水楊酸處理對采后西蘭花褪綠轉黃及營養品質的影響

楊慶喜，羅曼莉，周 倩，紀淑娟

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

西蘭花（BrassicaoleraceaL.var.Italica）食用部分主要為脆嫩的花莖、短縮肥嫩的花薹及緊密群集成球狀的綠色花蕾。西蘭花營養豐富，除了含有蛋白質、碳水化合物、VA、VC、VB1和VB2以及磷、鐵、鈣等無機質外，還富含硫代葡萄糖苷和蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）等生物活性物質，深受消費者青睞。然而，采后西蘭花生理代謝旺盛，貯運過程和貨架期間花蕾極易褪綠轉黃[1-2]。Luo Feng等[2]研究發現，隨貨架溫度的升高，西蘭花褪綠轉黃時間急劇縮短，室溫條件下第3天便出現轉黃現象。而且伴隨褪綠轉黃過程，西蘭花中硫代葡萄糖苷等特征營養物質大量損失[2]。西蘭花中主要有7 種硫代葡萄糖苷，其中，蘿卜硫苷（glucoraphanin，GRA）、蕓薹葡糖硫苷（glucobrassicin，GBS）和新蕓薹葡糖硫苷（neoglucobrassicin，NGBS）含量最豐富，超過硫代葡萄糖苷總含量的90%[2-3]。先前的研究發現，黃化的西蘭花樣品中3 種硫代葡萄糖苷的含量急劇下降，下降率分別為85%、89%和23%[2]。類似的結果在Miao Huiying[4]和Kang Moku[5]等的研究中也被發現。此外，黃化西蘭花中如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、硫代葡萄糖苷的水解產物SFN及吲哚-3-甲醇（indole-3-methanol，I3C）等生物活性物質含量也明顯減少[2,6-7]。褪綠轉黃不僅使西蘭花喪失應有的表觀品質，其營養價值也大幅下降，使西蘭花失去商品價值。因此，探索適宜的調控技術對于延長西蘭花的保鮮期、降低其產后損失具有重要意義。

水楊酸（salicylic acid，SA），又稱鄰羥基苯甲酸，為一種酚類植物激素，在植物生長發育，響應冷、干旱、高鹽等逆境脅迫中發揮重要的調控作用[8]。近年來，其在維持果蔬品質方面的作用已引起人們的關注。SA參與果蔬后熟衰老進程的調控。Yuan Ruimin等[9]發現，SA處理可以抑制蘋果內源乙烯的合成，延緩果實的后熟衰老進程。Li Yaling等[10]指出，外源SA處理能夠抑制杏果實乙烯合成關鍵酶的活性，介導乙烯的合成，抑制果實的軟化。類似的結論在關于芒果[11]和番茄[12]的研究中也有報道。SA處理誘導果蔬抗氧化能力的提高在一些果蔬中已有報道。Zhang Huaiyu等[13]發現經SA處理的枸杞果實H2O2含量明顯降低，抗氧化能力顯著提升，抑制了枸杞果實的腐爛。在對芒果[14]、冬棗[15]、甜櫻桃[16]和鮮切青花菜[17]的研究中也有類似報道。外源SA處理對采后西蘭花的褪綠轉黃進程以及營養品質的調控作用值得探討。

鑒于SA具有保護采后果蔬品質的潛力，本實驗通過觀察西蘭花外觀顏色，測定其色差值、葉綠素（chlorophyll，chl）含量以及chl熒光的變化量，評估SA處理對采后西蘭花褪綠轉黃的調控作用。同時，通過分析硫代葡萄糖苷、SFN、I3C等西蘭花活性營養物質含量以及抗氧化能力的變化，評估SA處理對采后西蘭花營養品質的保護效果，旨在為提高西蘭花采后貯運保鮮效果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花（品種為‘耐寒優秀’）購自遼寧省沈陽市的西蘭花商業種植農場。

石英砂、碳酸鈣、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、鉬酸銨、沒食子酸、甲醇（色譜純和分析純）、乙腈（色譜純和分析純）、黑芥子硫苷標準品、SFN標準品、I3C標準品 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CR-400色差儀（光源D65）日本Molta公司；CP緊密電子天平 美國Ohaus公司；UV762紫外-可見分光光度計上海鼎科科學儀器有限公司；LC-30A高效液相色譜系統（配備UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×0.1 m，1.7 μm））、8050液相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；H1650R冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；CCD-695型數碼相機、FluorCam熒光成像系統北京易科泰生態技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

挑選成熟度一致（平均鮮質量0.35～0.4 kg）、無機械傷、無染病的西蘭花進行實驗。將預冷（4 ℃，18 h）后的西蘭花隨機分為兩組，每組30 個花球，其中一組用SA溶液（含2%乙醇（體積分數，下同））浸泡2 min，作為處理組；另外一組用蒸餾水（含2%乙醇）進行相同的處理，作為對照組（CK），設置3 次重復。參考Luo Manli[18]、El-Beltagi[19]和何俊瑜[20]等的研究設定SA處理濃度為2 mmol/L。自然晾干花球表面水分，然后用聚乙烯袋（50 cm×80 cm，0.04 mm）包裝，每袋6 個花球，挽口存放在溫度為（4.0±0.5）℃、相對濕度為78%～80%的環境中，貯存20 d。貯藏期間，每5 d取樣觀察，同時，按五點取樣法采集花蕾組織，于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存待測。

1.3.2 黃化指數（yellowing index，YI）和色度值的測定

通過對花球表面黃化區域的觀測，參考Fang Huixin等[21]的方法對西蘭花的外觀進行評估。黃化的分級標準為I級：花球表現為深綠色，花蕾緊密不開花；II級：花球表現為淺綠色，無綻放的花蕾；III級：花球表現為黃綠色，花蕾稍微泛黃，且黃化面積小于30%；IV級：花球表現為綠黃色，花蕾黃化面積為30%～50%；V級：花球表現為黃色，花蕾黃化面積大于50%。YI計算參考式（1）：

借助色差儀測定樣本在貯藏期間的色差值。儀器使用前利用黑白板進行校準。在正式測定時，色差儀自動生成L*（反映樣品顏色的亮度）、a*（正值表示紅色，負值表示綠色）和b*（正值表示黃色，負值表示藍色）值。每個采樣點從每組樣品中取6 個花球，在固定的五點處測定樣本的色差值，重復3 次。

1.3.3 chl熒光和chl含量測定

1.3.3.1 chl熒光測定

使用配有MC190高清數字電荷耦合相機的開放熒光相機測量樣品的chl熒光。將樣品放置在控制臺上，使用黑色窗簾創建黑暗反應環境，以防止外界光干擾。暗處理15 min后，樣品被用于測定最大PS II量子產量（maximum quantum yield，Fv/Fm）和熒光下降比（fluorescence decline ratio，Rfd）。

1.3.3.2 chl含量測定

參考Zhang Xue等[22]的方法。

1.3.4 硫代葡萄糖苷含量的測定

前期研究發現，GRA、GBS和NGBS為西蘭花中主要的硫代葡萄糖苷組分，分別占硫代葡萄糖苷總量的64%、21%和7%[2]。因此，通過測定上述物質占比評估西蘭花中硫代葡萄糖苷水平。

1.3.4.1 硫代葡萄糖苷的提取

參考Paulsen等[23]的方法。將0.5 g樣品與4 mL體積分數70%甲醇溶液和內標物黑芥子硫苷（5 mmol/L，0.2 mL）混合，渦旋1min后置于70 ℃水浴鍋中孵育30 min。隨后，依次將樣品進行超聲提取15 min和3 000×g離心15 min，收集上清液，35 ℃旋轉蒸發近干，并用1 mL蒸餾水重新懸浮。樣品溶液過0.22 μm濾膜后上機檢測。

1.3.4.2 硫代葡萄糖苷含量的檢測

色譜分離利用高效液相色譜系統。以體積分數0.2%甲酸溶液為流動相A，色譜級乙腈為流動相B，洗脫程序如下：0～0.5 min，95% A、5% B；0.5～3 min，95%～60% A、5%～40% B；3～3.5 min，60%～5% A、40%～95% B；3.5～4 min，5% A、95% B；4～4.5 min，5%～95% A、95%～5% B；4.5～6 min，95% A、5% B。流速0.2 mL/min；進樣量2 μL。

采用液相色譜-質譜聯用儀，設定電噴霧離子源，負離子掃描多反應監測模式量化目標化合物。電噴霧源溫度和去溶劑化溫度分別為110 ℃和350 ℃，在3 000 V條件下進行電離。GRA、GBS和NGBS具體的質譜參數見表1。根據相對響應因子，采用內標法進行定量[2]，硫代葡萄糖苷含量計算參考式（2）：

表1 硫代葡萄糖苷的質譜參數及相對響應因子Table 1 Mass spectrometric parameters and relative response factors fordetection of glucosinolates

式中：X為目標硫代葡萄糖苷含量/（mmol/kg）；C為目標硫代葡萄糖苷與內標物的峰面積之比；n為內標物的添加量/mmol；m為樣品質量/kg；f為相對響應因子。

1.3.5 SFN和I3C含量的測定

1.3.5.1 SFN和I3C的提取[1]

準確稱取0.5 g樣品，加入5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7）。將混合物渦旋1 min后在37 ℃水浴鍋中水解3 h。然后加入20 mL二氯甲烷，超聲提取1 h。向混合體系中加入2.5 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉充分混勻，3 000×g離心5 min，收集上清液，35 ℃旋轉蒸發近干，并用1 mL乙腈重新懸浮。樣品溶液過0.22 μm濾膜后上機檢測。

1.3.5.2 SFN和I3C的檢測

高效液相色譜體系、色譜柱、流動相、檢測條件和質譜參數與1.3.4節所述相同。洗脫程序如下：0～1 min，95% A、5% B；1～2 min，95%～10% A、5%～90% B；2～2.5 min，10%～5% A、90%～95% B；2.5～3.5 min，5% A、9 5% B；3.5～4 min，5%～95% A、95%～5% B；4～5 min，95% A、5% B。流速0.2 mL/min；進樣量5 μL，主要質譜參數見表2。實驗采用外標法進行定量分析，最終含量單位為mg/kg。

表2 SFN和I3C的質譜參數Table 2 Mass spectrometric parameters for detection of SFN and I3C

1.3.6 總酚（total phenols，TP）含量測定

參考Sun Yangyang等[24]的方法。

1.3.7 總黃酮（total flavonoids，TF）含量測定

參考魏世錦[25]的方法。

1.3.8 AsA含量的測定

參考GB 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測定》[26]的方法，采用2,6-二氯靛酚法測定AsA的含量，單位為g/kg。

1.3.9 T-AOC測定

利用2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基法測定抗氧化能力。具體測定方法參考T-AOC檢測試劑盒說明書進行，T-AOC最終單位為mmol/kg。

1.3.10 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定

參考陳雙穎等[17]的方法進行MDA含量的測定，單位為μmol/kg。

1.4 數據分析

每組實驗重復3 次，利用SPSS26.0軟件和Tutools平臺（https://www.cloudtutu.com）進行統計學分析，實驗結果表示為±s。使用SPSS 26.0軟件對所有數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并使用最小顯著性差異法進行檢驗，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 SA處理對采后西蘭花表觀變化的影響

如圖1所示，4 ℃條件下隨著貯藏期的延長，西蘭花出現了褪綠轉黃現象，CK樣品于第10天出現轉黃癥狀，隨后逐漸加重，而SA處理明顯推遲了西蘭花褪綠轉黃進程，于第20天表現出輕微的黃化癥狀。-a*/b*值持續下降，L*值逐漸升高，表明西蘭花的綠色逐漸褪去。與CK樣品相比，經SA處理的樣品-a*/b*值和L*值的變化幅度明顯減小，進一步驗證了上述結果。YI可以反映樣品的黃化程度，至貯藏末期SA處理樣品的YI僅為CK組的47%。綜上分析可以看出，SA處理有效緩解了采后西蘭花的褪綠轉黃問題。

圖1 SA處理對西蘭花外觀變化的影響Fig.1 Effect of SA treatment on the appearance changes of broccoli

2.2 SA處理對采后西蘭花chl含量和chl熒光的影響

chl含量降低是西蘭花褪綠轉黃的主要原因[2]。由圖2可見，隨著貯藏期的延長，西蘭花中chla和chlb含量均明顯減少，至第20天時，CK樣品的chla和chlb含量分別為鮮樣的27%和19%。而經SA處理的樣品，chl含量下降速率明顯減緩，貯藏末期chla和chlb含量的下降率分別為CK組的55%和50%。chl熒光成像系統可以用來監測西蘭花chl熒光參數的變化，衡量植物的健康狀況。根據西蘭花的Fv/Fm值對chl熒光圖像進行顏色編碼，生理條件良好的西蘭花顏色編碼區域與淺藍色編碼區域對應，而嚴重發黃的西蘭花呈深藍色，圖像顯示CK組與處理組之間存在明顯的差異。植物中Fv/Fm值的降低表明光合作用被抑制，而Rfd值越高，說明植物的健康狀況越好。如圖2所示，Fv/Fm和Rfd值的變化趨勢相似，均隨著黃化過程的發生而逐漸降低，而SA處理明顯減緩了上述參數的變化，至第20天時，其下降幅度僅分別為CK組的41%和74%。這進一步驗證了SA處理對采后西蘭花褪綠轉黃的調控作用。

圖2 SA處理對西蘭光合作用能力及chl含量的影響Fig.2 Effect of SA treatment on the photosynthetic ability and chlorophyll content of broccoli

2.3 SA處理對采后西蘭花中硫代葡萄糖苷、SFN和I3C含量的影響

硫代葡萄糖苷是西蘭花中標志性的生物活性物質，是西蘭花特殊營養價值的體現。其中，GRA、GBS和NGBS為西蘭花中主要的硫代葡萄糖苷組分，占硫代葡萄糖苷總量的90%以上。如圖3所示，CK組中GRA、GBS和NGBS含量以及總硫代葡萄糖苷（total glucosinolate，TGL）含量均隨著貯藏期的延長而呈下降趨勢，尤其是GRA和GBS，至貯藏末期其含量分別減少了58%和64%。SA處理有效抑制了這種下降趨勢，在整個貯藏期，GRA、GBS和NGBS含量以及TGL含量始終顯著高于同期CK樣品。SFN和I3C含量在整個貯藏期間均呈現先升高后降低的趨勢。但值得注意的是，SA處理組中兩種物質含量均顯著高于CK組，尤其是SFN，其損失率不足CK組的1/10。上述結果表明，SA處理明顯抑制了西蘭花中特征營養物質的損失。

圖3 SA處理對西蘭花中硫代葡萄糖苷、SFN及I3C含量的影響Fig.3 Effect of SA treatment on glucosinolates,SFN,and I3C contents of broccoli

2.4 SA處理對采后西蘭花中AsA、TP和TF含量的影響

由圖4可知，兩組樣品在貯藏第5天后，AsA含量均呈下降趨勢，但SA處理組樣品AsA含量的下降速率明顯減緩，至貯藏末期其下降率僅為CK組的62%。與AsA的變化趨勢不同，TF和TP含量均隨貯藏期的延長而呈逐漸上升趨勢，而SA處理樣品上升幅度更大。綜上，SA處理抑制了AsA的損失，促進了TP和TF營養物質的積累。

圖4 SA處理對西蘭花中AsA、TP及TF含量的影響Fig.4 Effect of SA treatment on the contents of AsA,TP,and TF in broccoli

2.5 SA處理對采后西蘭花抗氧化能力的影響

如圖5所示，SA處理有效誘導了西蘭花樣品T-AOC的提高，貯藏前期，樣品T-AOC快速升高，至第10天達到峰值，為同期CK組的1.8 倍，而且整個貯藏期，其水平始終顯著高于CK組。MDA是膜脂過氧化的產物，其含量可以反映膜脂過氧化的程度。CK組中MDA含量隨著貯藏期的延長呈快速升高趨勢，至貯藏末期其含量達到鮮樣的3.8 倍，而SA處理明顯減緩了MDA含量的變化，第20天時，其含量僅為CK組的62%，進一步說明SA處理對西蘭花抗氧化能力的誘導作用。

圖5 SA處理對西蘭花T-AOC及MAD含量的影響Fig.5 Effect of SA treatment on T-AOC and MDA content in broccoli

2.6 多變量統計分析

多變量統計分析可以進一步解析SA處理對西蘭花采后品質的保護作用。熱圖作為可視化手段，能夠直觀地顯示兩個樣本中各種變量的變化。如圖6A所示，每一行表示不同的變量，列表示不同時期的樣本；網格的顏色越紅，樣本中目標變量的豐度越高；網格越藍則相反。處理組樣品中AsA、-a*/b*、GRA、Rfd、chla、chlb、Fv/Fm、TGL和GBS等變量豐度較高。相反，L*、MDA和YI等變量在CK樣本中豐度較高。此外，TP、TF及T-AOC等變量在SA10、SA15和SA20樣本中顯著富集。上述結果表明，SA處理有效提高西蘭花的抗氧化能力，同時延緩了感官品質及特殊營養品質劣變。

圖6 熱圖分析及PCAFig.6 Heatmap analysis and PCA

同時，選擇chla、chlb、GRA、GBS、NGBS、TGL、SFN、I3C、AsA、TP、TF、T-AOC和MDA等變量進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。由圖6B可知，處理組和CK組樣本分列對角線兩側，有明顯分離，表明SA處理介導上述變量的顯著變化。進一步通過圖6C識別導致兩組樣本存在差異的關鍵變量，探究SA處理對上述變量的保護作用。變量由從圓心出發的箭頭表示，其投影越長，顏色越紅，說明該變量對PC的貢獻率更大，同時也表明該變量是導致兩組樣本分離的差異變量。PC1對模型的解釋率為69.6%，對該PC解釋率較高的變量是GRA、TGL和AsA，隨后依次為MDA、chlb、chla、SFN等；PC2對模型的解釋率較低，為20.6%，對此PC解釋率最高的變量為T-AOC，隨后依次是TP和TF等。由此可見，SA處理對GRA、TGL和AsA的保護作用更強，且可有效誘導抗氧化能力的提高。

3 討論

褪綠轉黃誘發的西蘭花品質劣變嚴重影響了其商品價值，造成產后損失。4 ℃條件下，花球于第10天表現出黃化癥狀，并隨貯藏期的延長而加劇。伴隨黃化的發生，西蘭花中chl含量也急劇減少。黃化是采后西蘭花快速后熟衰老的視覺表征[27]，其也可從Fv/Fm和Rfd值的降低中得到證明。外源SA處理明顯推遲了衰老進程，黃化癥狀延晚10 d出現，同時緩解了chl的損失及Fv/Fm和Rfd值的降低，有效保護了產品品質。SA對于采后果蔬品質的保護作用在蘋果、杏、番茄等果實中也有所體現[9-10,12]，因此，SA有被開發成為果蔬保鮮劑的潛力。

西蘭花的褪綠轉黃與其成熟及衰老過程密切相關，乙烯在此過程中發揮著重要作用。課題組前期研究證實，外源乙烯處理加快西蘭花的黃化進程，而乙烯吸收劑或1-甲基環丙烯處理能夠明顯推遲黃化癥狀的出現[28]。SA作為一種酚類植物激素，在植物生長發育的調控作用已見報道[29]，Yuan Ruimin[9]和Li Yaling[10]等研究發現，外源SA處理通過調控采后蘋果和杏果實內源乙烯的合成，延緩采后成熟及衰老過程，維持果實的品質。同樣，外源SA處理對于果實乙烯合成的抑制作用在芒果和番茄中也有報道[11-12]，由此可以推測，SA對采后西蘭花褪綠轉黃的緩解作用可能歸因于其對內源乙烯的調控。抗氧化能力的衰退也是采后西蘭花黃化的重要誘因。伴隨采后果蔬后熟衰老進程的加劇，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和清除間平衡體系被打破，導致ROS過度積累。而ROS的過量積累也會促進果蔬衰老，同時表現出chl的快速流失。先前的研究和本實驗均發現，貯藏期間西蘭花黃化進程與MDA水平的快速上升呈顯著正相關[30]，這表明采后西蘭花黃化過程中ROS過量積累，加重了膜脂過氧化引發的膜損傷。本研究發現，CK組中chla和chlb含量顯著減少，T-AOC急劇降低，而SA處理則提高了西蘭花的T-AOC，維持了較高的chl水平。同時，處理組中MDA含量變化相對穩定。這些結果表明SA處理延緩西蘭花褪綠轉黃可能與其在減輕脂質過氧化方面扮演積極角色有關。此外，Zhang Huaiyu[13]和Sang Yueying[15]等研究發現經SA處理的枸杞和大棗果實其抗氧化能力顯著增加。本研究發現處理組樣本積累了更高水平的AsA、TP及TF等抗氧化物質，證明SA處理對于果蔬抗氧化能力具有誘導作用。因此，上述結果表明，SA處理可延緩采后西蘭花衰老進程，更好的維持西蘭花的品質。

西蘭花褪綠轉黃的同時伴隨營養品質的急劇降低，特別是其特征營養物質GRA、GBS、SFN和I3C，其變化趨勢與黃化進程呈正相關。本研究發現，CK組中GRA和GBS含量大幅下降，損失率均超過50%，這與先前的研究結果[4-5]類似。SFN和I3C均可調控細胞防御系統，提高機體解毒和抗氧化能力[1]，其在黃化過程中損失率約為60%。類似的結果在Pintos等[31]的研究中也被發現。值得注意的是，外源SA處理明顯減緩了上述營養成分的流失速率，在整個貯藏期，上述物質損失率均不足35%，尤其是SFN（損失率小于5%）。同時，SA處理對于西蘭花營養品質的保護作用還體現在CK組中積累了更多的AsA、TP和TF。這些結果表明，SA處理有效阻止了采后西蘭花營養品質的下降。通過PCA發現，SA處理對于GRA的保護作用更強。然而，關于外源SA處理調控采后果蔬營養品質的研究相對較少。目前研究發現，ROS脅迫可能促使植物細胞合成更多的初級硫代謝物，進而限制GRA（次級硫代謝物）的合成，甚至誘導GRA的降解[32-33]。此外，細胞內高氧化水平亦可直接抑制硫代葡萄糖苷的生物合成，表現為ROS信號通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑調控R2R3-MYB（myeloblastosis）家族轉錄因子（MYB28/29/34/51）的轉錄，其中MYB28為調控GRA合成的關鍵因子[34]。因此，SA處理對于GRA的保護作用可能歸因于對抗氧化能力的增強，具體的證據仍需進一步探究。

4 結論

SA處理明顯推遲了西蘭花褪綠轉黃進程，延緩了營養品質劣變。結果表明，用SA處理的樣品保持了更高的chl含量，表現出更高的Fv/Fm和Rfd值及較低的YI。此外，處理組樣本中GRA、GBS、SFN、I3C、AsA、TP和TF豐度更高，表明SA處理保護了采后西蘭花的營養品質。同時，SA處理提高了采后西蘭花的抗氧化能力，抑制了MDA含量的快速上升。因此，對采后西蘭花進行SA處理可能是改善其品質劣變的有效策略。