萘酚-苯并噻唑衍生物的合成及其瓊脂糖凝膠對三文魚新鮮度雙通道無損檢測

趙亞菲，姚 遠，鐘克利,2,*，孫小飛，李學鵬，湯立軍,2，勵建榮,*

（1.渤海大學化學與材料工程學院，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學海洋研究院，遼寧 錦州 121013；3.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；4.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

魚肉具有補充營養(yǎng)、調(diào)節(jié)血脂、改善皮膚狀態(tài)等功效，是餐桌上不可或缺的美食[1]。在眾多魚類中，三文魚具有肉質(zhì)鮮美、脂肪含量低、富含多種微量元素[2-4]等優(yōu)點，被譽為“水中珍品”。我國三文魚多數(shù)以進口為主，需要長時間運輸和貯藏才能送達消費者手中，魚肉長時間貯藏會使微生物大量生長，其不斷分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生異味[5]，消費者誤食不新鮮的魚肉后會給身體帶來損害，如引起腸胃不適、嘔吐腹瀉，嚴重的可以造成食物中毒，危及生命[6]。因此，檢測三文魚的新鮮度具有重要意義。

魚肉新鮮度傳統(tǒng)評價方法主要有氣相色譜法[7-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[10]、電化學法[11]等，然而，這些方法涉及大型儀器、操作復雜、耗時費力[12-14]、不適合實時監(jiān)測[15]，因此，開發(fā)快速、可視化實時檢測魚肉新鮮度的方法十分必要[16-17]。目前，比色法可以直觀評價魚肉新鮮度，如2020年本課題組以溴酚紅和溴甲酚紫為指示劑制備了一種指示標簽，通過標簽對魚肉樣品總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的敏感度變化評價魚肉的鮮度[18]。當指示標簽的內(nèi)圈和外圈顏色均變?yōu)樯钭仙砻黥~肉已經(jīng)腐敗；2022年，Ding Nan等[19]探索了一種基于銀摻雜普魯士藍納米顆粒的比色探針，用于檢測三甲胺和蝦/魚的新鮮度，當探針顏色由藍色變?yōu)闊o色，表明魚肉已腐敗；2023年，Said等[20]將姜黃素與明膠復合制備的比色膜用于魚片的新鮮度檢測，膜的顏色由黃色變?yōu)槌燃t色，表明魚肉由新鮮變?yōu)楦瘮　？梢姡@種簡單、經(jīng)濟、無損的比色探針在魚肉鮮度指示方面具有一定的應用前景。但是，已報道的比色探針中也存在顏色變化不顯著，魚肉在合格與腐敗之間可視化區(qū)分不明顯，進而導致品質(zhì)誤判的情況發(fā)生，因此，需要開發(fā)新方法彌補單通道比色法的不足。

熒光法由于靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點已經(jīng)成為檢測生物活性分子的有效方法之一[21-25]。將熒光法與比色法結(jié)合，開發(fā)對揮發(fā)胺比色和熒光雙響應的探針對魚肉新鮮度雙通道指示，可提升評價結(jié)果的準確性。2022年，Liu Xiuying等[26]開發(fā)了一種檢測三文魚新鮮度的比率熒光傳感標簽，當標簽顏色從粉色變?yōu)樯钏{色，熒光由粉紅色變?yōu)樗{色，表明三文魚魚肉由新鮮變?yōu)楦瘮。p通道顏色明顯變化可準確辨別魚肉所處鮮度等級。2023年，Zhang Jin等[27]基于間苯二酚開發(fā)了一種雙通道智能標簽，當標簽顏色從無色到粉紅色，并伴有強烈的紅色熒光時，表明魚蝦由新鮮變?yōu)楦瘮。@種標簽在實時顯示新鮮度方面具有較好的應用潛力。可見，開發(fā)能夠比色和對胺敏感的熒光探針，可構(gòu)建新鮮度雙通道指示標簽，其具有更好的應用前景[28-29]。

本研究旨在構(gòu)建一種新穎的熒光探針萘酚-苯并噻唑衍生物（naphthol-benzothiazole derivative，HBO），利用該分子中酚羥基具有給電子性質(zhì)，苯并噻唑磺酸鹽具有吸電子性質(zhì)，通過雙鍵連接后形成給體-π-受體結(jié)構(gòu)，這種延長的共軛體系可使HBO的發(fā)射波長增大，同時磺酸鹽還可增加HBO的水溶性。此外，HBO中萘環(huán)上的酚羥基具有酸性，可以與魚肉腐敗過程中產(chǎn)生的多數(shù)胺發(fā)生反應，失去氫質(zhì)子后，形成的氧負離子具有更好的給電子能力，使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移更容易發(fā)生，因此，HBO識別胺后會表現(xiàn)出明顯的顏色和熒光變化。最后，以凝膠為固體載體，通過混合法制備負載熒光探針HBO的傳感凝膠用于魚肉新鮮度檢測，以期為熒光探針在食品檢測領域應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮三文魚購于錦州市林西路水產(chǎn)市場，平均質(zhì)量（2 500±50）g。

6-羥基-2-萘醛、2-甲基苯并噻唑、瓊脂糖、氧化鎂、哌啶購自上海安耐吉化學有限公司，無需純化直接使用；化合物4a按照文獻[30]合成；實驗用水均為去離子水；其他所用試劑均購自天津永大公司。

1.2 儀器與設備

JY1200電子天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FSH-2高速均質(zhì)機 上海儀電科學儀器股份有限公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 上海浦予工業(yè)科技有限公司；400 MH核磁共振儀 美國安捷倫科技有限公司；F-4700熒光分光光度計 鄭州今時邁科技有限公司；U-T1810DS紫外分光光度計 上海屹譜儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 探針HBO的合成

向圓底燒瓶中加入化合物4 a（406.5 mg，1.5 mmol）、6-羥基-2-萘甲醛（172 mg，1 mmol）無水乙醇（5 mL）和0.08 mL哌啶，回流過夜。將析出的固體過濾，用冰乙醇洗滌3 次，得到棕黃色固體HBO（310 mg，73%）。1H NMR（400 MHz，氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6））δ10.31（s，1H），8.46～8.21（m，6H），7.91～7.77（m，4H），7.22～7.17（m，2H），5.12（t，J＝8.0 Hz，2H），2.69～2.67（m，2H），2.23（s，2H）。高分辨質(zhì)譜（正離子模式），分子式C22H19NO4S2[M+H]+，計算值：426.082 8，實測值：426.083 9。探針HBO的合成和傳感凝膠HBO瓊脂糖凝膠（HBO agarose gel，HBOAL）的制備方法如圖1所示。

圖1 探針HBO和傳感凝膠HBOAL的制備方法Fig.1 Preparation methods for HBO and HBOAL

1.3.2 胺溶液的配制

測試所用不同胺溶液均用蒸餾水配制成50 mmol/L，以異丙胺為例，取異丙胺29.5 mg，振蕩溶解后定容至10 mL容量瓶，即為50 mmol/L的異丙胺溶液。其他胺溶液（環(huán)己二胺、二乙胺、正丙胺、異丙胺、三乙胺、乙胺、精胺、尸胺、腐胺、2-苯乙胺、酪胺、色胺）用相同方法配制，測試所用其他濃度用蒸餾水稀釋即可。

1.3.3 探針HBO溶液的配制

稱量4.3 mg HBO固體，用DMSO溶解并定容到10 mL容量瓶中，即得到所需的1 mmol/L的HBO儲備液，吸取1 mL至100 mL容量瓶中，用EtOH/H2O（1∶9，V/V）的混合溶液定容于100 mL，得到濃度為10 μmol/L的HBO溶液，用于測試。熒光測試的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，電壓為700 V，激發(fā)波長為430 nm。

1.3.4 傳感凝膠HBOAL的制備

將0.3 g瓊脂糖溶解于15 mL蒸餾水中，加入0.2 mL甘油，將混合溶液在攪拌下加熱至澄清透明，冷卻至60 ℃時，將0.01 g HBO固體用2 滴DMSO溶解后，迅速加入到瓊脂糖溶液中，繼續(xù)攪拌至混合均勻，然后將混合液快速倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，氣泡用玻璃棒趕至培養(yǎng)皿邊緣，用滴管吸出。瓊脂糖溶液冷卻至室溫后凝固成塊，將其分割成直徑為1 cm的傳感凝膠HBOAL，用于后續(xù)實驗。

1.3.5 魚肉樣品TVB-N和pH值的測定

室溫條件下將5 g魚肉樣品用絞肉機絞碎，加入35 mL蒸餾水，用均質(zhì)機進行均質(zhì)5 min。靜置30 min后過濾，取其上層清液用全自動凱氏定氮儀測定TVB-N值，用pH計測定pH值，所有操作重復3 次。

1.3.6 傳感凝膠HBOAL對魚肉新鮮度的檢測

購買的冰鮮三文魚快速轉(zhuǎn)運至實驗室，去除三文魚表皮，將魚肉切成質(zhì)量為10 g的測試樣品，放入一次性培養(yǎng)皿中，用帶孔的薄膜密封，將傳感標簽HBOAL置于孔隙處，蓋上頂蓋并用皮筋固定。在4 ℃條件下貯藏，每隔24 h取出魚肉樣品測試其TVB-N值、pH值，并拍照記錄傳感凝膠的顏色。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗設置3 個平行，使用Origin 2021軟件繪圖，采用華為Nova7拍攝照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針HBO對不同胺的紫外-可見和熒光光譜分析

為了探究HBO對不同胺是否有比色和熒光響應，進行紫外-可見和熒光光譜測試。紫外吸收光譜如圖2a所示，探針HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液在425 nm波長處出現(xiàn)強吸收，向HBO溶液中加入不同胺溶液后，最大吸收峰紅移至535 nm，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榉凵▓D3a）。在430 nm波長的激發(fā)下，探針HBO溶液（10 μmol/L）在605 nm波長處有微弱熒光，向HBO溶液中加入不同胺溶液后，在545 nm波長處均表現(xiàn)出一定程度的熒光增強且發(fā)射峰藍移（圖2b），伴隨著熒光顏色由弱熒光變?yōu)椴煌伾膹姛晒猓▓D3b），這些結(jié)果表明，探針HBO對不同胺溶液有較好的比色和熒光響應。

圖2 探針HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液加入不同胺溶液的紫外吸收光譜（a）和熒光光譜（b）Fig.2 UV absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution added with different amine solutions

圖3 HBO溶液中加入不同胺溶液后的顏色變化Fig.3 Color changes of HBO solution after adding different amine solutions

2.2 探針HBO在不同pH值條件下的紫外吸收光譜和熒光光譜分析

如圖4a 所示，在pH 5～7 范圍內(nèi)，HBO 溶液（10 μmol/L）在430 nm波長處的吸光度變化不大，而pH值由8增大至10時，最大吸收波長變?yōu)?05 nm，且吸收強度不斷增強。HBO溶液的熒光強度（595 nm）在pH 5～10范圍內(nèi)不斷減弱（圖4b），在pH 5～7范圍內(nèi)減弱程度相對較小，結(jié)合紫外吸收譜圖，pH值在5～7范圍內(nèi)HBO受pH值影響較小，說明探針HBO在只能在微酸性條件下使用。

圖4 HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液在不同pH值條件下的紫外吸收光譜（a）和熒光光譜（b）Fig.4 UV absorption spectra (a) and fluorescence spectra (b) of HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution at different pH conditions

2.3 探針HBO識別胺的靈敏度及響應時間

如圖5a所示，向HBO溶液（10 μmol/L）中加入不同濃度（0～250 μmol/L）的精胺，HBO溶液的熒光強度逐漸增強，并且熒光強度與精胺濃度在40～240 μmol/L范圍內(nèi)有較好的線性關系（R2＝0.994，圖5a內(nèi)插圖），利用公式（檢出限（limit of detection，LOD）＝3S/K（S為空白樣的標準偏差；K為熒光強度與精胺濃度線性關系的斜率））計算出HBO的LOD為0.4 μmol/L，表明HBO檢測精胺具有較好的靈敏度。另外，向HBO溶液（10 μmol/L）中加入250 μmol/L的精胺，其熒光強度（545 nm波長處）隨時間的變化結(jié)果如圖5b所示。隨著時間的延長，HBO熒光發(fā)射強度逐漸增強，在75 s后達到平衡，說明HBO對胺有較快的識別響應速率，為實現(xiàn)快速實時檢測魚肉新鮮度奠定了基礎。

圖5 HBO（10 μmol/L）的EtOH/H2O（1∶9，V/V）溶液識別精胺的靈敏度及響應時間Fig.5 Sensitivity and response time of spermine recognition by HBO(10 μmol/L) in EtOH/H2O (1:9,V/V) solution

2.4 探針HBO的細胞毒性及對精胺的細胞成像

將不同濃度（1、5、10、30、50 μmol/L）的HBO溶液與MCF-7細胞共同培育24 h后，即使HBO濃度為30 μmol/L時，細胞成活率仍接近80%，說明HBO具有較低的毒性（圖6a），可應用到生物體系中。將MCF-7細胞與HBO共同孵育30 min后，向其中加入不同濃度的精胺（100、200、500 μmol/L），在37 ℃條件下繼續(xù)孵育30 min，隨著精胺濃度的增加，在紅色及綠色通道中可觀察到熒光強度均逐漸增強（圖6b），表明探針HBO能夠穿透細胞膜，在細胞中對胺化合物進行熒光成像。

圖6 HBO的細胞毒性及其在活細胞中對精胺的熒光成像Fig.6 Cytotoxicity of HBO and its fluorescence images in living cells exposed to spermine

2.5 真實魚肉樣品檢測

根據(jù)GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》規(guī)定，海水魚中TVB-N最高限量為30 mg/100 g。當樣品TVB-N值≤15 mg/100 g時為優(yōu)級，15 mg/100 g＜TVB-N值≤30.0 mg/100 g時為合格，TVB-N值＞30.0 mg/100 g時為不合格。為了探究傳感凝膠HBOAL的顏色與三文魚新鮮度之間的對應關系，將HBOAL與三文魚魚肉在4 ℃貯藏，測定TVB-N值和pH值，結(jié)果如圖7a所示。隨著時間的延長，pH值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，符合魚肉微生物分解劣變趨勢。TVB-N值從起始的（7.00±0.06）mg/100 g整體呈上升趨勢，在第4天達到（15.10±1.20）mg/100 g，表明此時魚肉樣品合格；在第8天達到（30.30±0.06）mg/100 g，表明此時魚肉樣品已腐敗。同時，記錄HBOAL在不同時間的顏色變化，結(jié)果如圖7b所示。當魚肉新鮮時，傳感凝膠日光顏色為暗粉色，熒光顏色為藍色。第4～7天魚肉處于合格狀態(tài)時，HBOAL的日光顏色變?yōu)闇\粉色，熒光顏色變?yōu)榫G色。第8天后魚肉腐敗，HBOAL日光顏色變?yōu)闇\紅色，熒光顏色為黃色，由此建立了HBOAL顏色與三文魚魚肉新鮮度之間的對應關系。

圖7 4 ℃貯藏條件下三文魚魚肉的pH值和TVB-N值隨貯藏時間的變化（a）及HBOAL在日光和熒光下的顏色隨貯藏時間的變化（b）Fig.7 Changes in TVB-N and pH of salmon fish with storage time (a),and changes in HBOAL color under daylight and fluorescence (b) during storage at 4 ℃

最后，根據(jù)三文魚新鮮度與傳感凝膠HBOAL顏色之間的對應關系，制作了標準比色卡（圖8）。將HBOAL與魚肉4 ℃條件下共同貯藏，監(jiān)測HBOAL顏色變化，并根據(jù)標準比色卡判斷魚肉的新鮮程度等級，結(jié)果如圖9所示。HBOAL在日光下為暗粉色，在熒光下為藍色時，表明三文魚肉為新鮮狀態(tài)；HBOAL在日光下為淺粉色，在熒光下為綠色熒光時，表明三文魚肉處于合格狀態(tài)；HBOAL在日光下變成淺紅色，在熒光下變成黃色時說明三文魚肉已腐敗，這些結(jié)果表明HBOAL可通過日光和熒光雙通道響應，準確判斷三文魚魚肉所處的鮮度等級。消費者可根據(jù)HBOAL的變色情況及時判斷魚肉的新鮮程度，在生鮮、肉類市場具有較好的應用潛力，同時也為食品智能標簽的研究提供一定的理論參考依據(jù)。

圖8 傳感凝膠HBOAL的標準比色卡Fig.8 Standard colorimetric cards of HBOAL

圖9 4 ℃貯藏條件下傳感凝膠HBOAL監(jiān)測三文魚魚肉新鮮度的顏色變化及評定的鮮度等級Fig.9 Monitoring of color changes indicating salmon freshness and freshness classification by HBOAL under 4 ℃ storage condition

3 結(jié)論

本研究基于萘酚合成的熒光探針HBO在EtOH/H2O（1∶9，V/V）體系中可對12 種胺快速響應（75 s），對精胺有較低的LOD（0.4 μmol/L），并可在活細胞中對精胺進行熒光成像。基于HBO構(gòu)建的傳感凝膠成功應用于三文魚魚肉新鮮度的檢測，HBOAL在日光下由暗粉色變成淺紅色，在熒光下由綠熒光變成黃熒光，表明魚肉由新鮮變?yōu)楦瘮。瑢崿F(xiàn)了比色和熒光雙通道指示。這種無損、雙通道可視化判定魚肉鮮度等級的方法可為商家和消費者提供及時有效的新鮮度信息，具有較好的應用前景。