PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間細(xì)胞凋亡的影響

張 倩，羅瑞明，陳雪妍，李 榮，王金霞，胡麗筠

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)途徑，參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、存活和凋亡等。該通路的異?；罨c多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]，如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等。AKT是PI3K信號(hào)通路最重要的下游效應(yīng)器之一，是參與調(diào)控細(xì)胞增殖、存活、凋亡的重要蛋白。AKT的激活可以抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖。而另一方面，PI3K/AKT信號(hào)通路的異常活化則會(huì)抑制凋亡信號(hào)的傳遞，從而抑制細(xì)胞凋亡，造成腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞的凋亡、存活、增殖以及細(xì)胞骨架的改變等活動(dòng)中，其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)理主要有3 個(gè)：1）AKT對(duì)重組人β-防御素-2類的促凋亡蛋白進(jìn)行直接抑制，或者對(duì)某些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)出的促凋亡信息進(jìn)行一系列調(diào)控，此外，AKT處于激活的情況下，還可以對(duì)與凋亡有關(guān)的因子，例如半胱天冬蛋白酶的S196位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而使之失去活性，從而對(duì)凋亡起到抑制作用[3]；2）對(duì)其他與Forkhead有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Forkhead等轉(zhuǎn)錄因子被磷酸化后，可對(duì)凋亡相關(guān)因子配體等促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄功能起到抑制作用，降低促凋亡的信號(hào)，從而增強(qiáng)細(xì)胞生存能力；3）AKT的上游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）靶基因mTOR可激活A(yù)KT，并通過調(diào)控特定mRNA翻譯和蛋白合成，在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

因此，PI3K/AKT調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，在細(xì)胞程序性死亡過程中至關(guān)重要。對(duì)PI3K/AKT在細(xì)胞代謝中作用的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT還可以通過代謝途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[4]。周永君等[5]研究表明肉豆蔻木脂素在50、100 μmol/L和200 μmol/L條件下以劑量依賴關(guān)系抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平，上調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）-關(guān)聯(lián)X蛋白（Bcl-2-associated X，BAX）、胱天蛋白酶（cysteine aspastic acid-specific protease，Caspase）-3和Caspase-9表達(dá)水平（P＜0.05）。Chen Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）通過激活PI1K/AKT信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)缺氧誘導(dǎo)因子-3α積累，從而加速死后牛肌肉的糖酵解。Wang Tongting等[7]探討槲皮素對(duì)雞胸肌嫩度的影響及相關(guān)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)槲皮素可促進(jìn)LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化，上調(diào)ATG7、Beclin-1等蛋白，且PI3K/AKT/mTOR通路介導(dǎo)了該過程。PI3K抑制劑（LY294002）是一種PI3K信號(hào)途徑的非特異性小分子化合物，可以抑制PI3Kα/δ/β。2017年，徐余超等[8]采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot，WB）等方法研究LY294002對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖、周期及凋亡的作用，發(fā)現(xiàn)LY294002對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MGC-803的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的多個(gè)重要分子均有不同程度的抑制，并伴隨PI3K、AKT、4EBP、P70S6K等mRNA及磷酸化蛋白的表達(dá)量顯著降低，且LY294002可抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長，改變細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，目前已有多項(xiàng)研究揭示了該通路在各種癌癥中的作用，如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，其研究重點(diǎn)主要集中在信號(hào)通路的調(diào)控、靶向治療的開發(fā)及臨床應(yīng)用等方面。雖然大量文獻(xiàn)報(bào)道指出PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡途徑中具有重要的調(diào)控作用，但目前仍不明確PI3K/AKT信號(hào)途徑如何調(diào)控冷卻灘羊肉貯藏期間肌細(xì)胞凋亡途徑，及其對(duì)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生何種作用。因此，本研究以4 ℃條件下不同貯藏期灘羊后腿肉為研究對(duì)象，采用10 μmol/L PI3K抑制劑LY294002溶液對(duì)灘羊肉進(jìn)行注射處理，分別貯藏0、2、4、6、8 d，通過WB分析PI3K、AKT蛋白的表達(dá)情況，以此驗(yàn)證PI3K/AKT信號(hào)通路抑制的有效性，同時(shí)測定灘羊肉貯藏期間能量因子、氧化應(yīng)激水平、線粒體損傷程度以及Caspase-3活性的變化，以探索PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間細(xì)胞凋亡途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊右后腿肉由寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司提供。選擇9 只6 個(gè)月齡去勢的公灘羊，在宰殺前進(jìn)行集中飼養(yǎng)。按照GB 12694—2016《畜禽屠宰加工衛(wèi)生規(guī)范》的要求進(jìn)行宰殺后，在-20 ℃的冰箱中進(jìn)行1 h冷凍，將肉塊的中心溫度降低到0 ℃，然后用密封袋進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)入0～4 ℃冰箱中保存。

PI3K抗體、AKT抗體、過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、NaOH、K2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、蒽酮試劑美國Sigma公司；HY-10108 LY294002、Tris-HCl緩沖液、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium，EDTA-2Na）、二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、甘露醇 美國MedChemExpress公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜美國Bio-Rad公司；蛋白預(yù)染Marker 杭州弗德生物科技有限公司；線粒體提取試劑盒、ATP含量檢測試劑盒、糖原含量檢測試劑盒、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)測定試劑盒北京索萊寶科技有限公司；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）南京建城生物工程研究所；線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒 上海一研生物科技有限公司；液氮 寧夏寧鋼盈德氣體有限公司；蔗糖、硫酸、H2O2、甘油 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY-SPGT垂直電泳儀 耶拿分析儀器（上海）有限公司；GPC 1000凝膠圖像分析儀 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；UV-3600i Plus紫外-可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；BCD-536WKN食品專用冰箱合肥美的電冰箱有限公司；F-4700熒光分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司；Spectramax M2酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；ST16 ST16R冷凍高速離心機(jī) 上海土森視覺科技有限公司；HWS恒溫水浴鍋杭州瑞誠儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選用寧夏鹽池縣大夏牧區(qū)的灘羊作為實(shí)驗(yàn)材料，采集在0～4 ℃條件下貯藏的冷卻灘羊后腿肉（從腰椎與薦椎連接處斬下的后腿部位肌肉），剔除可見的脂肪及結(jié)締組織，快速采集約150 g肉樣，作為0 d樣品。其余樣品切割成約150 g大小一致的塊狀，并將其隨機(jī)分成兩組，一組為對(duì)照組，另一組為LY294002組，每組各15 個(gè)樣本。對(duì)照組不做任何處理，LY294002組以料液比10∶1（g/mL）注射10 μmol/L LY294002溶液。置于0～4 ℃、相對(duì)濕度85%條件下成熟，分別采集貯藏0、2、4、6、8 d后樣品測定相應(yīng)指標(biāo)。對(duì)于不便立即測定的指標(biāo)，在采樣點(diǎn)取樣品后，立即放入液氮中冷藏，并轉(zhuǎn)入-80 ℃冷藏待用。每組樣本分別進(jìn)行至少3 個(gè)以上生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）及WB

SDS-PAGE（10%分離凝膠和5%濃縮凝膠）分離蛋白質(zhì)后，將目標(biāo)蛋白質(zhì)（50 μg）轉(zhuǎn)移到PVDF薄膜上；在TBST溶液（20.0%吐溫-1、20 mmol/L NaCl、150 mmol/L Tris、10 mmol/L KCl，pH 5.7）中用4%無脂牛奶封閉PVDF薄膜，之后在4 ℃條件下使用各種不同的一抗（PI3K抗體（1∶500）、AKT抗體（1∶500））孵育過夜。在用TBST溶液清洗3 次（每次10 min）后，使用抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶4 000）在室溫條件下反應(yīng)1.5 h。經(jīng)TBST洗滌緩沖液漂洗3 次后二氨基聯(lián)苯胺顯色，蛋白質(zhì)的表達(dá)水平通過Quantity-One 4.6.2程序進(jìn)行定量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)標(biāo)。

1.3.3 線粒體提取

參照Chen Jiao等[9]的方法。取2 g肉樣剪碎，置于20 mL線粒體分離液（0.2 mol/L甘露醇；0.075 mol/L蔗糖；2.0 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；0.2 mmol/L EDTA），轉(zhuǎn)移到均質(zhì)機(jī)中以8 000×g研磨4 min，隨后，將勻漿液在4 ℃、9 000×g條件下離心15 min，所得沉淀物即為線粒體，其蛋白質(zhì)濃度用BCA法測定。

1.3.4 ATP含量測定

取待測肉樣0.1 g，實(shí)驗(yàn)操作按照ATP含量檢測試劑盒的要求，使用紫外分光光度計(jì)于340 nm波長處進(jìn)行測定。

1.3.5 糖原含量測定

利用蒽酮法并略加改進(jìn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。將0.1 g肉樣與1.5 mL 2 mol/L NaOH溶液混合，保持沸騰20 min。隨后，將冷卻的混合物與8 mL超純水混合，并以5 000×g離心10 min。按照糖原含量檢測試劑盒的要求進(jìn)行后續(xù)操作，使用酶標(biāo)儀于620 nm波長處測定吸光度。

1.3.6 線粒體標(biāo)志酶活性測定

用于檢測SDH、CS活性的提取物使用Wang Yingying等[11]提出的方法制備。將1 g冷凍樣品加入9 mL 10 mmol/L冷均質(zhì)溶液（80 mmol/L K2HPO4、15 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L KCl、1.2 mol/L NaCl，pH 7.4），然后在冰浴中以12 000 r/min勻漿30 s。隨后，4 ℃、13 000×g離心15 min。之后，收集上層細(xì)胞使用ELISA試劑盒檢測SDH和CS的活性。

1.3.7 線粒體ROS水平測定

參照Yans等[12]的方法并稍作修改，使用熒光測定法分析ROS含量。將3 g冷凍樣品加入到15 mL 50 mmol/L預(yù)冷磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.4）中，12 000×g勻漿，間隔20 s，并在4 ℃、5 000×g條件下離心20 min。隨后，將上清液與等體積緩沖溶液（10 μmol/L DCFHDA、10 mmol/L Tris-HCl、15 mmol/L蔗糖、0.15 mmol/L EDTA-2Na、0.9 g/100 mL NaCl，pH 7.4）混合，并于37 ℃培養(yǎng)20 min。使用熒光分光光度計(jì)在450 nm波長處測量孵育前后的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 MPTP開放程度測定

取待測樣品0.1 g，實(shí)驗(yàn)操作按照MPTP檢測試劑盒的要求進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)于540 nm波長處測定。

1.3.9 線粒體膜電位測定

按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）說明書操作。使用熒光分光光度計(jì)于540 nm波長處測定。

1.3.10 Caspase-3活性測定

取0.1 g組織肉樣，按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀在405 nm波長處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 冷卻灘羊肉貯藏期間PI3K和AKT蛋白的表達(dá)量變化

PI3K蛋白家族參與細(xì)胞存活、生長、代謝和血糖穩(wěn)態(tài)等多種細(xì)胞功能的調(diào)控，PI3K和AKT蛋白的降解程度可以反映出PI3K/AKT通路受到抑制的程度[13]。WB結(jié)果顯示，對(duì)照組和LY294002組PI3K蛋白在貯藏過程中逐漸降解，8 d時(shí)幾乎完全降解（圖1A）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的條帶始終深于LY294002組，表明LY294002促進(jìn)了PI3K蛋白的降解，驗(yàn)證了PI3K/AKT通路受到抑制的有效性。

圖1 PI3K抑制劑對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間PI3K（A）和AKT（B）蛋白表達(dá)情況的影響Fig.1 Effect of PI3K inhibitor on the protein expression of PI3K (A) and AKT (B) in chilled Tan sheep meat during storage

LY294002可通過抑制PI3K活性抑制PI3K/AKT通路下游的AKT表達(dá)及活化，從而阻止所有由AKT調(diào)控的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑[14]。WB結(jié)果顯示，對(duì)照組和LY294002組AKT蛋白的表達(dá)隨貯藏時(shí)間的延長逐漸減弱，而內(nèi)參蛋白GAPDH并未變化（圖1B）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的條帶始終深于LY294002組，表明LY294002抑制了AKT蛋白的表達(dá)，再次驗(yàn)證了PI3K/AKT信號(hào)通路受到阻礙。如圖2所示，灘羊?qū)φ战M和LY294002組PI3K和AKT蛋白表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的延長逐漸減少，且LY294002組蛋白相對(duì)表達(dá)量整體低于對(duì)照組，表明LY2940002抑制劑促進(jìn)了PI3K和AKT蛋白在貯藏期間的分解，有效驗(yàn)證了PI3K/AKT信號(hào)通路被LY294002抑制。

圖2 PI3K抑制劑對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間PI3K和AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of PI3K inhibitor on the relative protein expression of PI3K and AKT in chilled Tan sheep meat during storage

2.2 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間能量因子的影響

ATP的生成在骨骼肌收縮、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及維持細(xì)胞正常功能等生命活動(dòng)中都發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，將ATP保持在一定的水平對(duì)細(xì)胞而言非常重要[15]。由圖3可知，貯藏0～2 d時(shí)，LY294002組的ATP含量以更快的速率下降，隨后緩慢下降，但ATP仍會(huì)被消耗；8 d時(shí)灘羊肉對(duì)照組和LY294002處理組ATP含量分別降至140.15、110.26 μmol/mg，是由于ATP合成減少和ATP消耗增加所致。結(jié)果表明，LY294002可有效促進(jìn)ATP的降低，其作用于PI3K/AKT信號(hào)通路后，加速ATP的減少而影響細(xì)胞凋亡，主要是由于ATP與細(xì)胞膜上的ATP受體相結(jié)合，抑制PI3K，進(jìn)而抑制AKT，促進(jìn)BAX的表達(dá)和Bcl-2基因相關(guān)啟動(dòng)子磷酸化，從而加速凋亡信號(hào)的傳遞，抑制細(xì)胞生長和增殖，揭示了PI3K/AKT信號(hào)途徑可通過促進(jìn)ATP的減少而影響細(xì)胞凋亡。

圖3 冷卻灘羊肉貯藏期間ATP含量變化Fig.3 Changes of ATP content in chilled Tan sheep meat during storage

冷卻灘羊肉貯藏期間，LY294002處理組和對(duì)照組糖原含量變化如圖4所示。對(duì)照組和LY294002處理組糖原含量隨貯藏時(shí)間的延長整體呈下降趨勢。貯藏初期2 d時(shí)，對(duì)照組糖原含量顯著高于LY294002處理組（P＜0.05），表明注射抑制劑LY294002后加速了糖原分解，由于抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑可以降低細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖利用率，從而降低糖原合成的速率，因此導(dǎo)致糖原含量的下降。研究表明，抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑后降低糖原含量有助于促進(jìn)細(xì)胞凋亡。具體而言，降低糖原含量可以增加細(xì)胞內(nèi)單磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP）∶ATP比值，進(jìn)而激活下游的AMP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)途徑，抑制mTOR信號(hào)途徑，提高細(xì)胞凋亡的水平。

圖4 冷卻灘羊肉貯藏期間糖原含量變化Fig.4 Changes of glycogen content in chilled Tan sheep meat during storage

2.3 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體標(biāo)志酶活性的影響

SDH是衡量線粒體功能的標(biāo)志酶。如圖5所示，貯藏初始狀態(tài)下（0 d）灘羊肉線粒體中SDH活力為140.27 U/L，且LY294002組在貯藏過程中（4～8 d）顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。SDH活性隨著貯藏時(shí)間的延長呈逐漸降低的趨勢。貯藏6 d時(shí)對(duì)照組和LY294002組線粒體SDH的活性分別為96.21 U/L和81.03 U/L，相比于初始狀態(tài)分別降低了31.41%和42.23%（P＜0.05），SDH活力的下降說明隨著貯藏時(shí)間的延長，線粒體的生理功能逐漸下降[16]。主要是因?yàn)橐种芇I3K/AKT信號(hào)途徑會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化過程，從而影響線粒體內(nèi)的SDH活性，導(dǎo)致LY294002處理組SDH活性低于對(duì)照組，同時(shí)會(huì)使細(xì)胞代謝受到影響，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CS是三羧酸循環(huán)中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)酶[17]。由圖6可知，對(duì)照組和LY294002組的CS活性在貯藏0～2、4～8 d均顯著下降，2～4 d顯著上升（P＜0.05），其原因是在貯藏過程中，可能發(fā)生基因的表達(dá)，導(dǎo)致CS活性上升。貯藏0～4 d，對(duì)照組CS活性顯著高于LY294002組（P＜0.05），表明PI3K/AKT通路被阻斷后會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化過程，并降低CS活性，進(jìn)而影響線粒體細(xì)胞凋亡。

圖5 冷卻灘羊肉貯藏期間SDH活性的變化Fig.5 Changes of SDH activity in chilled Tan sheep meat during storage

圖6 冷卻灘羊肉貯藏期間CS活性的變化Fig.6 Changes of CS activity in chilled Tan sheep meat during storage

2.4 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體氧化應(yīng)激水平的影響

如圖7所示，貯藏期間，LY294002組線粒體ROS水平整體呈上升趨勢，貯藏6 d時(shí)，LY294002組ROS水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），主要因?yàn)镻I3K/AKT信號(hào)途徑參與線粒體逆轉(zhuǎn)運(yùn)輸，防止線粒體內(nèi)過多的ROS產(chǎn)生，但是當(dāng)該信號(hào)途徑受到抑制時(shí)，線粒體功能可能會(huì)受到破壞，導(dǎo)致ROS的升高。研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制會(huì)加重線粒體的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖7 冷卻灘羊肉貯藏期間ROS水平的變化Fig.7 Changes of ROS levels in chilled Tan sheep meat during storage

2.5 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體損傷程度的影響

由圖8 可知，冷卻貯藏0～8 d 期間，對(duì)照組和LY294002組光密度值均呈降低趨勢，而光密度值與MPTP開放程度成反比，說明MPTP開放程度顯著增大（P＜0.05），原因可能是抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑會(huì)引發(fā)線粒體內(nèi)外膜電位的破壞、ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等一系列反應(yīng)，多種因素誘導(dǎo)MPTP呈不可逆的開放狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體內(nèi)氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生下降，從而產(chǎn)生ROS、Ca2+等物質(zhì)，導(dǎo)致線粒體外膜通透性改變，并釋放一系列細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，例如細(xì)胞色素c等，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。整個(gè)貯藏過程中，與對(duì)照組相比，LY294002組MPTP開放程度變化顯著（P＜0.05），表明PI3K/AKT通路抑制后可能直接作用于構(gòu)成MPTP的分子蛋白，使絲/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，影響MPTP的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)其開放。

圖8 冷卻灘羊肉貯藏期間MPTP開放程度變化Fig.8 Changes of MPTP opening degree in chilled Tan sheep meat during storage

線粒體膜電位的降低是由MPTP精細(xì)調(diào)控引起[18]。由圖9可知，對(duì)照組和LY294002組線粒體膜電位隨貯藏時(shí)間的延長均呈下降趨勢，LY294002組0～2 d和4～6 d線粒體膜電位下降率分別為29.17%和69.23%，對(duì)照組0～2 d和6～8 d呈顯著下降趨勢（P＜0.05）；貯藏期間，對(duì)照組線粒體膜電位整體高于LY294002組。以上結(jié)果表明，抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑后對(duì)線粒體膜電位的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響，使線粒體膜電位下降，進(jìn)而導(dǎo)致Ca2+的過多積累，激活凋亡途徑中的酶、蛋白酶等，損傷線粒體膜以及DNA等重要細(xì)胞器件，從而引起細(xì)胞凋亡。此外，線粒體膜電位下降也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素c等細(xì)胞中與凋亡相關(guān)蛋白的釋放，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡途徑。

圖9 冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體膜電位的變化Fig.9 Changes of mitochondrial membrane potential in chilled Tan sheep meat during storage

2.6 PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)冷卻灘羊肉貯藏期間Caspase-3活性的影響

由圖10所示，對(duì)照組和LY294002組Caspase-3活性均在貯藏2 d時(shí)達(dá)到峰值，之后呈明顯降低的趨勢；與對(duì)照組相比，LY294002組貯藏0～6 d時(shí)的Caspase-3活力較高，主要由于PI3K/AKT信號(hào)途徑可以調(diào)節(jié)Caspase-3的表達(dá)和活性，Caspase-3能夠靶向并降解多種細(xì)胞蛋白質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能性變化，以及間接激活其他的Caspase，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。說明LY294002抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑后會(huì)導(dǎo)致Caspase-3活性增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖10 冷卻灘羊肉貯藏期間Caspase-3活性的變化Fig.10 Changes of caspase-3 activity in chilled Tan sheep meat during storage

3 討論

氧化應(yīng)激和能量代謝均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。已有研究表明，氧化應(yīng)激可通過調(diào)控腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致腎小球細(xì)胞損傷[19]。張志梅[20]研究發(fā)現(xiàn)，降糖藥二甲雙胍可顯著抑制人紅系白血病K562細(xì)胞的糖酵解，并可通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致諸如活性羰基化合物等能量物質(zhì)代謝紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞的破壞和死亡[21]。本研究中得到的結(jié)果與上述研究一致，LY294002組線粒體ROS的總體水平與對(duì)照組相比有較大差異（P＜0.05），這表明PI3K/AKT途徑可能通過加重線粒體的氧化損傷，并與ROS交互，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。肝臟是生物體最重要的物質(zhì)及能量代謝中心，線粒體是細(xì)胞“能量供給源”，可通過多種途徑調(diào)控各種重要的生命活動(dòng)，其中PI3K/AKT途徑就是其中之一。Wang Qifei等[22]研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在缺氧條件下可通過參與缺氧誘導(dǎo)因子-1α的合成和糖酵解發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究顯示，AKT能夠刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體1，進(jìn)而提高葡萄糖代謝效率[23]。本實(shí)驗(yàn)中，PI3K/AKT信號(hào)通路通過加速ATP和糖原含量的下降，對(duì)細(xì)胞凋亡造成影響。抑制劑LY294002可使肌肉組織的pH值、ATP含量急劇降低，并與肌肉組織中其他能量代謝發(fā)生作用，從而導(dǎo)致肌肉組織的凋亡。此外，AKT還能夠激發(fā)己糖激酶和磷酸果糖激酶，這兩種物質(zhì)對(duì)糖分解都有限速作用，從而提高代謝水平[24]。

SDH是線粒體呼吸鏈復(fù)合物II中的底物酶，它與其他呼吸鏈底物酶一起參與線粒體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移和ATP合成[25]。當(dāng)SDH活性下降時(shí)，線粒體內(nèi)的ATP合成可能會(huì)受到影響，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的代謝和生存。降低ATP水平可能會(huì)激活A(yù)MPK信號(hào)途徑，從而抑制mTOR信號(hào)途徑，提高細(xì)胞凋亡的水平。本研究發(fā)現(xiàn)，貯藏期間對(duì)照組CS活性顯著高于LY294002組（P＜0.05），表明PI3K/AKT信號(hào)途徑會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位的降低，從而影響氧化磷酸化過程的進(jìn)行，并降低SDH的活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。CS參與三羧酸循環(huán)代謝途徑，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K/AKT通路被阻斷后，使CS活性下降，三羧酸循環(huán)途徑和細(xì)胞代謝途徑的進(jìn)行會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞生存受損，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究也表明，PI3K/AKT信號(hào)途徑在線粒體膜電位和MPTP的調(diào)節(jié)中具有重要的作用，抑制該途徑會(huì)導(dǎo)致膜電位的下降和MPTP開放程度的增加，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡途徑。這與Wang Linlin等[26]研究發(fā)現(xiàn)MPTP開放受到ROS和Ca2+的影響，在死后肌肉壓痛過程中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重要作用的結(jié)果相一致。

PI3K/AKT是一個(gè)抗細(xì)胞凋亡的重要途徑，而Bcl-2基因家族是其下游抗細(xì)胞凋亡分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[27]。Caspase-3在線粒體途徑中起著關(guān)鍵作用，其活化是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[28]。已知PI3K/AKT信號(hào)通路可調(diào)控多種組織器官的凋亡，而PI3K/AKT信號(hào)通路的活化可抑制凋亡。PI3K可抑制Caspase-3激活，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用[29-30]。當(dāng)PI3K/AKT信號(hào)通路的基因表達(dá)降低時(shí)，能夠在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中上調(diào)BAX、Caspase-3和Caspase-9基因的表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡[31]。硫化氫可調(diào)控BCL-2的表達(dá)，引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體凋亡[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)途徑可以促進(jìn)Caspase-3靶向各種細(xì)胞蛋白進(jìn)行降解，引發(fā)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能性變化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。Karahashi等[33]也發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以提高BAX的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑后也會(huì)影響其他與細(xì)胞凋亡相關(guān)的協(xié)同分子表達(dá)，例如p53和BCL-2家族等。此外，在STC-1小鼠中LPS治療可使BCL-2/BAX下降，Caspase 3的表達(dá)升高引起腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的凋亡[34]。

4 結(jié)論

WB結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長，PI3K和AKT蛋白表達(dá)量均減少，驗(yàn)證了PI3K/AKT信號(hào)通路被抑制的有效性。貯藏期間，與對(duì)照組相比，LY294002處理使線粒體ATP、糖原含量、SDH和CS活性顯著下降（P＜0.05）；線粒體ROS水平不斷增加，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和MPTP開放程度增加，膜電位顯著下降；凋亡因子Caspase-3活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明PI3K/AKT信號(hào)途徑通過促進(jìn)ROS產(chǎn)生并與PI3K相互作用，介導(dǎo)了下游Caspase-3的活化，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的發(fā)生。