基于網絡藥理學、分子對接和實驗驗證探討蘋果對溶血致高膽紅素血癥的影響

安 瓊，魏 媛，李 倩，王江文，岳國仁，王貞香

（河西學院醫學院，甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

新生兒高膽紅素血癥又稱新生兒黃疸，是新生兒常見的臨床問題，我國高膽紅素血癥新生兒的發病率為50%～80%，該病由于膽紅素（主要指間接膽紅素（indirect bilirubin，IB））代謝異常，引起血中膽紅素水平升高，出現以皮膚、黏膜及鞏膜黃染為特征的癥狀。新生兒黃疸早期癥狀不明顯，后期出現典型的神經功能異常，并留有后遺癥。因此盡早預測膽紅素對神經組織的損傷有助于臨床預防膽紅素腦病的發生，對降低新生兒病死率及致殘率具有重要的意義[1-4]。

新生兒體內膽紅素代謝主要經肝臟代謝，而新生兒肝功能發育不完善，造成肝細胞攝取膽紅素的能力低下；并且新生兒酶系統不成熟，其中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶含量低且活力不足，不能有效地將IB與葡萄糖醛酸結合形成直接膽紅素（結合膽紅素）；新生兒膽紅素產生過多或其他陰離子含量增加都會引起膽紅素排泄發生障得，尤其是早產兒，會暫時出現肝內膽汁淤積[5]。目前，對新生兒黃疸的治療主要是通過藥物治療、照射治療、換血治療等方法[6]。這些方法對新生兒黃疸有一定的療效，但對機體有一定的影響[7-8]。因此有必要探究治療新生兒黃疸的新方法。

蘋果是薔薇科落葉喬木的果實，原產于歐洲及亞洲中部，在我國遼寧、河北、甘肅、四川和西藏等地常見栽培[9]，廣受人們喜愛。在我國《名醫別錄》中記載，蘋果果實入藥[10]，其作為一種藥食兩用水果，具有較高的營養價值和經濟價值。蘋果中含有大量的黃酮類、酚酸類和三萜類等生物活性物質。黃酮類主要有黃酮類、黃酮醇類、黃烷醇類、花色苷類、查耳酮類等。目前，已從蘋果中發現黃酮類35 種，如兒茶素、表兒茶素、槲皮素等；酚酸類21 種，如對香豆酰奎尼酸、奎尼酸、綠原酸、咖啡酸等；三萜類24 種，如熊果酸、β-谷甾醇等。這些生物活性成分使蘋果具有多種藥理活性，但是對于蘋果是否對膽紅素的代謝有影響鮮見報道。

網絡藥理學是系統生物學的重要組成部分，它可預測中藥活性成分和其作用機制，構建“藥物-成分-靶點-疾病”的作用網絡，為疾病作用機制的研究、新藥的研發奠定基礎[11]。因此，本研究采用中藥復方的網絡藥理學研究方法，預測蘋果活性成分與高膽紅素血癥的網絡關系，探究蘋果活性成分的作用靶點與高膽紅素血癥患者內源性蛋白和信號通路之間的作用關系。并用分子對接驗證網絡分析的可靠性，然后用制備的蘋果醇提取物干預溶血性黃疸大鼠模型，測定總膽紅素（total bilirubin，TB）、IB等相關指標，探究蘋果對溶血致高膽紅素血癥代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD（SPF級）雄性大鼠60 只，體質量180～220 g。每籠3～4 只，飼養在室溫（24±1）℃，普通飼料喂養，自由飲水，適應性飼養7 d。實驗過程遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》。所有動物研究均按照天津市實驗動物使用和護理委員會制定的指南進行，整個項目方案由南開大學動物倫理委員會批準。動物使用許可證號：SYXK（津）2019-0003。

成熟的鮮蘋果品種為市售靜寧紅富士。

茵梔黃口服液（10 mL/支，含黃芩苷0.4 g）北京華潤高科天然藥物有限公司；鹽酸苯肼 上海麥克林生物科技有限公司；氯化鈉注射液 華潤雙鶴藥業股份有限公司；75%醫用酒精 德州綠海醫療科技有限公司；碘伏消毒液 蘭州美爾康生物科技有限公司；甲醛 天津市百世化工有限公司；伊紅染液、蘇木精 珠海貝索生物技術有限公司；無水乙醇天津致遠化學試劑有限公司；槲皮素對照品、沒食子酸對照品、表兒茶素對照品、根皮素對照品、β-谷甾醇對照品、白細胞介素-6酶聯免疫吸附測試（interleukin-6 enzyme-linked immunosorbent assay，IL-6 ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒 上海優選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

一次性使用負壓采血容器 山東省成武縣醫用制品廠；H12型血紅蛋白（hemoglobin，HB）分析儀 桂林優利特醫療電子有限公司；BCD-610普通冰箱 美的集團；半自動石蠟切片機、組織脫水處理機、自動組織包埋機 德國SLEE公司；微量移液器 德國Sartorius公司；802B離心機無錫市瑞江分析儀器有限公司；高溫高壓滅菌鍋日本SANYO公司；干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；1681130酶標儀 美國Bio-Rad公司；7600S全自動生化分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果活性成分與靶點的篩選

通過CNKI、PubMed查閱文獻資料搜集蘋果的活性組分，在本草組鑒、ECTM、Swiss ADME數據庫（http://www.swissadme.ch/）中輸入相關化合物的Canonical SMILES，選取胃腸吸收度高、類藥性優的化合物作為目標化合物，然后在Swiss Target Prediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch./）中輸入目標化合物的Canonical SMILES號，選擇物種為“Homo Sapiens”，篩選其中probability＞0.7的靶點為蘋果活性成分的目標靶點[12]。

1.3.2 溶血所致高膽紅素血癥靶點的篩選

以“Hyperbilirubinemia”“Hemolytic jaundice”為檢索詞，分別從GeneCards、Drugbank、Therapeutic Target Database、OMIM等疾病數據庫中獲得治療溶血所致高膽紅素血癥的作用靶點。

1.3.3 蘋果活性成分與溶血所致高膽紅素血癥網絡的構建

用Venny2.1.0在線軟件尋找蘋果活性成分靶點和疾病靶點的共同作用靶點，并繪制蘋果活性成分靶點與疾病相關靶點的Venn圖；將獲得的共同作用靶點導入STRING數據庫，檢索篩選并且分析獲得的蛋白質相互作用網絡，然后用Cytoscape 3.9.1軟件分析獲得網絡圖中的關鍵靶點。

1.3.4 核心靶點的基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

將1.3.3節中獲得的蘋果活性成分和疾病的共同作用靶點導入Metascape數據庫，對其進行GO和KEGG的富集分析。用Cytoscape 3.9.1軟件構建蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標”網絡，分析潛在靶標的相互作用。

1.3.5 分子對接驗證

根據蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標”網絡分析結果及潛在靶標相互作用，分別篩選網絡中度值靠前的活性成分和重要的潛在靶標進行分子對接。通過PubChem網站（http://zinc.docking.org/）獲取小分子的2D結構，利用ChemBio3D軟件將其轉化為mol2文件備用；在PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）查詢并獲取靶標的3D結構，用PyMOL軟件取小分子、加氫后保存備用。將小分子和靶蛋白數據導入Autodock軟件進行分子對接，獲得對接結合能、氫鍵等信息，以此評價活性成分和潛在靶標相互結合的穩定性和網絡藥理分析結果的可靠性。

1.3.6 驗證實驗

1.3.6.1 蘋果醇提取物（apple alcohol extract，AE）的制備

稱取適量蘋果放入榨汁機中打碎，用體積分數75%乙醇溶液按液料比1∶1（mL/g）回流提取1.5 h，提取2 次，合并濾液補足質量，用0.20 μm的濾膜過濾，采用標準對照法，用高效液相色譜進樣分析。采用Intersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。沒食子酸、表兒茶素、根皮素、槲皮素的分析采用程序1：檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流動相A為甲醇，流動相B為體積分數0.1%的磷酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～10%A，95%～90% B；10～13 min，10%～67% A，90%～33% B；13～20 min，67%～61%A，3 3%～3 9% B；20～40 min，61%～55% A，39%～45% B。β-谷甾醇采用程序2：檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（體積比為98∶2），等度洗脫。進行動物實驗時，按制備方法同比例增加液料比，對獲得的提取液濃縮至所需濃度。

1.3.6.2 造模、分組與給藥

取SD雄性大鼠60 只，隨機分為6 組：空白組、模型組、陽性對照組（茵梔黃注射液）、AE低劑量干預組、中劑量干預組、高劑量干預組，每組10 只。參考楊李等[13]的方法，連續兩天以腹腔注射鹽酸苯肼建立溶血性高膽紅素血癥大鼠模型，初次注射量為50 mg/kgmb，第2次注射劑量減半，每天一次；在末次注射24 h后進行干預。陽性對照組給予茵梔黃注射液1.2 mL/kgmb，AE低劑量組40 g/kgmb，AE中劑量組80 g/kgmb，AE高劑量組160 g/kgmb，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水，每天一次，在干預過程中，取大鼠尾尖血，用HB儀測定HB水平。干預3 d后，腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉，心臟采血，用重氮試劑法測定TB和IB水平，用全自動生化分析儀測定谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）水平，用試劑盒測定TNF-α、IL-6水平。切取肝左葉相同部位肝組織約2 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，在10%福爾馬林溶液中浸泡24 h，用小流水沖洗24 h，待組織固定完全后（沒有紅色或淡紅色的組織），取出用于蘇木精-伊紅染色[14]。

1.4 數據處理與分析

實驗獲得的數據結果應用SPSS26.0統計軟件處理，結果以±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蘋果的活性成分

根據1.3.1節搜集整理蘋果成分的方法，獲得化學成分共44 個。根據數據庫的篩選符合胃腸吸收度高、類藥性優的化合物，確定17 個成分為蘋果的主要活性成分，具體信息見表1。

表1 蘋果的主要活性成分Table 1 Major active components of apples

2.2 蘋果活性成分潛在的靶標

通過Swiss Target Prediction數據庫查詢17 個化合物的成分靶標，整理獲得288 個蘋果醇提物的成分靶標。將蘋果活性成分的靶標與疾病靶標通過Venny 2.1.0在線軟件取交集，獲得蘋果活性成分治療溶血性高膽紅素血癥的潛在靶標81 個，如圖1所示。

圖1 蘋果活性成分靶標與溶血所致高膽紅素血癥疾病靶標交集后的Venn圖Fig.1 Venn diagram of the intersection between the targets of active ingredients in apples and those of hemolysis-induced hyperbilirubinemia

2.3 蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥的關鍵靶點網絡圖

將2.2節獲得的潛在靶標輸入STRING數據庫，選擇“Multiple protein”“Homo sapiens”，設置置信水平為0.700，隱藏沒有關聯的節點，涉及122 個節點，其中靶標絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase，SRC）、信號傳導及轉錄激活因子3（signal transducer andactivator of transcription 3，STAT3）、熱休克蛋白90A1（heat shock protein 90A1，HSP90A1）、早期原癌基因JUN、缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）在網絡中節點最大，顏色最深（圖2），可能與蘋果治療溶血所致高膽紅素血癥密切相關。

圖2 治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶標相互作用網絡Fig.2 Network of potential target interaction for the treatment of hemolysis-induced hyperbilirubinemia

2.4 蘋果活性成分潛在靶標KEGG與GO富集結果

將81 個潛在靶點通過Metascape數據庫進行KEGG分析，獲得81 條信號通路，-lgP越大則表明富集的程度越高[15]。取KEGG分析的前20具體信號通路信息，結果見圖3。蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶點主要富集在膽汁分泌、HIF-1信號通路、TNF信號通路、核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路等相關通路。

圖3 蘋果治療高膽紅素血癥潛在靶標的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of potential targets of apples for the treatment of hyperbilirubinemia

由圖4可知，蘋果活性成分與溶血所致高膽紅素血癥潛在靶點主要分布于細胞前沿、細胞質核周區域、細胞外膜等細胞組分中；蘋果的活性成分可能通過與蛋白質結合，激活跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸轉移酶活性，與泛素-類蛋白連接酶結合等方式，參與細胞遷移正向運動、細胞運動的正向調控、血管內皮生長因子受體信號通路、上皮細胞增殖調控、血管生成等生物過程，從而發揮蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥的作用。

圖4 蘋果治療高膽紅素血癥潛在靶標的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of apples for the treatment of hyperbilirubinemia

2.5 蘋果“疾病-通路-活性成分-靶標”網絡圖的構建結果

蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標”網絡關聯結果如圖5所示，圖中紅色三角形代表藥物，深藍色四邊形代表疾病，綠色橢圓形代表活性成分，紫色六邊形代表通路，粉色正方形代表靶點。根據網絡分析中度值標識節點的大小評估貢獻，節點越大，所起的貢獻越大。在蘋果的17 個活性成分中，其中PG4（槲皮素：101）、PG11（2α-羥基熊果酸：74）、PG12（β-谷甾醇：56）、PG3（根皮素：47）、PG2（表兒茶素：45）在治療溶血所致高膽紅素血癥中起重要的作用。

圖5 蘋果的“疾病-通路-活性成分-靶標”網絡關聯Fig.5 Disease-pathway-active component-target network for apples

2.6 分子對接結果

在2.5節構建的網絡中，網絡中度值篩選排名前5的活性成分（槲皮素、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表兒茶素）分別與網絡中較為重要的潛在靶標（AKT1、VEGFA、EGFR、STAT3、SRC）進行分子對接，通過分子對接可以驗證上述網絡藥理分析結果的可靠性。結合能小于-1.2 kcal/mol，表示活性成分和靶標結合良好；結合能大于-4.0 kcal/mol時，表示活性成分和靶標有較強的結合能力[16]。從表2可以看出，蘋果篩選的活性成分和獲得的治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶標有較強的親和能力，選擇這5 種活性成分與潛在靶標分子結合最穩定的對接結果繪制分子對接圖（圖6）。

圖6 蘋果活性成分與潛在靶標分子部分對接Fig.6 Molecule docking diagrams of active components in apples with potential targets

表2 蘋果活性成分與潛在靶標分子對接結果Table 2 Molecules docking results of potential targets with active components of apples

2.7 AE成分分析

根據1.3.6.1節的方法及條件對樣品溶液和對照品溶液進行分析，沒食子酸、表兒茶素、根皮素、槲皮素、β-谷甾醇能得到較好的分離，結果如圖7所示。

圖7 對照品色譜圖Fig.7 Chromatogram of references

2.8 AE干預溶血所致高膽紅素血癥大鼠的實驗結果

如圖8所示，空白組大鼠生長狀態良好、毛色有光澤、尾部紅潤，尿液略顯淺黃色；模型組大鼠反應遲鈍、尾部成灰黃色、毛色晦暗、眼睛灰黃，尿液呈深黃色。

圖8 造模后與造模前實驗動物比較Fig.8 Comparison of normal and hyperbilirubinemic rats

如表3所示，與空白組比較，模型組的HB水平均明顯降低（P＜0.01），TB、IB、ALT、AST水平均明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、AE高劑量組、AE中劑量組、AE低劑量組的HB水平均升高（P＜0.05），TB、IB、ALT、AST水平均顯著或極顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。肝臟組織染色結果見圖9。

圖9 肝臟組織病理切片結果Fig.9 Pathological sections of liver tissues

表3 大鼠血液中HB、TB、IB、ALT、AST的指標（n＝12）Table 3 Levels of HB,TB,IB,ALT and AST in the serum of rats (n=12)

如表4所示，與空白組比較，模型組的血液TNF-α、IL-6質量濃度極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性對照組、AE高劑量組、AE中劑量組、AE低劑量組的TNF-α、IL-6水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 大鼠血液中的指標TNF-α、IL-6水平（n＝12）Table 4 Levels of TNF-α and IL-6 in the serum of rats (n=12)

3 討論與結論

有研究表明，蘋果多酚可通過清除自由基抑制脂質過氧化反應，提高機體抗氧化能力，促進肝細胞修復與再生，從而起到保肝利膽的作用[17-18]。通過網絡藥理學的分析，篩選出17 個符合胃腸吸收度高、類藥性優的蘋果活性成分。其中槲皮素、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表兒茶素在治療溶血所致高膽紅素血癥起重要的作用。研究發現β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調節免疫系統、抗衰老等生物活性[19]，從而能夠發揮抗溶血性黃疸的作用；槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗衰老、提高免疫力、抗肝病等作用[20]，故有助于溶血性黃疸的治療；表兒茶素具有抗炎、抗氧化、保護神經、預防非酒精性脂肪肝和抗肝纖維化[21]，從而發揮抗溶血性黃疸的作用。

溶血所致高膽紅素血癥與蘋果活性成分的交集靶點有81 個，中度值排名前5的關鍵靶點為AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3。AKT1參與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol kinase 3，PI3K）、EGFR等多個通路，在炎癥、細胞增殖、遷移和纖維形成的肝損傷過程中起著獨特的作用[22]。VEGFA的表達可以促進血管形成，在肝臟的再生和修復過程中起重要作用[23]。

GO的富集分析預測蘋果的活性成分可能通過與蛋白質結合，激活跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸轉移酶活性，與泛素-類蛋白連接酶結合等方式，參與細胞遷移正向調控、細胞運動的正向調控、血管內皮生長因子受體信號通路、上皮細胞增殖調控、血管生成等生物過程，從而發揮蘋果活性成分治療溶血所致高膽紅素血癥的作用。

KEGG分析核心靶點通過膽汁分泌、HIF-1信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路等通路發揮治療作用；有研究顯示，炎癥介質既可作為NF-κB信號通路的靶向基因，又可激活NF-κB信號通路，當肝臟損傷時，NF-κB信號通路可參與調控炎癥因子的產生主要信號通路[24-25]。有大量研究表明，NF-κB信號通路可被TNF-α、IL-1β等因子誘導激活，因此可通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-16等炎癥因子的表達，下調NF-κB信號通路的相關蛋白改善肝臟損傷[26-27]。HIF-1的表達受氧濃度的影響，可通過調控下游蛋白，參與細胞增殖、細胞凋亡等生理過程，作為內源性保護機制的始動因子和共同途徑。HIF-1與PI3K/Akt信號通路關系密切。有研究表明，右美托咪定可通過激活PI3K/Akt信號通路減少梗阻性黃疸的肝細胞凋亡[28-29]。

蘋果中篩選的活性指標槲皮素、2α-羥基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表兒茶素分別和中度值排名前5的關鍵核心靶標（AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3）進行分子對接，大部分對接結果的結合能小于-4.0 kcal/mol，這表明蘋果篩選的活性成分和獲得的治療溶血所致高膽紅素血癥潛在靶標有較強的親和能力。AE中有槲皮素、表兒茶素、根皮素、β-谷甾醇等活性組分，結合網絡藥理學的分析結果，這些組分對溶血所致高膽紅素血癥起重要作用。

鹽酸苯肼進入腹腔吸收入血后，能迅速與HB形成高鐵血紅蛋白并生成海因茲小體；生成的海因茲小體沉積在細胞膜上，使其流動性下降、滲透性增加，并可裂解部分細胞膜功能，導致溶血發生[30]，而鹽酸苯肼本身并無明顯神經毒性，故能較好地模擬新生兒溶血致高膽紅素血癥的生理過程。在人體中，膽紅素主要經人體的肝臟代謝，代謝的過程中需要多種酶的參與完成。當患高膽紅素血癥時，體內三磷酸腺苷的活性和心肌細胞對氧的攝取受到抑制，導致大量氧自由基堆積，可造成心肌損傷[31]；ALT和AST是肝細胞受損、心肌受損的標志，因此造模成功后大鼠的HB水平下降，TB、IB、ALT、AST的水平升高；肝組織病理切片顯示，模型組出現淤血和點狀壞死，其炎癥因子TNF-α、IL-6水平增高。用茵梔黃注射液和AE干預后HB水平升高，其他指標下降，肝細胞輕度水腫。網絡分析結果與動物實驗結果相一致，說明茵梔黃注射液和AE對溶血所致的高膽紅素血癥有治療作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學、分子對接、動物實驗探討了蘋果治療溶血所致高膽紅素血癥可能的活性成分、疾病靶點及通路、篩選的指標性成分與蛋白的相互作用，AE對溶血所致高膽紅素血癥有治療作用，所得結果為進一步的實驗、臨床研究提供了理論方向。但對于關鍵蛋白、預測的信號通路還需進一步通過實驗驗證。