短期服用蛹蟲草對不同狀態小鼠的免疫調節作用

張美娜，趙南南，廖思晴，王升厚，王 澤,3,*

（1.沈陽師范大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省功能性蛹蟲草重點實驗室，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽市功能性蛹蟲草產業技術研究院，遼寧 沈陽 110034）

機體的健康狀態取決于免疫功能是否能保持相對的平衡穩定，免疫力低下會增加患侵襲性真菌感染、癌癥和艾滋病等疾病的風險[1-2]，免疫力過強則容易導致過敏反應、系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風濕等自身免疫性疾病[3]。因此，針對不同的機體狀況，免疫系統通過正、負雙向的調節機制，產生匹配的免疫應答，保證機體維持正常健康的狀態。免疫調節劑是指具有增強或調節免疫功能的一大類物質，在臨床上廣泛用于感染性疾病、某些自身免疫病及腫瘤的輔助治療。研究顯示，食藥用真菌及其免疫調節蛋白、多糖等可以通過多途徑、多層面對免疫系統發揮作用，同時具有良好的食用安全性，被認為是具有醫療潛力的天然免疫調節劑。

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）是一種食藥用真菌和新資源食品，其含有豐富的蟲草素、噴司他丁及多糖等生物活性成分，具有增強機體免疫力、抗腫瘤及抗炎活性[4-6]。大量實驗研究證實，蛹蟲草對免疫抑制小鼠具有良好的免疫激活作用，可提高其免疫器官指數、白細胞數量、遲發性變態反應程度和血清溶血素含量[7]，具有促進脾臟T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖的作用，能夠促進免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgM分泌[8]。蛹蟲草胞外多糖可提高免疫抑制小鼠的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6的水平[9]。同時，蛹蟲草對正常機體免疫狀態是否存在影響，目前主要集中在體外實驗評估層面。研究顯示，蛹蟲草可增強自然殺傷細胞的體外細胞毒性[10]，蛹蟲草多糖可通過抑制PD-L1/PD-1軸，促進免疫抑制性巨噬細胞轉化為殺傷性巨噬細胞[11]，蛹蟲草的免疫調節蛋白可激活Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4/核因子（nuclear factor，NF）-κB通路，增加F-肌動蛋白表達，促進小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7對大腸桿菌的吞噬作用[12]。因此，本研究從體液免疫、細胞免疫及胃腸免疫3 個角度揭示蛹蟲草對正常小鼠免疫應答的影響，同時，輔以環磷酰胺小鼠免疫抑制模型，進一步探究蛹蟲草對免疫力低下機體的調節作用，以期為蛹蟲草在免疫調節劑方面的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級KM系小鼠（生產許可證號：SCXK（遼）2020-0002），中國食品藥品檢定研究院檢疫合格，雌雄各半，體質量18～22 g，于室溫（24±2）℃、相對濕度（55±5）%、自然光照條件下飼養；小鼠及鼠糧均購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

蛹蟲草子實體由遼寧省功能性蛹蟲草重點實驗室提供，60 ℃烘干后粉碎，過80 目篩網，獲得蛹蟲草干粉，-20 ℃密封保存待用。灌胃前，用蒸餾水充分溶解制備蛹蟲草水溶液，現配現用。

小鼠IL-2、IL-10定量酶聯免疫吸附測試（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；小鼠血清IgG、IgM定量ELISA試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的抗小鼠CD4單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗小鼠CD3單克隆抗體、PerCP-Cy5.5標記的抗小鼠CD8a單克隆抗體 美國BioLegend公司；RNAiso Plus 日本TaKaRa公司；GoScriptTM逆轉錄系統、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒 美國Promega公司。

1.2 儀器與設備

F50型酶標分析儀 瑞士帝肯公司；BD FACSCanto IIL流式細胞儀 美國碧迪醫療器械有限公司；ABI Q6實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正常小鼠的蛹蟲草灌胃處理

KM系小鼠適應性飼養2 d后，隨機分為空白組（ZC組）、低倍組（DB組）及高倍組（GB組），每組10 只。按中華人民共和國衛生部公告（2009年第3號）中正常成人蛹蟲草推薦服用劑量2 g/60 kgmb計算[13]，根據Meeh-Rubner公式計算小鼠服用基礎劑量，DB組灌胃劑量為0.61 g/kgmb，GB組為1.52 g/kgmb，蛹蟲草水溶液連續灌胃21 d，0.5 mL/只，ZC組灌胃同等體積的蒸餾水。

1.3.2 小鼠的日常狀態觀察及解剖

每天觀察記錄小鼠的毛發、精神、活動等日常狀態，記錄小鼠體質量、日飲水量及日進食量。末次灌胃結束后，各組小鼠眼球取血，分離血清，于-20 ℃保存備用。解剖并稱取肝臟、腎臟、脾臟及胸腺的質量，按下式計算臟器指數：

1.3.3 小鼠血清細胞因子和Ig含量的檢測

隨機選用小鼠血清樣本（n＝3），分別設置實驗孔和空白孔，3 個復孔，其中IL-2和IL-10血清樣本按體積比1∶1稀釋至50 μL加入實驗孔，IgG和IgM血清樣本1∶1稀釋至100 μL加入實驗孔，空白孔為等體積的樣本稀釋液，按照試劑盒要求進行ELISA檢測操作，酶標儀450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.3.4 小鼠外周血T淋巴細胞亞群的檢測

取小鼠抗凝血100 μL，加入1 mL紅細胞裂解液，4 ℃裂解10 min；用磷酸鹽緩沖液洗2 次，取1×106個/mL細胞懸液500 μL，依次加入1 μL PE標記的抗小鼠CD4單抗、2 μL FITC標記的抗小鼠CD3單抗、3 μL PerCP-Cy5.5標記的抗小鼠CD8a單抗，避光染色30 min，流式細胞儀上機檢測CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群數量。

1.3.5 小鼠腸道菌群多樣性的高通量檢測

分別取ZC組、DB組和GB組盲腸內新鮮糞便，置于無菌凍存管中，-80 ℃冰箱中保存。采用QIAGEN DNA提取試劑盒提取各組盲腸內容物樣本總DNA，并通過核酸定量熒光計進行總DNA質檢；以通用上游引物（5’-3’）CCTACGGGNGGCWGCAG和下游引物（5’-3’）GACTACNVGGGTATCTAAT對各樣本腸道菌群16S rRNA V3～V4區進行擴增，純化后的PCR產物通過Illumina平臺進行Paired-End測序；利用Usearch軟件聚類分析并注釋操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）；R語言計算樣本組間共有和特有OTU，并進行樣本間的主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA），α多樣性指數圖由QIIME軟件繪制。不同分類水平腸道菌群組成分析通過LEfSe軟件選取各組小鼠腸道重要菌群，并對優勢菌群進行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

1.3.6 小腸TLRs/NF-κB通路相關因子的檢測

取ZC組、DB組和GB組小鼠空腸組織，采用試劑盒提取總RNA，超微量分光光度計檢測其濃度和純度，取1 μg進行電泳檢測，-80 ℃保存樣品。按照GoScript?逆轉錄系統試劑盒步驟得到cDNA，反轉錄反應條件：25 ℃孵育5 min；42 ℃孵育1 h；70 ℃孵育15 min，終止反應。以β-actin為內參基因，擴增目的基因TLR2、TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor，MyD88）、NF-κB的mRNA序列，其中引物見表1，realtime PCR體系：2×GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、DEPC水8.2 μL。real-time PCR擴增程序：每個樣品設置3 個重復，95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；共40 個循環。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.7 免疫抑制小鼠的蛹蟲草灌胃與檢測

KM系小鼠隨機分為空白組（CK組）、模型組（MD組）和蛹蟲草灌胃組（MDY組），每組10 只，MD組和MDY組分別腹腔注射80 mg/kgmb環磷酰胺溶液（0.5 mL/只），連續3 d，誘導小鼠免疫抑制[14]?；趯φＰ∈蠊辔笇嶒灲Y果，MDY組采用DB組灌胃劑量標準，0.61 g/kgmb蛹蟲草水溶液連續灌胃21 d（0.5 mL/只），CK組和MD組灌胃同等體積蒸餾水。在灌胃0、7、14、21 d分別開展免疫相關指標的檢測，具體操作見1.3.2～1.3.4節。

1.4 數據處理

實驗數據采用Excel 2019軟件進行整理，采用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析法對數據進行統計分析，數據以±s表示，顯著性檢驗水平α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠免疫狀態的影響

2.1.1 對基礎免疫狀態的影響

如圖1所示，相較于ZC組，GB組進食量、飲水量出現顯著降低的情況，各組小鼠體質量、臟器指數之間均無顯著差異（P＞0.05）。蛹蟲草灌胃第21天，小鼠血清IgG和IgM水平出現較為明顯的升高，其中DB組血清IgG水平由ZC組的（105.63±15.31）ng/mL上升為（136.26±20.41）ng/mL，GB組上升至（120.95±10.97）ng/mL，但均未達到顯著水平（P＞0.05）。與ZC組相比，DB組外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群含量小幅度升高，但無顯著差異（P＞0.05），各組間CD4+/CD8+值也無顯著差異（P＞0.05）。各實驗組IL-2和IL-10血清水平均未產生明顯改變（P＞0.05）。

圖1 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠基礎免疫狀態的影響Fig.1 Effects of different doses of C.militaris on the basal immune status of normal mice

2.1.2 對小鼠腸道菌群的影響

α多樣性分析顯示，ZC組Shannon指數及Chao1指數最低，ZC、DB、GB 組的Chao 1 指數分別為317.11±18.54、330.27±13.13、355.36±6.31，Shannon指數分別為6.17±0.24、6.66±0.22、6.76±0.07，蛹蟲草灌胃處理后小鼠腸道菌群豐富程度和多樣性均上升（圖2A、B）。PCoA結果顯示，各組樣本位于不同的象限，相對于組間距離，組內距離較小，3 組小鼠腸道菌群的組成結構存在明顯差異（圖2C）。3 組共有OTU 328 個，其中ZC組特有OTU 1 個、DB組3 個、GB組10 個（圖2D），GB組與ZC組間OTU數量存在顯著差異。測序所得OTU主要分布在7 個門、12 個綱、15 個目、20 個科、38 個屬，Firmicutes、Bacteroidetes及Proteobacteria為各組豐度最高的三大菌門；與ZC組相比，DB組和GB組Firmicutes豐度顯著下降，DB組和GB組Bacteroidetes豐度顯著升高（圖2E、F）。圖2G為各組相對豐度＞1%的前20 名菌屬，其中Lactobacillus、ClostridiumXIVa、Lachnospiracea_incertae_sedis、Alistipes、Helicobacter為各組相對豐度最高的5 個菌屬，各實驗組中Lactobacillus和Alistipes相對豐度均顯著升高（P＜0.05），ClostridiumXIVa、Helicobacter及Lachnospiracea_incertae_sedis顯著降低（P＜0.05）。依據LDA得分＞2，共獲得5 個對組間腸道細菌差異具有顯著影響的菌屬，其中，Helicobacter為3 組的共有菌屬，各實驗組小鼠腸道Helicobacter的豐度顯著降低（P＜0.05），GB組出現Bifidobacterium、Ruminococcus和Turicibacter的富集，未檢測到Clostridium_sensu_stricto（圖2H）。

圖2 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠腸道菌群的影響Fig.2 Effects of different doses of C.militaris on the intestinal flora of normal mice

2.1.3 對腸道TLRs/MyD88/NF-κB信號通路的影響

如圖3所示，相較于ZC組，不同劑量蛹蟲草灌胃均引起小鼠空腸TLR4mRNA表達量的顯著降低（P＜0.05），DB組TLR2、MyD88mRNA表達水平極顯著上調（P＜0.01），說明低劑量蛹蟲草顯著激活TLR2/MyD88信號通路；但GB組TLR2表達處于抑制狀態（P＜0.01），MyD88表達量未發生顯著改變（P＞0.05）。同時，DB組和GB組NF-κBmRNA的表達量均處于下調狀態，GB組顯著低于DB組（P＜0.05），并具有劑量依賴性。

圖3 不同劑量蛹蟲草對正常小鼠腸道TLRs/NF-κB信號通路的影響Fig.3 Effects of different doses C.militaris on the intestinal TLRs/NF-κB signaling pathway in normal mice

2.2 蛹蟲草對免疫抑制小鼠免疫狀態的影響

2.2.1 對免疫抑制小鼠基礎生理狀態的影響

如圖4A～C所示，環磷酰胺導致小鼠體質量、進食量、飲水量顯著下降，毛發明顯稀疏，脾臟和胸腺指數顯著減小（P＜0.05）。蛹蟲草灌胃期間，MD組和MDY組小鼠體質量、進食量、飲水量一直顯著低于CK組。至21 d，MDY組毛發狀態接近CK組，MD組毛發稀疏仍然明顯（圖4D）。如圖4E～H所示，相對于MD組，MDY組各臟器指數更接近CK組。灌胃第7天，MD組和MDY組肝臟及脾臟指數顯著上調（P＜0.05），并達到峰值。此后MD組和MDY組肝臟指數、脾臟指數均呈現降低的趨勢，至灌胃第14天，MDY組和MD組小鼠脾臟、腎臟和胸腺指數與CK組無顯著差異（P＞0.05）；灌胃21 d，MD組小鼠肝臟指數仍顯著高于CK組（P＜0.05），MDY組已恢復正常水平。

圖4 蛹蟲草對免疫抑制小鼠基礎生理狀態的影響Fig.4 Effects of C.militaris on the basic physiological state of immunosuppressed mice

2.2.2 對免疫抑制小鼠免疫狀態的影響

如圖5所示，環磷酰胺處理導致正常小鼠血清IgG、IgM和IL-2含量，及外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞亞群數量和CD4+/CD8+值顯著降低（P＜0.05），血清IL-10含量顯著升高（P＜0.05），小鼠處于典型的免疫抑制狀態。灌胃期間，MDY組和MD組的小鼠血清IgG及IgM含量均呈現緩慢上升的狀態，灌胃第7天，均與CK組已無顯著差異（P＞0.05），至灌胃第21天，MDY組IgG質量濃度由CK組的（78.40±32.82）ng/mL上升至（118.39±15.31）ng/mL，IgM質量濃度由CK組的（1.86±0.26）ng/mL上升至（2.67±0.40）ng/mL，顯著高于其他兩組（P＜0.05）。蛹蟲草灌胃期間，MDY組外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞亞群數量始終高于MD組，并早于MD組恢復至CK組的水平。灌胃14 d開始，MD組IL-2質量濃度持續降低，由CK組的（103.62±9.15）pg/mL下降至（88.61±2.28）pg/mL，MDY 組I L-2 含量在灌胃第7 天與CK 組無顯著差異（P＞0.05）。至灌胃結束，各實驗組血清IL-10含量始終高于CK組（P＞0.05）。

圖5 蛹蟲草對免疫抑制小鼠免疫狀態影響Fig.5 Effect of C.militaris on immune status in immunosuppressed mice

3 討論與結論

免疫應答是由免疫器官、免疫細胞、體液因子和細胞因子組成的、相互協作的功能網絡。本實驗首先從臟器指數、血清IgG、IgM、IL-2和IL-10水平及外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞數量幾個方面評價了蛹蟲草對正常小鼠免疫應答的影響，研究結果顯示，雖然不同劑量蛹蟲草對上述檢測指標均未產生顯著影響（P＜0.05），但是檢測到DB組小鼠血清IgG及IgM水平、外周血CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞亞群數量均出現不同程度的升高。這說明低劑量蛹蟲草從某種程度上可以影響正常機體的抗體分泌和T淋巴細胞增殖，但是不會引起機體免疫狀態的失衡。因此，選用DB組蛹蟲草灌胃劑量開展后續實驗。

為了進一步探討蛹蟲草對機體免疫應答的調節機制，本研究利用環磷酰胺建立了小鼠免疫抑制模型[15]。結果顯示，環磷酰胺導致小鼠肝臟、脾臟以及胸腺均受到明顯的損傷，血清IgG和IgM水平及T淋巴細胞含量顯著降低（P＜0.05），小鼠處于典型的免疫抑制狀態。灌胃期間MDY組CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群數量始終高于MD組，灌胃第14天開始，蛹蟲草已有效抑制了環磷酰胺導致的IL-2水平持續降低；灌胃結束，MDY組IL-2含量已恢復至CK組水平（P＞0.05）。CD3+CD4+T淋巴細胞又稱輔助性T細胞，其分泌的IL-2不僅可以正反饋刺激T淋巴細胞的持續增殖，同時能夠促進B細胞向漿細胞分化和抗體分泌[16]。李丹等[17]發現蛹蟲草可提高正常小鼠脾臟CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞含量，顯著促進免疫調節因子IL-2的表達。蛹蟲草發酵液不僅能夠有效提高環磷酰胺抑制小鼠的脾細胞增殖活性，同時能夠恢復環磷酰胺誘導的IL-2、干擾素（interferon，INF）-γ、TNF-α和IL-10水平的下降，發揮免疫激活的作用[18]。蛹蟲草胞外多糖可明顯增強T淋巴細胞的增殖，提高血清IL-6，IL-2，IFN-γ及TNF-α的水平，其免疫調節效果顯著[9]。此外，本實驗證實了蛹蟲草對免疫抑制小鼠Ig的分泌具有明顯的促進作用。MDY組小鼠IgG和IgM水平早于MD組接近CK組狀態；在灌胃21 d，兩種Ig水平出現大幅上升，IgG質量濃度上升至（118.39±15.31）ng/mL，IgM上升至（2.67±0.40）ng/mL，遠高于CK組水平（P＜0.05）。Ig是體液免疫的主要功能執行分子，血清IgG和IgM水平的降低是判斷體液免疫功能缺陷的常用標準[19]，Yu Yue等[8]研究發現，蛹蟲草胞外多糖AESP-II可以促進免疫抑制小鼠T、B細胞的增殖，促進B淋巴細胞IgA、IgG和IgM的分泌，日糧中添加蛹蟲草菌絲體可促進大鼠血清IgG、IgM水平的提升[20]，與本實驗的研究結果一致。因此，結合蛹蟲草對正常小鼠免疫狀態的影響分析可知，蛹蟲草可以促進IL-2、B淋巴細胞IgG和IgM的分泌。蛹蟲草對機體的體液免疫和細胞免疫均具有激活作用，參與機體免疫抑制狀態的修復。

代謝和免疫是腸道菌群的兩大核心功能，腸胃存在人體約70%的免疫細胞和最大密度的微生物菌群，參與機體的免疫防御、物質代謝等重要生理過程，被廣泛用于預測腸道健康與免疫狀態[21-23]。服用蛹蟲草后小鼠腸道菌群多樣性及豐富度都顯著升高，并呈劑量依賴性，同時菌群組成結構發生明顯改變，如Firmicutes/Bacteroidetes顯著降低。通過對各組相對豐度最高的前5 個菌屬進行篩選比較，發現蛹蟲草增加了腸道Lactobacillus和Alistipes相對豐度，降低了Clostridium XIVa、Lachnospiracea_incertea_sedis和Helicobacter相對豐度。Lactobacillus是臨床常用益生菌制劑的來源菌屬，可以幫助人體消化吸收營養物質，通過抑制有害菌的繁殖維護腸道健康，進而提高機體免疫力[24]，Alistipes主要存在于健康人體的腸道中，在結腸炎、自閉癥譜系障礙、各種肝臟和心血管纖維化疾病中具有促進健康的作用[25]。而ClostridiumXIVa、Lachnospiracea_incertea_sedis和Helicobacter均與腸道炎癥的發生具有一定正相關性[26-27]，ClostridiumXIVa能夠促進Th17的增殖及IL-17、IL-22等免疫因子的分泌，直接誘導腸道炎癥的發生[28]，本實驗進一步分析了對組間腸道菌群差異具有顯著影響的標志性菌屬，高劑量蛹蟲草引起小鼠腸道富集了Bifidobacterium、Ruminococcus和Turicibacter3 個新的菌屬，同時抑制了具有潛在致病性Clostridium_sensu_stricto菌群的出現。蔡玟等[29]研究顯示，Bifidobacterium補充劑的使用可以增強小鼠的細胞免疫、體液免疫功能及NK細胞活性。在結腸炎誘導模型中，野生型小鼠模型腸道中Turicibacter的比例明顯高于Tnf-/-小鼠，這表明Turicibacter與TNF參與的抗炎過程有關[30]。蛹蟲草可以通過優化腸道菌群參與腸道的免疫防御。

TLRs在炎癥反應及免疫細胞調控方面發揮著關鍵作用，TLR2和TLR4可以特異性識別大部分已知的病原體相關分子模式，對于維持腸道黏膜完整性、調控腸道功能及菌群組成等具有積極的作用[31]。實驗結果顯示，蛹蟲草對空腸組織的TLR2和TLR4具有不同的激活模式，低劑量蛹蟲草激活了TLR2/MyD88信號通路，高劑量則呈現抑制作用。對TLR4的表達則具有穩定的抑制作用。但整體而言，小鼠空腸NF-κB的表達量受到了明顯的抑制。研究顯示，TLR4是介導蛹蟲草免疫調節蛋白CMIMP誘導巨噬細胞分化的真正受體，而非TLR2[12]。蛹蟲草多糖CMPB90-1則通過與TLR2結合，導致與M2腫瘤相關巨噬細胞向M1表型極化[10]。由于蛹蟲草生物活性成分的多樣性，TLR2和TLR4產生了不同的應答效果。脂多糖誘導的RAW264.7細胞炎癥反應模型經蟲草酸和蟲草素處理24 h，TLR4、NF-κB的表達量均受到顯著抑制（P＜0.05）[32]。Zheng Hongmei等[33]研究結果顯示，蛹蟲草可下調豬結腸TLR4/MyD88/NF-κB信號通路關鍵蛋白的表達，顯著下調炎癥因子TNF-α、IL-12水平（P＜0.05），改善豬十二指腸免疫屏障功能。NF-κB是TLRs信號通路的效應分子，廣泛參與炎性介質和前炎性介質的調控，拮抗NF-κB的活化或活性可起到有效抗炎的效果[34-35]。綜上，蛹蟲草可以通過影響機體腸道菌群改善腸道免疫功能，對于機體避免腸道炎癥發生具有積極的意義。