神經酸對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用

瑪依樂·艾海提，劉垚杰，李建科

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119）

氧化損傷通常是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和積累引起，ROS由內源性代謝途徑的激活和外源性刺激產生。ROS是神經元變性和損傷的重要因素，通過脂質過氧化、蛋白質氧化和凋亡基因表達等細胞氧化損傷誘導細胞凋亡和壞死[1]。因此，維持ROS產生和消除的穩態可能對防止氧化損傷的發生具有重要作用[2]。研究表明，通過清除自由基緩解氧化應激對神經元的損傷，在神經退行性疾病的治療中有前景[3]。臨床前動物研究數據表明，單不飽和脂肪酸可能在多種情況下對減緩氧化應激相關疾病有效[4]。

神經酸（nervonic acid，NA）（順-15-二十四碳烯酸，C24:1）是中樞神經系統中主要的長鏈單不飽和脂肪酸，它是腦神經組織和神經細胞的核心天然成分[5-6]。NA是一種具有促進受損神經組織修復和再生作用的物質。然而，人體很難合成NA，因此需要從飲食中獲取NA[7]。元寶楓是中國特有的一種楓樹，其結實率和含油量都很高。元寶楓籽油主要由C16～C24脂肪酸組成，其中不飽和脂肪酸的含量高于90%，并且含有5%～7%的NA[8]。元寶楓籽油是NA的高質量來源，NA是21世紀最受歡迎的腦健康活性物質[9]。NA水平的降低與個體患精神病的高風險密切相關[10]，補充NA是一種公認的有效治療多種神經系統疾病的方法，如脫髓鞘疾病[11-13]。先前的研究表明，在x-腎上腺腦白質營養不良和多發性硬化癥等脫髓鞘疾病患者死后的腦髓鞘鞘脂中發現NA的含量減少，而飽和脂肪酸（例如C24:0和C26:0）的含量增加[14]。研究還表明，NA對于改善脫髓鞘疾病兒童和成人的健康至關重要，喂養富含NA的配方奶可促進嬰兒和早產兒的神經發育[15-16]。因此，NA與髓鞘和中樞神經系統的正常功能密切相關。先前的研究結果表明，神經酸可減輕紫杉醇誘導的PC12細胞和小腸隱窩上皮細胞IEC-6的凋亡損傷，并上調B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/Bcl-2相關X蛋白質（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達，下調細胞色素c表達[17-18]。核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種氧化還原敏感的核因子，在抗氧化防御系統中起著至關重要的作用，并控制下游抗氧化基因的表達，如血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）。kelch樣ECH關聯蛋白1（kelch-like ECHassociated protein 1，Keap1）是Nrf2的重要負調控因子，通過抗氧化反應元件相互作用，調節抗氧化蛋白的表達水平[19]。

因此，本實驗采用常用于研究神經退行性疾病的細胞模型PC12細胞，探討NA對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷和細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PC12細胞、大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（高分化）來源于中國科學院細胞庫。

NA（純度＞99%，CAS：506-37-6）美國Sigma-Aldrich公司；5%滅活胎牛血清、5%滅活馬血清、DMEM高糖培養基 美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、1%青鏈霉素混合液美國HyClone公司；H2O2（質量分數30%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、吐溫20、苯基甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）上海碧云天生物技術有限公司；Hoechst 33342染料、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒南京建成生物工程研究所；MTT、RIPA裂解液、DEPC水、總RNA提取試劑盒（TRIzol法）、cDNA反轉錄（Hiscript II Q RT Super Mix）試劑盒、定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）（Cham QTM SYBR qPCR Master Mix）試劑盒 南京維茲生物科技有限公司；抗Nrf2、Keap1、Caspase-3、HO-1、Bax、Bcl-2抗體、抗β-肌動蛋白抗體 美國Cell Signaling Technology公司；Omini-ECLTM基礎性化學發光檢測試劑盒上海雅酶生物醫藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CCL-170B-8型CO2恒溫培養箱 新加坡ESCO公司；DMI300B型熒光倒置顯微鏡 德國徠卡公司；Multiskan GO-1510型全波長酶標儀、Nanodrop 2000型微量核酸測定儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；CFX96型實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Bio-Best200E凝膠成像儀 美國SIM公司；TGL-16gR高速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與分組

細胞培養：PC12細胞在25 cm2的細胞培養瓶中培養，加入5%胎牛血清、5%馬血清、100 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素，在37 ℃、5% CO2濕化培養箱中培養24 h。每2～3 d更換一次培養液，每周2 次以1∶3的比例進行傳代培養[20]。

正常對照組（NC組）：100 μL細胞懸液+（棄掉原培養液）100 μL DMEM培養基+100 μL DMEM培養基。200 μmol/L H2O2處理組（MOD組）：100 μL細胞懸液+100 μL DMEM培養基+100 μL H2O2（用DMEM培養基稀釋的200 μmol/L H2O2）。0.1 μmol/L NA+200 μmol/L H2O2處理組（LN組）：100 μL細胞懸液+100 μL 0.1 μmol/L NA+100 μL 200 μmol/L H2O2。1 μmol/L NA+200 μmol/L H2O2處理組（HN組）：100 μL細胞懸液+100 μL 1 μmol/L NA+100 μL 200 μmol/L H2O2。

1.3.2 MTT實驗

將MTT溶解在磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，制成5 mg/mL儲備溶液，并在-20 ℃保存，用于檢測細胞活力。PC12細胞（1×105個/孔）接種在96 孔板中并培養1 d，使用體積分數為0.1% DMSO和不同濃度的NA（0.001、0.01、0.1、1、10、50 μmol/L）處理細胞24 h。丟棄培養基后，將5 mg/mL MTT溶液添加到每個孔（10 μL），并在37 ℃孵育3 h[21]，從每個孔中吸出培養基并加入150 μL DMSO溶液，于570 nm波長處測定OD值。實驗組為不同濃度NA處理的細胞液，空白組為沒有細胞的培養液，對照組為無NA處理的細胞液。細胞存活率按下式計算：

1.3.3 PC12細胞氧化損傷模型的建立

將密度為5×104個/孔的PC12細胞接種于96 孔板中，每孔接種100 μL細胞懸液。設置NC組（100 μL細胞懸液）和實驗組（100 μL細胞懸液）。在37 ℃和5%CO2濕化培養箱中培養24 h。然后把培養液棄掉，NC組中加入100 μL DMEM培養基，實驗組分別加入100 μL用DMEM培養基稀釋終濃度為50、100、200、500、800 μmol/L的H2O2，分別培養6、12、24、48 h后，采用MTT法測定細胞存活率。

1.3.4 NA干預H2O2誘導的PC12細胞活力測定

PC12細胞的活力由MTT法測定，將PC12細胞（5×104個/孔）接種于96 孔板中，設置NC組、MOD組、LN組和HN組，每孔接種100 μL細胞懸液。在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，NC和MOD組中各加入100 μL培養基，LN和HN組中分別加入終濃度為0.1、1 μmol/L的NA（根據NA的細胞毒性結果）預處理24 h后，NC組中加入DMEM培養基，MOD、LN和HN組中各加入DMEM稀釋的200 μmol/L H2O2繼續培養24 h后，采用MTT法測定細胞存活率[2]。

1.3.5 Hoechst 33342染色檢測

將PC12細胞（5×103個/孔）接種在6 孔板中，培養24 h。細胞處理采用1.3.4節中的方法。PC12細胞培養物在PBS（含質量分數為4%的甲醛）中4 ℃固定15 min，然后用5 μg/mL Hoechst 33342在黑暗中孵育細胞20 min，對細胞核進行染色。用PBS洗滌細胞至少2 次，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞[2]。染色質濃縮或細胞核碎裂的細胞被標記為凋亡細胞。

1.3.6 細胞內ROS的測定

通過氧化劑敏感探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）檢測細胞內ROS的熒光強度[21]。將PC12細胞（3×105個/孔）接種于6 孔板中，培養24 h。細胞的處理采用1.3.4節中的方法。處理結束后，棄培養液，用P B S 洗3 遍。然后加入無血清培養基稀釋的DCFH-DA（稀釋比例1∶1 000），37 ℃恒溫培養箱孵育20 min，用PBS洗3 遍，充分洗凈DCFH-DA，每孔加入1 mL PBS，在熒光顯微鏡下觀察拍照。用酶標儀測定熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

1.3.7 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、LDH水平、SOD和GSH-Px活性測定

將PC12細胞（2×105個/孔）接種于6 孔板中，培養24 h，按照1.3.4節中的方法分組處理細胞，然后加入1 mL細胞裂解液，10 000×g離心10 min，收集上清液，按照MDA、LDH、SOD和GSH-Px檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3.8 蛋白免疫印跡（Western blot，WB）檢測PC12細胞的蛋白表達情況

將PC12細胞（3×104個/孔）接種于6 孔板中，培養24 h，按照1.3.4節中的方法分組處理細胞，加入1 mL含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的細胞裂解液，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，收集上清液，獲得總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。將20 μg樣品在體積分數10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離蛋白，轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶在Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）中將膜在室溫條件下封閉2 h，用抗Nrf2、抗Keap1、抗HO-1、抗Bcl-2、抗Bax、抗Caspase-3和抗β-肌動蛋白抗體（稀釋比1∶1 000）在TBST中4 ℃孵育過夜。膜清洗后，在室溫條件下孵育二抗2 h。采用Omni-ECLTM基礎性化學發光檢測試劑盒檢測，并使用Bio-1D軟件分析蛋白表達情況。

1.3.9 基因表達情況檢測

將PC12細胞以4×105個/孔接種在6 孔板中，培養24 h，按照1.3.4節中的方法分組處理并收集細胞，用TRIzol試劑提取總RNA。取1 μL提取得到的RNA，使用微量核酸測定儀測定RNA純度和濃度，根據RNA濃度計算出cDNA反轉錄所對應的體積，在200 μL PCR管中依次加入相應試劑，總體積為20 μL，按照反轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄，得到的cDNA進行后續PCR擴增，保存于-20 ℃冰箱。然后進行實時PCR。β-肌動蛋白作為參照，使用2-ΔΔCt方法評估基因表達。PCR引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成，引物序列如表1所示。

表1 引物的相關信息Table 1 Information of primers used in this study

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 NA對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

從圖1A可以看出，NA在0.001～10 μmol/L范圍內對PC12細胞存活率與NC組無顯著差異（P＞0.05），這說明10 μmol/L及以下的NA對PC12細胞無毒副作用。然而，當濃度為50 μmol/L時，PC12細胞的活力受到顯著影響（P＜0.05）。因此，選擇0.1 μmol/L和1 μmol/L NA作為合適的干預濃度。圖1B顯示，隨著H2O2濃度的增加，對細胞增值的抑制程度也增加。與NC組相比，200 μmol/L H2O2處理24 h后，PC12細胞存活率為60.12%（圖1C）。為此，后續實驗設置H2O2濃度為200 μmol/L。如圖1D所示，在不同濃度的NA（0.1、1 μmol/L）預處理24 h后，用等量的NA和200 μmol/L H2O2聯合處理細胞24 h，其存活率顯著高于僅用H2O2處理組（P＜0.05）。從圖1D、E可以看出，NA處理組與MOD組相比，NA能顯著提高H2O2處理PC12細胞的存活率（P＜0.05）。如圖1F所示，在NC組中幾乎沒有檢測到凝聚核，而在H2O2損傷組中明顯出現明亮的凝聚核（箭頭所示），LN和HN組中這些現象明顯改善。綜上說明NA預處理對H2O2誘導的PC12細胞損傷有明顯的保護作用。

圖1 NA對H2O2誘導PC12細胞的保護作用Fig.1 Protective effect of NA on H2O2-induced PC12 cells

2.2 NA對PC12細胞內ROS和氧化損傷的影響

如圖2A、B所示，H2O2處理細胞24 h后，細胞中ROS積累迅速增加；然而，用NA處理的PC12細胞中，由H2O2誘導ROS水平的增加被減弱。結果表明NA可以抑制PC12細胞中ROS的產生。如圖2C～F所示，與NC組相比，MOD組的SOD和GSH-Px活性極顯著降低（P＜0.01），而LDH和MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與MOD組相比，NA處理可以顯著提高SOD和GSH-Px的活性（P＜0.0 5），顯著降低LDH 和MDA 含量（P＜0.05）。然而，SOD、GSH-Px、MDA和LDH水平的變化在LN和HN組之間無顯著差異（P＞0.05）。這些結果表明，NA可能對H2O2誘導損傷的PC12細胞具有保護作用。

圖2 NA對H2O2誘導PC12細胞中抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of NA on antioxidant activity in H2O2-induced PC12 cells

2.3 NA對H2O2誘導的相關凋亡蛋白表達水平影響

基于上述結果，本實驗證實NA可以保護PC12細胞遭受氧化損傷，因此進一步研究其潛在機制。如圖3所示，與NC組相比，MOD組Bcl-2/Bax的表達比例極顯著降低（P＜0.01）。然而，與MOD組相比，LN和HN組中Bcl-2/Bax的比值顯著上調（P＜0.05），與NC組相比，MOD組Caspase-3蛋白相對表達水平明顯升高（P＜0.01）。而與MOD組相比，LN和HN組的Caspase-3蛋白相對表達水平顯著下降（P＜0.05），然而，LN和HN組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。上述結果說明，NA可能抑制H2O2引起細胞凋亡的發生。

圖3 NA對H2O2誘導的相關凋亡蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of NA on the expression levels of apoptotic proteins in H2O2-induced cells

2.4 NA對H2O2誘導的Nrf2/Keap1/HO-1通路相關蛋白影響

如圖4所示，與NC組相比，MOD組中Nrf2和HO-1的相對表達量明顯減少（P＜0.05），而Keap1的相對表達量顯著增加（P＜0.05），然而HN組的處理明顯改善了這種趨勢（P＜0.05）。結果表明，NA可能通過Nrf2/HO-1信號途徑保護PC12細胞免受氧化損傷。

圖4 NA對H2O2誘導Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of NA on the expression levels of Nrf2/HO-1 signaling pathway related proteins in PC12 cells induced by H2O2

2.5 NA對H2O2誘導PC12細胞相關基因表達的影響

如圖5所示，與NC組相比，MOD組Nrf2、HO-1和Bcl-2基因的表達量極顯著降低（P＜0.01），而Keap1、Bax和Caspase-3基因的表達量明顯增加（P＜0.01）。與MOD組相比，NA預處理顯著上調Nrf2、HO-1和Bcl-2的表達水平（P＜0.05），并顯著下調Keap1、Bax和Caspase-3的表達水平。這些結果進一步驗證了上述實驗結果。

圖5 NA對H2O2誘導PC12細胞相關基因表達的影響（n＝3）Fig.5 Effect of NA on gene expression in H2O2-induced PC12 cells (n=3)

3 討論

大腦中氧化應激反應的增加被認為是引起神經系統疾病的主要因素之一[18]。許多研究通過使用抗氧化劑和飲食誘導等方法減少ROS造成的氧化損傷。研究發現，NA在人體細胞中具有潛在的抗氧化和神經保護作用[17-18,22]。本實驗利用PC12細胞作為模型探索NA對氧化應激的保護作用。結果顯示，在適當濃度下，NA可以保護PC12神經元細胞免受H2O2誘導的氧化損傷、抑制細胞內ROS的積累，并上調一系列與抗氧化和細胞凋亡相關蛋白及其基因的表達水平。這些結果表明，NA可能通過激活Nrf2通路保護PC12細胞免受氧化損傷。

H2O2作為一種具有相對穩定性質的重要ROS，經常被用作建立體外氧化損傷模型[23]。PC12細胞是常用的神經細胞株，具有一定的神經元特性，是研究神經元細胞生理病理過程的常用模型[24]。有研究表明，H2O2誘導的氧化損傷PC12細胞是研究某些藥物對神經元細胞是否具有保護作用分子機制最常用的細胞模型[25]。因此，本實驗選擇H2O2建立PC12細胞的氧化損傷模型，其特點是氧化和抗氧化反應處于不平衡狀態[26]。大腦特別容易受到自由基的攻擊和氧化損傷，因此維持大腦中氧化還原平衡對于防止氧化應激誘導的細胞損傷至關重要[27-28]。盡管神經退行性疾病的病因尚未得到充分探討，但氧化損傷已被確定在神經退行性疾病的潛在發病機制中發揮關鍵作用。NA是髓鞘鞘磷脂中的主要脂肪酸，在大腦和外周神經組織生長和神經系統的信號傳遞中起著重要的作用。然而，它在神經系統疾病中保護機制需要進一步研究。

NA被證明會影響各種細胞的活力和凋亡[15,17-18]。此外，NA可以完全穿過血腦屏障，直接作用于神經纖維進行修復和疏通，并誘導神經纖維自我生長和分裂[22]。Hu Dandong等[11]報道，NA可以劑量依賴性地減輕1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導PD模型小鼠的運動障礙癥狀，有顯著的改善作用。還有研究表明，NA可能通過Nrf2/ARE信號通路抑制氧化應激，從而降低實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠大腦中ROS的濃度，并增加SOD和過氧化氫酶的水平[22]。本研究發現H2O2對PC12細胞具有細胞毒性，并呈濃度依賴性。此外，Hoechst 33342染色和ROS檢測數據顯示，H2O2誘導PC12細胞凋亡。當用NA預處理時，H2O2誘導的PC12細胞活力顯著增加，細胞凋亡明顯被減弱，這進一步表明NA對H2O2損傷的PC12細胞具有保護作用。

ROS是各種疾病形成和發展的重要因素之一。細胞氧化損傷可產生過量的ROS，會損傷細胞DNA、蛋白質、脂質和細胞結構，并促進細胞死亡和凋亡[29-30]。前人的研究表明，H2O2通過提高ROS的水平增強氧化應激損傷[31-32]。因此，本實驗使用熒光探針和MDA試劑盒測定PC12細胞中ROS和MDA的產生量。結果表明，H2O2導致PC12細胞中ROS和MDA含量增加，然而，與H2O2處理組相比，NA預處理顯著抑制了這些異常變化，這可能與NA的抗細胞凋亡活性有關。

Bax、Bcl-2和Caspase-3等一系列凋亡相關蛋白是細胞死亡和細胞存活的主要調節因子[33-34]。本實驗研究了NA是否可以抑制H2O2誘導導致的細胞凋亡。結果表明，與NC組相比，H2O2顯著降低了Bcl-2/Bax的比值。然而，H2O2導致的凋亡被NA預處理顯著抑制。ROS通過激活Bax增強胞質Caspase-3活性。此外，Bcl-2家族蛋白，包括抗凋亡（Bcl-2）和促凋亡（Bax）成員，在凋亡通路的早期階段發揮關鍵作用[35]。據報道，Nrf2是抗氧化基因的重要轉錄激活因子[36]。本實驗結果表明，NA顯著抑制H2O2誘導的PC12細胞中HO-1水平升高和Keap1水平的降低，NA可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路減輕PC12細胞氧化損傷。

4 結論

本實驗結果表明，NA對H2O2誘導的PC12神經元細胞氧化損傷表現出良好的保護作用。這種保護作用主要表現為維持細胞形態的完整性和細胞生存活力，抑制H2O2引起的細胞凋亡，提高細胞抗氧化酶系統的表達和細胞抗氧化水平，其主要機制可能是激活Nrf2/HO-1信號通路。由此可見，NA是一種具有良好應用前景的食品功能因子。