堆積量達到最大。另外，當質量比＜20∶1時，過量的FUC導致復合物的Zeta電位增加幅度變小，在整個pH值范圍內帶凈負電荷。這與2.1.2節的結果相吻合，在比例小于20∶1時沒有檢測到濁度的最大值。

圖4 不同質量比（a）和不同NaCl濃度（b）OVA/FUC復合物的Zeta電位變化Fig.4 Changes in zeta potential of OVA/FUC mixtures with different ratios (a) and different NaCl concentrations (b)

不同鹽濃度的OVA/FUC溶液（質量比為20∶1）中Zeta電位與pH值的關系如圖4b所示。在不含NaCl的溶液中，OVA/FUC的等電點為4.07。鹽離子的添加使復合物的等電點發生了輕微的左移，并且復合物的等電點隨著溶液中NaCl的濃度升高而降低，這是由于NaCl的靜電屏蔽作用[38]。在較高的離子強度下（c（NaCl）≥100 mmol/L），過量的離子屏蔽了聚合物的帶電活性位點，OVA和FUC之間的靜電引力減少，這導致過多的硫酸基團無法與陽離子氨基基團結合。因此高NaCl濃度（c（NaCl）≥100 mmol/L）的復合溶液濁度在pH值小于OVA等電點時較高，且在低pH值時出現平臺期。此外，在整個pH值范圍內，OVA/FUC復合物Zeta電位絕對值與溶液中鹽濃度的變化趨勢相反。Zeta電位絕對的大小與系統的穩定性有關[39]，因此高鹽濃度會導致體系的穩定性降低。Ding Lan等[40]也發現了類似的結果，NaCl的加入導致殼聚糖/酪蛋白混合物Zeta電位的降低，促進了復合物聚集的形成，降低了復合物的穩定性。綜上，靜電相互作用為OVA/FUC凝聚體形成的主導力，且當復合物的濁度達到峰值（pHmax）時，OVA與FUC帶有相反電荷。

2.3 OVA/FUC復合體內蛋白質構象解析

2.3.1 內源熒光光譜分析

在蛋白質/多糖復合體系中，蛋白質的分子結構變化與二者的復合凝聚過程密切相關。本研究進一步分析OVA與FUC在共溶區間（pH 6.0）和靜電復合凝聚區間（pH 4.5）條件下的熒光光譜。由圖5a可知，pH 6.0條件下復合物的熒光強度峰值改變，表明OVA分子的內部構象發生了變化。與單一OVA溶液相比，少量FUC加入（質量比為10∶1、20∶1、50∶1）使OVA熒光光譜出現一定程度的猝滅。然而，當復合體系中的FUC過量時（質量比為5∶1、1∶1），OVA的熒光強度峰值顯著提高，這表明蛋白質內部熒光基團周圍微環境的極性增加和疏水性降低[41]。在pH 4.5時，OVA及OVA/FUC復合物的熒光強度顯著提升（圖5b），這與酸性條件下蛋白質分子展開導致熒光基團暴露有關[42]。值得注意的是，當OVA/FUC的質量比為5∶1和1∶1時，OVA熒光強度的最大值提升了5 倍。由相行為和Zeta電位結果可知，pH 4.5條件下質量比為5∶1和1∶1的OVA/FUC復合物處于可溶性復合凝聚體區，此時復合體系中過量的聚陰離子抑制了OVA的聚集，使OVA分子在酸性條件下充分展開，熒光基團大量暴露[43]，從而導致熒光強度顯著提高。此外，在共溶區間內FUC所有比例的復合均使OVA熒光峰值發生了明顯的紅移，這是由于OVA/FUC復合物的形成可能改變了OVA內部色氨酸殘基所處的極性疏水微環境[44]，說明疏水相互作用也參與了OVA/FUC復合物的形成。

圖5 不同生物聚合物比例下OVA/FUC復合物在pH 6.0（a）與pH 4.5（b）條件下的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of OVA/FUC mixtures with different ratios at pH 6.0 (a) and pH 4.5 (b)

2.3.2 CD分析

為進一步分析OVA與FUC復合凝聚過程中二者之間相互作用的分子機制，測定在pH 6.0與pH 4.5條件下不同比例OVA/FUC復合物的蛋白質二級結構變化，結果如圖6所示。蛋白質中α-螺旋的特征峰位于約208 nm和222 nm波長處，β-折疊和β-轉角的特征峰位于約216 nm和206 nm波長處[27]。如圖6a、b所示，單一OVA的光譜峰值位于約222 nm，FUC的加入使所有樣品的光譜峰發生了不同程度的藍移，表明OVA/FUC復合物中蛋白質分子的二級結構發生了變化。在pH 6.0的復合溶液中，少量FUC的加入降低了OVA光譜峰的強度（質量比≥10∶1）。相反，過量的FUC會導致OVA光譜的峰值增大（質量比＜10∶1）。而當復合溶液的pH值為4.5時，任何添加量的FUC均會使OVA光譜峰的強度降低，此時OVA的二級結構發生顯著變化。由此可見，FUC的復合凝聚改變了OVA的二級結構構象（α-螺旋與β-折疊）[45]。

圖6 OVA和OVA/FUC復合溶液在pH 6.0（a、c）和pH 4.5（b、d）時的CD及其二級結構的相對含量Fig.6 Circular dichrogram spectra and relative contents ofsecondary structure of OVA and OVA/FUC mixtures at pH 6.0 (a and c) and pH 4.5 (b and d)

為了進一步量化FUC復合對OVA二級結構的影響，使用BESTSEL軟件分析了蛋白質二級結構的含量，結果如圖6c、d所示。當pH 6.0時，FUC的添加對OVA的二級結構的影響不顯著。當pH 4.5時，FUC的存在使OVA的α-螺旋含量下降而β-折疊含量上升，這表明添加FUC后OVA分子發生了一定程度的解螺旋。此外，FUC對OVA的解螺旋效應在50∶1時達到最大值，而在1∶1時達到最小值，該變化歸因于溶液中過量的陰離子對OVA二級結構變化的抑制作用。Zhang Ting等[43]在蛋清蛋白與硫酸葡聚糖的相互作用研究中也發現了類似現象。Tang Honggang等[46]同樣發現帶有硫酸基團卡拉膠的復合作用促進了蛋清蛋白分子α-螺旋向β-折疊的轉變。然而大量研究表明，除硫酸化多糖外的其他陰離子多糖（如羧甲基纖維素）與蛋白質的靜電復合對蛋白質的二級結構無顯著影響，這一現象可能與多糖中的硫酸基團有關。

2.4 OVA/FUC復合凝聚體流變學特性分析

為更深入地了解OVA/FUC凝聚體的宏觀特性，利用頻率掃描進一步探究了在pH 4.5條件下NaCl濃度和OVA/FUC質量比對凝聚體黏彈性的影響。儲能模量（G’）反映復合體系的黏彈性，是溶液中大分子相互交聯形成大尺寸聚集體的結果[47]。如圖7a所示，復合溶液的G’隨著FUC的添加呈現先上升后下降的趨勢，且在OVA/FUC質量比為20∶1時達到最大值，表明在該條件下復合溶液中蛋白質分子間的交聯程度達到最大，聚集體的尺寸達到最大。相反，當質量比為5∶1或1∶1時，OVA/FUC復合物的G’遠低于OVA，這一結果與相行為結果基本相符，此條件下的OVA/FUC復合物處于可溶性復合凝聚階段和共溶階段，體系中大量的聚陰離子阻礙了蛋白質分子的進一步聚集。Niu Fuge等[48]研究表明，由于空間位阻效應，高度支化的多糖在混合體系中比線性大分子難以形成交聯結構。因此，過多的FUC削弱了復合體的復合凝聚過程中的聚集行為。不同鹽濃度下的流變結果表明，隨著鹽濃度的增加，樣品的G’呈現先減小后增加的趨勢（圖7b）。這可能是由于在pH 4.5溶液體系中少量鹽的加入會抑制OVA與FUC之間的相互作用，削弱復合物的相互交聯。在50 mmol/L的NaCl濃度下，體系的G’最低。然而，當NaCl濃度達到400 mmol/L時，OVA/FUC凝聚體的G’達到最大值。這可能是由于高鹽促進了OVA分子的變性，從而促進了OVA分子間的聚集。這些結果與濁度和Zeta電位隨離子強度的變化基本一致。綜上所述，體系中過量蛋白質或多糖的存在影響凝聚體的G’，這歸因于體系的排斥力和空間位阻效應。當蛋白質/多糖結合接近飽和時，復合體系作為一個電中性的整體，分子間排斥力最小，導致OVA/FUC質量比為20∶1的復合物表現出最高的G’。

圖7 pH 4.5條件下不同質量比（a）和NaCl濃度（b）的OVA/FUC復合溶液的G’Fig.7 G’ of OVA/FUC mixtures with different mass ratios (a) and NaCl concentrations (b) at pH 4.5

3 結論

本實驗探究了pH值、離子強度和生物聚合物質量比對OVA和FUC復凝聚相行為的影響。隨著OVA/FUC復配比的增加，可以與FUC結合的OVA分子數量增加，復合物的臨界pH值（pHc和pHφ1）向高pH值方向移動。當OVA/FUC的質量比從1∶1增加到5∶1時，由于OVA和FUC之間強烈的靜電相互作用，沒有出現明顯的pHmax。形成復合物的最佳OVA/FUC質量比是20∶1，它表現出最高的濁度，且具有較高的儲能模量。OVA和FUC之間的靜電相互作用具有顯著的鹽離子依賴性。當鹽的濃度小于100 mmol/L時，復合物的臨界pH值向更高的pH值方向移動，表明低鹽離子濃度可促進復合凝聚體的形成。然而當鹽濃度大于100 mmol/L時，靜電屏蔽效應會改變OVA與FUC之間的靜電復合狀態，臨界pH值顯著下降。同時，FUC的加入改變了OVA蛋白質的分子構象，促進了OVA的解螺旋和三級結構的展開。綜上所述，通過改變OVA和FUC溶液的復合條件可以調控二者的復合凝聚特性，本研究可為設計基于OVA/FUC復合物的新型水凝膠和功能性納米載體奠定理論基礎。