基于體溫擴增的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種3 種可視化快速檢測方法的建立

林志偉，王 帥，蔡 杰，聶丹丹，李 濤，李紅娜，楊艷歌,*，袁 飛,*

（1.黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163000；2.中國檢驗檢疫科學研究院，國家市場監管重點實驗室（食品質量與安全），北京 100176；3.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163000；4.長春海關技術中心，吉林 長春 130062）

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病菌（Burkholderia gladiolipv.cocovenenans）是唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderiagladioli）中一個能夠分泌米酵菌酸和毒黃素的致病變種[1-3]，又稱椰毒假單胞菌酵米面亞種、椰酵假單胞菌[4-6]。常被唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病菌污染的食物有變質的谷物、濕淀粉、銀耳和木耳等，由該菌引起的食物中毒會導致呼吸循環衰竭、腦血腫和尿毒癥等癥狀[7-10]。近年來，因誤食用被唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種污染食品引發的中毒事件頻繁發生[11]。據統計，2005—2020年，我國共報道唐菖蒲伯克霍爾德氏菌中毒事件30 起，中毒188 例，死亡85 例，病死率為45.21%；其中較大級別事件占事件總數的93.33%，病死率53.13%[12]，是迄今為止我國發現死亡率最高的食源性致病菌。

目前唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的檢測方法有培養法[13]、液相色譜-質譜聯用法[14-17]、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法[18-19]等。其中GB 4789.29—2020《食品微生物學檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗》[13]規定的方法是最經典的鑒定方法，但該方法需要經過初篩、生化鑒定，并且需要聯合GB 5009.189—2016《食品中米酵菌酸的測定》[20]進行毒性實驗測定，操作復雜、耗時較長，需要11～12 d才可作出判定結果。質譜法、數字PCR法和實時熒光PCR法能夠有效縮短檢測時間，但仍存在儀器昂貴、需要豐富操作經驗的人員測定等問題，不適合現場快速檢測和不發達地方檢測。酶促等溫擴增（enzymatic recombinase amplification，ERA）是2019年研發的一種新型等溫擴增技術[21]，可替代PCR技術。ERA與PCR技術一樣具有特異性，但速度更快，通常在7～10 min即可將核酸模板擴增到可以檢出的水平；且ERA不需要熱變性，因此不需要昂貴的熱循環設備。另外，ERA比其他等溫擴增技術所需要的溫度低，在37～42 ℃條件下即可完成痕量DNA/RNA區段的指數級擴增，因此又被稱為體溫擴增技術，能在廣泛的環境溫度下應用[22-24]。

本研究根據唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病型菌株Co14的產毒基因bonM，設計并篩選能夠高效檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的特異性高靈敏ERA引物和探針，依托便攜式實時PCR（real-time PCR）儀，結合顯色劑或試紙條，分別建立顯色法、熒光法和試紙條法3 種ERA現場可視化快速檢測技術，以期為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的快速篩查和風險監測提供良好的技術方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用菌分別來源于中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）、美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國醫學細菌菌種保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）和中國檢驗檢疫微生物菌種保藏管理中心（Inspection and Quarantine Culture Collections，IQCC），信息詳見表1。市售食品樣品采購于2 個北京的超市。

表1 實驗用菌株信息Table 1 Information of the strains used in this study

GVC增菌液、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（modified potato dextrose agar，mPDA）青島高科技工業園海博生物技術有限公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養基 英國Oxoid公司；PrepManTMUltra樣品制備試劑 美國Thermo Fisher Scientific公司；基礎型核酸擴增試劑盒（ERA法）、熒光型核酸擴增試劑盒（ERA法）、試紙型核酸擴增試劑盒（ERA法）、側向流檢測試紙條 蘇州先達基因科技有限公司；1 000×SYBR Green I 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

便攜式real-time PCR儀 艾濟遺傳（北京）科技有限公司；Pico 17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；D1008E掌上離心機 美國Scilogex公司；BioSpec-nano紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；高壓滅菌鍋 以色列Tuttnauer公司；VORTEX 3渦旋混合器 德國IKA公司；DH-420電熱恒溫培養箱 美國Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 引物來源

從NCBI數據庫下載B.gladiolipv.cocovenenanCo14的bonM基因（序列號：CP033430.1），通過序列比對，設計唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種特異性ERA引物和探針，并由北京六合華大基因科技有限公司合成，信息見表2。

表2 引物探針序列信息Table 2 Information of the primers and probes

1.3.2 菌種培養及基因組DNA提取

將表1唐菖蒲伯克霍爾德氏菌接種到GVC增菌液中，其他菌株接種到BHI培養基，37 ℃培養24 h。取1 mL菌液于1.5 mL離心管中16 000×g離心2 min，去上清液，加入100 μL PrepManTMUltra提取液，混勻后100 ℃金屬浴放置5 min，冷卻后16 000×g離心2 min，取上清液50 μL即為DNA模板，采用紫外-可見分光光度儀測其濃度后于-20 ℃保存。

1.3.3 反應體系與檢測程序

顯色法反應體系參照基礎型核酸擴增試劑盒（ERA法）使用說明書制備，DNA模板質量濃度10 ng/μL，體積均為1 μL（熒光法和試紙條法同）。37 ℃恒溫反應15 min，反應結束后取25 μL擴增產物加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），振蕩混勻后充分離心，上清液用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。其余擴增產物加入2 μL 1 000×SYBR Green I觀察顯色情況。

熒光法反應體系參照熒光型核酸擴增試劑盒（ERA法）使用說明書制備，便攜式real-time PCR儀反應程序：第1階段37 ℃、1 s；第2階段37 ℃、14 s，共40 個循環，第2階段進行熒光信號收集。

試紙條法反應體系參照試紙型核酸擴增試劑盒（ERA法）使用說明書制備，反應程序：37 ℃恒溫反應15 min，反應結束后取5 μL反應產物至1.5 mL離心管，用純水稀釋25 倍；取出試紙條（不要觸碰硝酸纖維素膜），插入離心管中，待試紙條被液體完全浸濕，根據控制帶和檢測帶的顯色情況判讀結果。

1.3.4 引物探針篩選

ERA引物和探針的篩選是開發靈敏快速的ERA檢測方法的關鍵，因此設計多組引物探針組合（表2），以表1中3 株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的基因組DNA作為模板，對設計的引物和探針進行篩選，顯色法6 種引物組合為F1/R1-1、F1/R1-2、F2-1/R2-1、F2-1/R2-2、F2-2/R2-1、F2-2/R2-2。熒光法和試紙條法引物探針篩選采用上述擴增效果好的引物分別與熒光探針或試紙條探針組合。選擇特異性好且擴增效率高的引物和探針組合進行后續實驗。所有樣品的基因組DNA質量濃度均為10 ng/μL，每個樣品2 個平行重復，重復實驗3 次。

1.3.5 特異性檢測

分別以B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108為代表菌株、以唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的其他致病型菌株（CGMCC 1.2892、CGMCC 1.3360）及其他種屬10 株菌株的基因組DNA作為模板進行ERA反應，對篩選的引物和探針特異性進行檢測。所有樣品的基因組DNA質量濃度均為10 ng/μL，重復實驗3 次。

1.3.6 靈敏度檢測

為進一步分析建立的ERA顯色法、熒光法和試紙條法的靈敏度，以B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108為代表菌株，將其基因組DNA分別稀釋至101、100、10-1、10-2、10-3ng/μL，按照1.3.3節反應程序進行靈敏度分析，每個樣品2 個平行重復，重復實驗3 次。

1.3.7 市售樣品檢測

對15 份食品樣品，種類包括面條、湯圓、餃子、燒麥、粉絲、木耳、銀耳，按GB 4789.29—2020[13]的步驟進行樣品前處理，加入GVC增菌液中培養24 h，采用1.3.2節的方法進行基因組DNA提取。分別用本研究建立的ERA顯色法、熒光法和試紙條法進行檢測，以無菌ddH2O為空白對照，每個樣品2 個平行重復，重復實驗3 次。采用GB 4789.29—2020[13]檢驗方法對樣品進行生化鑒定和米酵菌酸毒性成分檢測。

1.4 數據分析

電泳結果有明顯的目的條帶，且顯色結果為綠色，則為檢出靶標菌核酸成分，如無明顯的目的條帶或顯色結果為橙色，則為未檢出靶標菌核酸成分。從擴增儀導出擴增圖譜和檢測數據，如有典型擴增曲線，且有檢出數據，則為檢出靶標菌核酸成分，若無報告值或無熒光對數增長，則為未檢出靶標菌核酸成分。試紙條控制帶與檢測帶都出現明顯的條帶，為檢出靶標菌核酸成分；只有控制帶出現條帶，則未檢出靶標菌核酸成分；控制帶沒有出現條帶，判定檢測結果無效。

2 結果與分析

2.1 ERA檢測引物探針篩選結果

2.1.1 顯色法引物篩選結果

傳統基礎型E R A 分析需采用電泳檢測和凝膠呈像，為滿足現場可視化檢測的需求，前期研究對中性紅、羥基萘酚藍、苯酚紅、鈣黃綠素和1 000×SYBR Green I 5 種顯色劑在ERA反應中的顯色效果進行比較，確定了用SYBR Green I作為顯色法的顯色劑。本實驗以菌株B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108 DNA為模板對6 種組合的基礎型ERA引物進行篩選。結果顯示F2-2/R2-1引物組合的擴增效果最好（圖1），因此初步擬定其作為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種基礎型顯色法ERA候選引物。

圖1 顯色法引物篩選結果Fig.1 Screening results of primers for chromogenic method

2.1.2 熒光法引物探針篩選結果

在上述擴增效果較好的基礎型引物靶序列區域設計了熒光探針P1和P2，形成4 組ERA熒光法引物探針組合：F1/R1-1/P1、F1/R1-2/P1、F2-2/R2-1/P2和F2-2/R2-2/P2，進行擴增效果分析。結果顯示，4 組引物探針均能擴增3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種，但F1/R1-1/P1的熒光強度最低（圖2A），其他3 組熒光強度差異不大（圖2B、C、D），其中F2-2/R2-1/P2引物探針組合的擴增效果最好（圖2C），起峰時間較其他2 組早，因此初步以F2-2/R2-1/P2作為熒光法ERA檢測的候選引物探針組合。

圖2 熒光法引物探針篩選結果Fig.2 Screening results of primers and probes for fluorescence method

2.1.3 試紙法引物探針篩選結果

為建立ERA試紙條法，以FAM-生物素報告基因進行免疫層析檢測，并設計4 種組合的試紙條引物探針：F1/R1-1/P1-試紙條、F1/R1-2/P1-試紙條、F2-2/R2-1/P2-試紙條、F2-2/R2-2/P2-試紙條，對其檢測效果進行了篩選。結果發現，F1/R1-2/P1-試紙條引物探針組合無法檢出B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25132（圖3B），F2-2/R2-1/P2-試紙條引物探針組合對空白對照檢測會出現弱帶（圖3C），F1/R1-1/P1-試紙條和F2-2/R2-2/P2-試紙條引物探針組合對3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種均有擴增（圖3A、D），但F2-2/R2-2/P2-試紙條較F1/R1-1/P1-試紙條的顯色較強，因此初步以其用于后續ERA試紙法檢測的引物探針。

圖3 試紙條法引物探針篩選結果Fig.3 Screening results of primers and probes for test strip method

2.2 特異性檢測結果

對初步篩選的顯色法、熒光法、試紙條法檢測的引物和探針進一步進行特異性分析，檢測結果顯示僅B.gladiolipv.cocovenenanCICC 25108為陽性，而唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的其他菌株（CGMCC 1.2892、CGMCC 1.3360）及其他常見的10 株食源性致病菌檢測均為陰性（圖4），表明篩選的引物和探針對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種具有良好的特異性。

圖4 引物探針特異性檢測結果Fig.4 Specificity evaluation of primers and probes

2.3 靈敏度檢測結果

如圖5所示，除模板質量濃度為10-3ng/μL的實驗組沒有檢出外，其他質量濃度實驗組檢測均為陽性。因此，本實驗建立的ERA顯色法、熒光法、試紙條法檢測檢出限均為10-2ng/μL，靈敏度較好。

圖5 3 種ERA可視化快速檢測方法靈敏度分析結果Fig.5 Sensitivity analysis of three ERA-based rapid visual detection methods

2.4 市售樣品檢測

如表3所示，15 種市售食品樣品中有2 個湯圓樣品檢測出唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種，檢出率為13.3%，且建立的ERA顯色法、熒光法、試紙條法檢測結果與GB 4789.29—2020方法的檢測結果一致，生化實驗結果符合且檢出米酵菌酸毒性成分。證實了本研究建立的3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種ERA可視化快速檢測方法的準確性和實用性。

表3 實際樣品檢測結果Table 3 Results of detection of actual samples

3 討論

PCR法是替代傳統培養法進行菌種鑒定的有力手段，而靶基因的選擇是保證PCR檢測結果準確的關鍵因素之一。目前基于PCR技術對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌進行鑒定的研究中有選用16S～23S rRNA基因[19,25]，也有選用bonM[26]產毒基因。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌存在多種致病型，選用16S～23S rRNA基因序列難以將椰毒致病型與其他致病型進行較好的區分，而bonM基因是米酵菌酸毒素合成所必需的基因[27]，是準確檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病型的良好選擇。本研究以唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病型菌株Co14[28]的bonM基因為靶基因，分別篩選了顯色法、熒光法和試紙條法3 種ERA方法最適的引物探針。在篩選過程中發現，引物F2-2/R2-1以及與探針P2的組合在顯色法和熒光法檢測中的擴增效率最高。然而該組合采用試紙條法進行檢測時，空白對照會出現弱陽性，這可能與試紙條的靈敏度更強有關，或者是因為空白組產生的弱陽性熒光信號值過低，導致熒光儀將其識別為噪音信號，閾值線設定稍高，將其判定為陰性。因此，在建立ERA顯色法、熒光法和試紙條法的過程中，所篩選的引物和探針并非是完全通用的，還要根據具體的實驗結果進行分析。

與PCR技術相比，ERA檢測技術在無需變溫設備的基礎上，反應時間更短且檢測靈敏度與PCR技術相同[29-32]。本研究彌補了利用ERA技術進行唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種可視化快速檢測報道的缺失，同時為便于現場檢測，分別建立了顯色法、熒光法和試紙條法3 種快速篩查方法，裸眼即可直接對結果進行判定，且在37 ℃的體溫下即可反應，因此顯色法和試紙條法可在手心或者腋窩下10～20 min完成擴增，也可采用項目組前期研究使用的熱帖[33]進行反應，解決對傳統實驗設備依賴的問題，并能快速判斷致病菌的有無。而熒光法僅需依托便攜式real-time PCR儀或熒光等溫擴增儀即可完成檢測，可快速對致病菌的含量進行半定量，還可以進行多重檢測。本研究可為食源性致病微生物的可視化快速檢測提供一種新的思路。

4 結論

本研究以唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的米酵菌酸生物合成基因簇中的bonM基因序列為靶點，通過對關鍵致病菌靶基因序列的比對分析，分別設計了高特異性、高靈敏度的ERA基礎型檢測引物，以及熒光法和顯色法檢測探針，并通過對其特異性、靈敏度分析，分別建立了顯色法、熒光法和試紙條法3 種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種現場可視化快速檢測方法。本研究建立的方法從DNA提取到檢測結果完成僅需30 min左右，對其他唐菖蒲伯克霍爾德氏致病型以及常見的食源性致病菌無任何交叉，靈敏度可達為10－2ng/μL，具有特異性好、靈敏度高、檢測時間短、操作簡單、現場可視等技術優勢，可為食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種的快速鑒別、溯源和檢測開辟新的途徑。