馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種real-time PCR檢測方法的建立與應用

呂厚姣，李欣媛，白小佳，賈龍剛，耿偉濤，王艷萍

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

馬乳酒樣乳桿菌在伯杰氏細菌分類鑒定中屬于乳桿菌科、乳桿菌屬，馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種（Lactobacilluskefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）是其中一個亞種[1]。馬乳酒樣乳桿菌具有抗菌[2-3]、抗腫瘤[4-5]、免疫調節[6-7]、抗過敏[8]、腸道微生物群[9-10]等益生作用。2021年中國衛健委發布通知，將馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種列為新食品原料。因此，未來該菌株有望在食品藥品等領域得到廣泛應用。由于采用目前常規檢驗方法不能有效地檢出該菌種，因此，需要建立特異性、靈敏度和重復性高的快速檢測方法。

目前根據GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》，乳酸菌檢測方法為平板計數法[11]，其中乳桿菌采用平板傾注法[12]。但是該方法對有些混合體系中多種乳桿菌或亞種不能進行區分，而且操作時間長，并且顯著低估細菌豐度[13-16]。隨著生物學技術的發展，一些現代分子生物學的方法已經廣泛應用于乳酸菌的定性和定量檢測[17-19]，比如流式細胞術[20]、熒光原位雜交技術[21]及實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）[22]等。相比于傳統的技術方法，現代分子生物學方法方便、快捷、精確度及靈敏度高[23-25]。其中real-time PCR方法將PCR方法和熒光報告化學相結合，監測模板擴增，根據由具有已知濃度或拷貝數的連續稀釋標準樣品（通常是10 倍稀釋液）構建的校準曲線確定樣品中靶DNA的絕對量[26]。

本研究以馬乳酒樣乳桿菌的模式菌株馬乳酒樣乳桿菌亞種ZW3菌株為研究對象，通過對馬乳酒樣乳桿菌ZW3的16S rDNA序列和全基因組序列進行分析，以期獲得馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物序列信息，確定特異性引物，建立PCR和real-time PCR的檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度和重復性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌株見表1。

表1 實驗菌株Table 1 Strains used in this study

細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、溶菌酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；2×SYBR Green Fast qPCR Mix 北京百邁客生物科技有限公司；DNA Marker III、Trans2K Plus II DNA Marker 北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖、核酸染料 美國Genview公司；M17培養基 青島海博生物科技有限公司；異丙醇、無水乙醇 天津江天化工技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀、5415D型離心機 德國Eppendorf公司；DYY-III-6B型穩壓穩流電泳儀、DYCZ-24D型電泳槽北京六一儀器廠；超微量分光光度計 英國BioDrop公司；全自動凝膠成像儀、C1000TMreal-time PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

取過夜培養的細菌菌液，加入離心管中，室溫8 000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌體。按照DNA提取試劑盒說明提取細菌基因組DNA。

將提取好的細菌基因組DNA用超微量分光光度計檢測濃度和純度。

1.3.2 馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物設計

從NCBI數據庫下載馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種和在發酵食品中經常食用的常見益生菌，如發酵黏液乳桿菌（Limosilactobacillusfermentum）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（L.delbrueckiisubsp.bulgaricus）、唾液鏈球菌嗜熱亞種（S.salivariussubsp.thermophilus）、植物乳植桿菌（L.plantarum）、羅伊氏黏液乳桿菌（L.reuteri）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）等的16S rDNA序列和其他基因DNA序列，利用DNAMAN軟件進行序列對比，找尋序列差異性較大的片段，用Primer 5.0軟件進行數據分析得到初步引物，將得到的引物序列通過NCBI數據庫進行BLAST查詢驗證，比對結果與馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA序列匹配，將此引物作為候選應用到下一步實驗中。

1.3.3 引物初篩實驗

以提取的馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的全基因組DNA為模板，用所設計的引物進行目標基因PCR擴增后，經凝膠電泳實驗進行篩選。

1.3.4 引物驗證實驗

將提取的植物乳植桿菌MA2、植物乳植桿菌BC 299、馬乳酒樣乳桿菌1207等的全基因組DNA利用篩選的特異性引物進行PCR擴增，然后進行電泳實驗，對特異性引物進行驗證。

1.3.5 PCR條件與檢驗

PCR體系共20 μL，其中10 μL 2×RapidTaqMaster mix，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補齊至體積20 μL。

PCR條件：95 ℃預變性8 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共進行35 個循環；最后72 ℃延伸10 min。

凝膠電泳：PCR結束后取1 μL的反應產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像儀分析結果并照相收集數據。

1.3.6 real-time PCR

real-time PCR體系共20 μL，其中SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補齊至體積20 μL。real-time PCR條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40 個循環，在每個循環末收集熒光信號。

1.3.7 方法特異性、靈敏度和重復性檢測

特異性驗證：以馬乳酒樣乳桿菌、植物乳植桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的基因組DNA為模板，采用篩選出的馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物對，以滅菌ddH2O作為陰性對照（NTC），進行real-time PCR擴增，測試方法的特異性。

靈敏度驗證：將馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA原液進行10 倍梯度稀釋，以稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 μg/mL的DNA為模板，利用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的特異性引物，以滅菌ddH2O作為陰性對照（NTC），每個質量濃度設置3 個平行，進行real-time PCR，找出檢測為陽性時的最低濃度。

重復性驗證：采用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的5 個不同的質量濃度，每個樣本重復3 次，計算循環閾值（Cq）的標準偏差（standard deviation，SD）和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.8 標準曲線的建立

從馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種菌株菌液10 倍稀釋液中提取DNA進行real-time PCR擴增，以標準菌株已知量的不同菌株對數值（lg（CFU/mL））為橫坐標，采用馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種特異性基因引物擴增，以反應過程中出現熒光信號的Cq為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程。

1.3.9 real-time PCR檢測方法的應用

依照1.3.1節的方法對需要檢測的不同菌株及混合體系的DNA進行提取，應用特異性引物進行PCR驗證，然后進行real-time PCR驗證，判斷本方法的檢測特異性。

1.4 數據分析

應用軟件LightCycler?96 SW對實驗所得數據進行分析；real-time PCR圖為軟件自動生成。利用Excel 2021軟件進行數據處理及表格繪制。

2 結果與分析

2.1 細菌基因組DNA的濃度和純度檢測結果

通過DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA后，經超微量分光光度計檢測所有細菌基因組DNA質量濃度均在200～2 000 μg/mL之間，A260nm/A280nm的值均在1.8～2.0之間（表2），說明DNA提取濃度較高，其他雜質污染較少、純度較高，滿足后續實驗要求。

表2 細菌基因組DNA提取結果Table 2 Results of bacterial genomic DNA extraction

2.2 馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種特異性引物設計結果

通過馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種與德氏乳桿菌保加利亞亞種、唾液鏈球菌嗜熱亞種、嗜酸乳桿菌、植物乳植桿菌、發酵黏液乳桿菌、羅伊氏黏液乳桿菌和干酪乳桿菌的16S rDNA序列及其他基因序列對比，找出序列相差較大的片段，通過Primer 5.0軟件進行數據分析后得到4 組引物（表3）。

表3 ZW3的引物序列Table 3 Primer sequences from ZW3

2.3 特異性引物的初篩結果

將提取的德氏乳桿菌保加利亞亞種、唾液鏈球菌嗜熱亞種和馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA用所設計的4 對引物進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，結果見圖1。根據16S rDNA設計的引物ZW3-引物-1和根據基因WANG_1283設計的引物ZW3-引物-2對各個細菌及負對照均有擴增條帶，可能原因是引物特異性差；根據基因WANG_1287設計的引物ZW3-引物-3對馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種出現擴增條帶，而引物ZW3-引物-4除了對馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種有明顯擴增條帶，對其他細菌的擴增條帶均不太明顯，因此可以得出引物ZW3-引物-4的特異性強，可進行下一步實驗。

圖1 不同特異性引物擴增目的片段的PCR結果Fig.1 Agarose gel electropherogram of PCR amplified fragments with different specific primers

2.4 特異性引物驗證結果

根據上述PCR結果，選擇引物ZW3-引物-4進一步驗證其特異性。將植物乳植桿菌MA2、植物乳植桿菌BC 299、馬乳酒樣乳桿菌XL 10、馬乳酒樣乳桿菌1207和馬乳酒樣乳桿菌ZW3提取的基因組DNA使用該引物進行PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2。可以看出，除了馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種外，其余菌株均在224 bp處無明顯條帶，可知該引物的特異性較好，可進行real-time PCR。

圖2 ZW3-引物-4特異性驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherogram showing the specificity of primer 4 from ZW3

特異性引物ZW3-引物-4來自基因WANG_1287，該基因被注釋為糖基轉移酶（glycosyltransferase，GT）2。GTs介導來自各種糖供體的糖的區域特異性和立體特異性轉移到各種重要的生物分子，包括聚糖、脂質、肽和小分子[19-20]。GT2酶類與蔗糖等二糖、脂多糖、殼聚糖的合成相關，在發酵乳中，這些物質尤其是多糖類化合物可能會影響發酵乳最終的黏度、持水性等特性。而ZW3的特點是高產胞外多糖，且根據王鑫磊等[21]的研究可知，添加ZW3可以增加發酵酸奶的黏度，因此該基因是一個關鍵特異性基因。

2.5 real-time PCR的建立

2.5.1 特異性檢測結果

根據普通PCR結果可得ZW3-引物-4具有較強的特異性，因此使用該引物進行real-time PCR驗證。將植物乳植桿菌MA2、植物乳植桿菌BC 299、馬乳酒樣乳桿菌XL 10、馬乳酒樣乳桿菌1207和馬乳酒樣乳桿菌ZW3提取的基因組DNA使用該引物在同一條件下同時進行real-time PCR，結果如圖3所示，除馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種出現標準的“S”形曲線，且Cq約為17，說明擴增效率高，其余菌株均未出現擴增，說明該引物特異性好，只對馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種有特異性擴增。

圖3 特異性引物驗證曲線Fig.3 Specific primer validation curves

2.5.2 靈敏度驗證結果

將ZW3的DNA質量濃度稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 μg/mL共7 個梯度進行real-time PCR，檢測反應體系的靈敏度，擴增曲線如圖4所示，0.000 5 μg/mL和0.000 1 μg/mL的擴增曲線與NTC組相重合，并根據表4可知，NTC組的Cq平均值為31.74，為了保證實驗數據的可信度，選擇Cq≤30時為陽性檢出。在質量濃度為0.001 μg/mL時，Cq為29.87，因此本實驗方法最低可以檢測質量濃度為0.001 μg/mL。

圖4 特異性引物靈敏度的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of specific primers sensitivity

表4 靈敏度測試結果Table 4 Sensitivity test results

2.5.3 重復性驗證結果

以20、2、0.2、0.02、0.002 μg/mL 5 個馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的DNA質量濃度進行重復性實驗，結果見表5，對所得的Cq進行統計學分析。馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的5 個質量濃度樣品Cq的SD在0.05～0.23之間，RSD在0.26%～0.95%之間，小于1%，在可接受范圍內，因此，建立的real-time PCR檢測體系具有較好的重復性。

表5 重復性實驗結果Table 5 Repeatability test results

2.5.4 標準曲線的建立

以馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL的10 倍連續稀釋液作為反應模板，建立標準曲線，其中不同梯度稀釋液的擴增曲線見圖5，建立的標準曲線如圖6所示。回歸方程為y＝-2.671x+30.719，決定系數R2為0.965，該曲線具有良好的線性關系。

圖5 不同濃度基因模板擴增目的基因擴增曲線Fig.5 Amplification curves of target genes amplified with gene templates at different concentrations

圖6 標準曲線的建立Fig.6 Establishment of standard curve

2.6 real-time PCR方法的應用

2.6.1 在馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種其他菌株純培養物檢測中的應用

real-time PCR方法建立后，為了檢測方法的實用性，使用本實驗室保藏的已知亞種的菌株進行驗證。馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW18、LK180和W182是本實驗室在中國科學院微生物研究所鑒定的已知亞種的3 種菌株。首先通過DNA提取試劑盒提取這3 株菌的DNA進行質量濃度和純度的檢測，3 株菌的DNA質量濃度均大于200 μg/mL，表明DNA濃度較好，且1.8＜A260nm/A280nm＜2.0，可用于后續特異性PCR和real-time PCR的檢測。

使用特異性引物對3 株菌進行real-time PCR檢測，結果如圖7所示，3 株菌均有明顯的“S”型擴增曲線，且Cq均在20左右，表明該特異性引物具有馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種特異性，且建立的real-time PCR方法可以特異性地檢測該亞種。

圖7 特異性引物對馬乳酒樣乳桿菌不同菌株的目標基因擴增曲線Fig.7 Amplification curves of target genes in different strains of L.kefiranofaciens with specific primers

2.6.2 在含有馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種及其他乳酸菌混合體系檢測中的應用

在實際應用中，益生菌通常都不是單獨使用，而是和其他益生菌共同使用[27]，因此從純培養物水平和純基因組DNA水平分別檢驗所建立的real-time PCR方法的抗干擾能力。純培養物水平檢驗結果如表6所示，添加德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種不影響該方法對馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的檢測。基因組DNA水平檢驗結果如表7所示，混合DNA體系中含有德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種的DNA不影響馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的檢測，且至少能檢出0.02 μg/mL的DNA。

表6 培養物水平混合體系的檢測結果Table 6 Resistance of real-time PCR to interferences from other lactic acid bacteria

表7 純基因組DNA水平混合體系的檢測結果Table 7 Resistance of real-time PCR to interferences from pure genomic DNA from other lactic acid bacteria

2.6.3 在含有馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種復合益生菌菌粉樣品檢測中的應用

本實驗使用含有德氏乳桿菌保加利亞亞種菌粉、唾液鏈球菌嗜熱亞種菌粉和馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3菌粉（3 株菌的添加比例為1∶1∶1）的復合益生菌菌粉混合體系進行驗證，以純馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3菌粉為對照，兩個體系的real-time PCR驗證結果如圖8所示，兩個體系均有明顯的擴增曲線，且兩個體系的擴增曲線距離較近，Cq差距也較小，表明添加其他菌粉不影響目標菌株的檢出，所建立的real-time PCR方法可以特異性地檢測該亞種。

圖8 混合菌粉的驗證Fig.8 Verification of real-time PCR using pure ZW3 and its mixture with other probiotics

3 討論與結論

馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種作為一種新資源食品原料，具有廣闊的應用前景，因此建立能夠簡單快速地檢測這種益生菌的方法至關重要。Kim等[28]通過將馬乳酒樣乳桿菌與其相似菌株的16S rDNA序列進行對比設計引物和探針，第一次應用real-time PCR法檢測對比了開菲爾粒和開菲爾牛奶中馬乳酒樣乳桿菌。但是目前檢測馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的方法鮮見報道。因此，本實驗通過real-time PCR方法特異性定性、定量馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種具有一定的現實意義。

本研究根據馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種ZW3的16S rDNA序列和全基因組序列設計引物，通過PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳實驗進行驗證，證明特異性引物ZW3-引物-4的特異性較強。通過該特異性引物建立了馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種的real-time PCR方法，特異性強、靈敏度高，檢出限為0.001 μg/mL，重復性好，建立realtime PCR的標準曲線，其決定系數R2為0.965，具有良好的線性關系，且在純培養物和混合體系中均能特異性檢出馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種。綜上，本研究為馬乳酒樣乳桿菌馬乳酒樣亞種檢測提供了一種特異、快速、靈敏的檢測方法。