靶向Rho 激酶1 納米探針聯合MRI 可視化動脈粥樣硬化斑塊的實驗研究

楊雅雯，夏敏，宋夢星，馬占龍

作者單位 南京醫科大學第一附屬醫院（江蘇省人民醫院）放射科，南京 210029

0 引言

動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）斑塊破裂是心肌梗死和中風的主要原因[1-4]。斑塊的不穩定性主要與斑塊中的炎癥反應、新生血管生成、出血、薄的纖維帽及鈣化等有關，其中最主要的是炎癥反應和新生血管[5]。隨著現代醫學發展，AS 的診治水平明顯提高，但是識別不穩定斑塊仍是臨床工作的一大挑戰[6]。研究發現，過度激活的RhoA/Rho 激酶（Rho-kinase, ROCK）通路是促進斑塊不穩定的重要因素。

ROCK 是小G 蛋白家族RhoA 的下游效應器，也是一種絲/蘇氨酸激酶，通過磷酸化下游分子發揮調節作用[7]。ROCK 尤其存在血液循環中的炎癥細胞和血管平滑肌細胞的細胞質內[8]，靜息狀態下，形成自動抑制環，不發揮生物學作用[9]。血液循環中氧化低密度脂蛋白[10]、溶血磷脂酸[11]、凝血酶[12]等可激活內皮細胞中的RhoA/ROCK，高活性ROCK 磷酸化下游分子，導致內皮炎性因子釋放及炎細胞浸潤[13]，促進斑塊不穩定。ROCK被激活后，促進中膜平滑肌細胞向內膜增殖遷移、表型轉化以及維持高收縮力[14]，導致斑塊進展、血管重構及血管收縮痙攣。血管重構會增加血管壁張力，血管收縮痙攣誘導斑塊爆破樣破裂，導致心絞痛甚至心肌梗死[15-16]。總之，過度激活的ROCK 會加劇斑塊的不穩定性，誘發不良心腦血管事件。ROCK 是AS 負荷和急性冠脈綜合征的潛在生物標志物[17]，是合適的監測靶點。

分子影像學可無創性監測細胞和蛋白質水平的病變。對不穩定斑塊的特征（炎癥、新生血管、出血鈣化等）進行分子成像可實現在體無創監測量化。目前已經開發出p-選擇素和黏附因子VCAM-1 的雙靶點探針[18]、CD40 雙模態探針[19]、profilin-1 抗體納米探針[20]和VEGFR2 的靶向轉換納米探針[21]用于斑塊中的炎癥反應，血管平滑肌細胞和新生血管的MRI，并取得預期結果。MRI 無電離輻射、多參數多序列成像及較高的軟組織分辨率等，已成為一種理想的影像檢查技術。超小超順磁性氧化鐵納米粒子是有效的磁共振T2成像陰性對比劑，常用于AS斑塊和腫瘤成像。

關于靶向ROCK 的分子影像學研究尚未見報道。本實驗旨在探索斑塊中ROCK1 的表達，制備ROCK1 靶向納米探針，探索MRI 可視化AS 斑塊的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗組為載脂蛋白E 基因敲除（Apolipoprotein-Edeficient, ApoE-/-）雄性鼠（n=60）（北京維通利華動物技術有限公司），高脂飲食（含3%膽固醇和20%脂肪）（南京協同生物技術有限公司）。對照組為C57BL/6雄性鼠（n=20）（南京醫科大學動物實驗中心），普通飲食。兩組小鼠置于相同的飼養環境。本研究獲得南京醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（實驗倫理編號：IACUC1909029-1）。

1.2 合成納米探針

稱取150 mg DSPE-MPEG2000、50 mg DSPE-PEG 2000-COOH，充分溶解于4 mL 三氯甲烷中。加鐵含量為10 mg 的20 nm 油酸修飾的Fe3O4納米顆粒，超聲充分混合；加4 mL 去離子水，超聲充分混合。在70 ℃水浴鍋中旋轉蒸發10 min，充分除去三氯甲烷，得到透亮的Fe3O4@PEG納米顆粒水溶液。過220 nm濾膜除去團聚體。取360 μL的Fe3O4@PEG納米顆粒水溶液，加96 μL ROCK1 抗體及2 mL MES 溶液，混合均勻。搖床150 rpm 4 ℃ 30 min，加200 μL 乙基碳二亞胺鹽，搖床150 rpm 4℃ 4.5 h。將反應好的溶液加入超濾管，放入離心機（4000 rpm，8 min）除去未結合抗體，獲得Fe3O4@PEG-ROCK1靶向探針溶液。

1.3 表征及體外成像納米探針

透射電子顯微鏡（Jem-2100F，Jeol）觀察納米粒子的形態分布。納米粒度電位儀（Nano ZS90，Malvern）測量兩周內Zeta 電位和水合粒徑尺寸。振動樣品磁強計（Lakeshore7407，美國Lakeshore 公司）獲得飽和磁化強度。紫外分光光度計（UV，3600 Shimadzu，日本島津制作所）測量探針的紫外吸收波譜。

用7.0 T 磁共振掃描儀（Bruker，德國）測量Fe3O4@PEG-ROCK1的弛豫性能。將Fe3O4@PEG-ROCK1配制成等體積不同鐵濃度的溶液，等量純水作為對照，獲得T1 mapping、T2 mapping 值。鐵濃度為橫坐標，R1（R1=1/T1）、R2（R2=1/T2）為縱坐標，計算出曲線斜率r1、r2。采用T2-PDWI序列獲得相應的加權圖像。掃描序列與相應參數：T1 mapping，TR 800 ms，TE 11 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉角1=90°，翻轉角2=180°，層厚0.5 mm；T2 mapping，TR 2500 ms，TE 22 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉角1=90°，翻轉角2=180°，層厚0.5 mm；T2-PDWI，TR 2500 ms，TE 65、13 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉角1=90°，翻轉角2=180°，層厚0.5 mm。

1.4 免疫活性和細胞實驗

使用小鼠ROCK-1 抗體酶聯免疫分析試劑盒（YJ581147，上海，中國）檢測Fe3O4@PEG-ROCK1 免疫活性。設置四組，即純抗體（n=3）、靶向探針（n=3）、非偶聯探針（n=3）、煮沸后的靶向探針（n=3）。制作標準曲線計算樣品中抗體濃度。

采用MTT 比色法檢測Fe3O4@PEG-ROCK1 探針的細胞毒性。使用細胞為鼠源性巨噬細胞RAW264.7 細胞。探針濃度梯度為3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL。每組設置6個復孔。

采用普魯士藍染色觀察RAW264.7細胞對探針的攝取。取兩皿生長狀態及密度相同的RAW264.7 細胞，分別加入等量 Fe3O4@PEG-ROCK1與Fe3O4@PEG的培養基，孵育24 h 后行普魯士藍染色，光學顯微鏡（eclipse Ci-e，日本尼康）觀察細胞結合情況。

1.5 動脈粥樣硬化中ROCK1表達和活性

在第10、16、22、28、34周，隨機挑選ApoE-/-鼠（n=5），測量小鼠體質量及制備腹主動脈ROCK1 免疫染色切片。使用Image J 軟件測量斑塊中ROCK1 表達的平均光密度。蛋白印跡檢測主動脈ROCK1 活性。Rho 激酶主要磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基1（Myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1）為p-MYPT1[19]，因此兩者比值代表Rho 激酶的相對活性，計算公式：Rho 激酶的相對活性=p-MYPT1 蛋白表達量/MYPT1 蛋白表達量。方法如下：選取喂養34 周的ApoE-/-鼠（n=5）和C57BL/6 鼠（n=5），過量麻醉處死，取出腹主動脈（長約1.5 cm），通過蛋白印跡檢測MYPT1（22117-1-AP，Proteintech Group，武漢，中國）和p-MYPT1（AF5445，Affinity Biosciences，美國）蛋白的表達。

1.6 體內MRI

34 周的ApoE-/-鼠分兩組，組1 尾靜脈注射Fe3O4@PEG（n=10），組2注射尾靜脈注射Fe3O4@PEGROCK1（n=10）。劑量為10 mg/kg。注射納米探針前及注射后8、16 h分別進行掃描。使用7.0 T磁共振掃描儀直徑為38 mm 單通道容積線圈。雙回波T2-PDWI 序列參數：TR 2500 ms，TE 65、13 ms，FOV 2 cm×2 cm，矩陣256×256，翻轉角1=90°，翻轉角2=180°，層厚0.5 mm，層間距為0 mm，掃描時間30 min。最后一次掃描結束后安樂死處死小鼠，取出腹主動脈標本。

使用Image J軟件測量斑塊信號強度。平掃時動脈壁中最高的信號被指定為斑塊。在平掃、8 h、16 h圖像的相同層面的相同位置勾畫相同大小的感興趣區域，測出信號強度。使用對比噪聲比表示相對信號強度。對比噪聲比=（斑塊組織中動脈壁信號-血液信號）/噪聲。噪聲由背景空氣中像素強度的標準偏差表示[22]。

1.7 組織化學

將腹主動脈標本進行石蠟包埋切片（4 μm）。免疫染色用于定位ROCK1 蛋白，普魯士藍染色用于氧化鐵顆粒（納米磁性顆粒）可視化。

1.8 統計學分析

所有數據均使用平均值±標準差表示。使用SPSS 27.0進行統計學分析，使用GraphPad Prism 9軟件繪制統計圖。樣本量根據既往課題組經驗及文獻搜索確定。符合正態分布的數據進行參數檢驗，兩組間的比較使用獨立樣本或配對樣本t檢驗，多組間的比較使用ANOVA 檢驗，不符合正態分布的數據使用非參數檢驗，兩組間的比較使用Mann-WhitneyU檢驗，多組分析使用Kruskal-Wallis 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納米探針的表征

電鏡圖像顯示Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1為黑色球形顆粒，均勻穩定地分散在溶液中，無團聚（圖1A～1B）。兩周內Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1的粒徑和峰值Zeta 電位保持穩定，且兩者差異均具有統計學意義[粒徑（27.06±1.52） nm vs.（30.52±2.95） nm，U=3.000，P=0.015；電位（-35.18±0.31） mV vs.（-16.60±3.26） mV，U=0.000，P=0.002]（圖1C～1D）。Fe3O4@PEG紫外吸收峰為225 nm，連接ROCK1抗體后Fe3O4@PEG-ROCK1 紫外吸收峰為253 nm（圖1E），以上這些數據表明ROCK1 抗體與Fe3O4@PEG成功偶聯，保持良好穩定性。

圖1 Fe3O4@PEG 納米顆粒（1A）和Fe3O4@PEG-ROCK1納米顆粒（1B）的電鏡圖像，比例：20 nm。兩周內測定Fe3O4@PEG 和Fe3O4@PEG-ROCK1的水合粒徑（1C）、Zeta電位（1D），及紫外吸光度（1E）。ROCK：Rho相關激酶。Fig.1 The scanning electron micrographs of Fe3O4@PEG nanoparticles (1A) and Fe3O4@PEG-ROCK1 nanoparticles (1B), scale: 20 nm.The hydrated particle size (1C), Zeta potential (1D), and ultraviolet absorbance (1E) of Fe3O4@PEG and Fe3O4@PEG-ROCK1 are measured within two weeks.ROCK: Rho-kinase.

2.2 免疫活性和細胞實驗

巨噬細胞吞噬實驗結果顯示，Fe3O4@PEG-ROCK1組細胞內可見少量藍色氧化鐵顆粒，而Fe3O4@PEG組細胞內見大量藍色氧化鐵顆粒。說明靶向探針Fe3O4@PEG-ROCK1 較Fe3O4@PEG 可以降低巨噬細胞內吞作用（圖2A～2B）。

圖2 巨噬細胞吞噬實驗。2A、2B 分別為Fe3O4@PEG、Fe3O4@PEG-ROCK1 與巨噬細胞共孵育后行普魯士藍染色，藍染顆粒為鐵納米，比例：100 μm；2C 為不同鐵濃度下Fe3O4@PEG-ROCK1的細胞存活率；2D為Fe3O4@PEG-ROCK1納米顆粒的免疫活性。*表示P＜0.05。Fig.2 Macrophage phagocytosis test.Fe3O4@PEG (2A) and Fe3O4@PEG-ROCK1 (2B) are incubated with macrophages and performed prussian blue staining, the blue particles are iron nanoparticles, scale: 100 μm.2C is cell viability of different iron concentrations of Fe3O4@PEG-ROCK1.2D is the immunological activity of Fe3O4@PEG-ROCK1.*denotes P＜0.05.

細胞毒性實驗顯示，一定鐵濃度范圍內，細胞存活率在80%以上，表明靶向探針在一定的濃度內無毒性（圖2C）。

酶聯免疫吸附實驗顯示，各組免疫活性如下：純抗體組（n=3）0.54±0.01，Fe3O4@PEG-ROCK1 組（n=3）0.52±0.02，煮沸Fe3O4@PEG-ROCK1 組（n=3）0.27±0.00，Fe3O4@PEG 組（n=3）0.24±0.01。純抗體組與靶向探針的免疫活性差異無統計學意義（H=1.667，P=0.571）,靶向探針與非靶向探針的免疫活性差異有統計學意義（H=6.667，P=0.024），以上結果證明ROCK1 抗體與Fe3O4@PEG 偶聯后，仍保持抗體活性（圖2D）。

2.3 體外MRI

Fe3O4@PEG-ROCK1 的 r1=0.364 mM-1s-1，r2=162.271 mM-1s-1，r2/r1=446，表明靶向探針可以顯著縮短T2弛豫時間，具有良好的T2弛豫性能。T2-PDWI圖像顯示，隨著鐵濃度的增加，溶液信號強度逐漸減低，對比明顯（圖3A～3B）。靶向探針的飽和磁化強度為0.086 8 T，磁化曲線過原點，說明探針具有超順磁性（圖3C）。這些結果表明Fe3O4@PEG-ROCK1 是良好的磁共振陰性對比劑。

圖3 MRI 等體積不同鐵濃度的Fe3O4@PEG-ROCK1 的圖像（3A）、Fe3O4@PEG-ROCK1 弛豫曲線（3B）、Fe3O4@PEG-ROCK1磁化曲線（3C）。Fig.3 MRI are performed on equal volumes of Fe3O4@PEG-ROCK1 with different iron concentrations (3A), the relaxation curve of Fe3O4@PEG-ROCK1(3B) and the magnetization curve of Fe3O4@PEG-ROCK1 (3C).

2.4 動脈粥樣硬化中的ROCK1的表達和活性

APOE-/-鼠體質量明顯增加，明顯高于C57BL/6健康鼠，差異有統計學意義[（31.54±0.46） g vs.（28.89±0.44） g，U=0.000，P＜0.001](圖4)。ROCK1 免疫染色顯示，隨著斑塊增大，ROCK1的陽性表達區也增大，主要分布在斑塊的肩部、內膜下及壞死炎癥區（圖5B～5E）。皮爾遜相關性分析（圖5A）顯示ROCK1 的表達與斑塊面積呈正相關（n=30）（r=0.959，P＜0.001）。蛋白印跡（圖6A～6B）顯示，晚期AS 小鼠血管組織（n=10）中ROCK1活性明顯高于健康鼠（n=10）（0.30±0.02 vs.0.24±0.02，U=1.000，P＜0.001）。以上這些數據表示隨著AS進展，ROCK1蛋白的表達量及活性增加。

圖4 不同周齡ApoE-/-小鼠和C57BL/6鼠的體質量（g）。圖5 斑塊中ROCK1陽性表達面積對應的平均光密度值（5A）及不同周齡ApoE-/-小鼠腹主動脈斑塊切片的ROCK1免疫染色（圖5B～5E）。5B～5E對應16、22、28、32周，比例：100 μm。Fig.4 Weight of ApoE-/- mice and C57BL/6 mice at different weeks (g).Fig.5 Mean optical density values of ROCK1 expression in plaques (5A) and ROCK1 immunohistochemical images of abdominal aorta of ApoE-/- mice at different weeks (5B-5E).5B-5E correspond to 16、22、28 and 32 weeks, respectively.Scale: 100 μm.

圖6 蛋白印跡及其統計圖。6A：ApoE-/-鼠和健康C57BL/6鼠的主動脈ROCK1活性的蛋白印跡圖。C4～C5：C57BL/6鼠，M11～M13：ApoE-/-鼠；6B：蛋白印跡測得的P-MYPT1/MYPT1 的統計圖，p-MYPT1/MYPT1 表示ROCK1活性。***表示P＜0.001。MYPT1：肌球蛋白磷酸酶靶亞基1。Fig.6 Western blots and their statistical plots.6A: Western blot of ROCK1 activity in ApoE-/- mice and C57BL/5 mice.C4-C5: C57BL/6 mice, M11-M13: ApoE-/- mice; 6B: Statistical plot of P-MYPT1/MYPT1 measured by western blot.P-MYPT1/MYPT1 indicates ROCK1 activity.*** indicates P＜0.001.MYPT1: myosin phosphatase target subunit 1.

2.5 體內MRI和組織學結果

如圖7～圖9 所示，注射納米探針前，Fe3O4@PEG組（n=10）和Fe3O4@PEG-ROCK1 組（n=10）小鼠斑塊信號強度差異無統計學意義（8.25±1.39 vs.7.81±3.22，t=-1.680，P=0.099）。注射納米探針后，兩組斑塊信號強度均下降，與Fe3O4@PEG 組（n=10）相比，Fe3O4@PEG-ROCK1 組（n=10）斑塊信號降低更明顯（8 h，5.37±1.79 vs.3.91±2.26，U=392.000，P=0.001）（16 h，6.68±2.39 vs.4.61±2.80，U=463.000，P=0.001），8 h 最明顯，斑塊內可見片狀信號丟失區域。普魯士藍染色顯示斑塊內有藍色鐵顆粒沉積，Fe3O4@PEG-ROCK1組（n=10）多于Fe3O4@PEG組（n=10）（0.54±0.02 vs.0.34±0.01，U=36.000，P=0.002），且主要分布斑塊的內膜下和壞死區域。免疫組化主要用于蛋白的定位，ROCK1表達陽性區域與普魯士藍中的探針沉積區域對應。

圖7 兩組小鼠注射Fe3O4@PEG 和Fe3O4@PEG-ROCK1的磁共振圖像。Fig.7 Magnetic resonance images of mice injected with Fe3O4@PEG and Fe3O4@PEG-ROCK1.

圖8 兩組的普魯士藍染色圖和免疫組化圖。圖9 兩組小鼠的斑塊信號強度的統計圖（9A）及斑塊中普魯士藍沉積量（9B）。**P＜0.01。Fig.8 Prussian blue staining and immunohistochemical staining of the two groups of specimens.Fig.9 Plaque signal intensity (9A) and prussian blue deposition in the plaques (9B) of the two groups of mice.**P＜0.01.

3 討論

本實驗首先建立AS 模型小鼠，采用免疫組化及蛋白印跡分析ROCK1 在斑塊中的表達及活性。其次制備及表征Fe3O4@PEG-ROCK1。最后將Fe3O4@PEG-ROCK1用于AS斑塊的可視化MRI。關于ROCK 作用的研究主要在細胞水平，本研究發現ROCK1 在斑塊中高表達和高活性，證明靶向探針聯合MRI實現在體檢測斑塊中ROCK1活性可行。

3.1 選擇ROCK1作為成像靶點

大量研究表明，ROCK活性增高會引起血管收縮痙攣、促炎因子釋放、炎癥細胞募集，加重炎癥反應，加劇斑塊的不穩定性[23]。本實驗發現，ROCK1 在AS中呈高表達及高活性，在斑塊中主要分布在內膜下、肩部和壞死區域，與ROCK1 在斑塊中的促炎癥壞死作用有關。GAO 等[24]證明ROCK 活性增高會導致內皮功能障礙、加劇炎癥反應。CHEN 等[25]的一項頸動脈斑塊基因研究表明，與炎癥和免疫反應相關的中心基因是Rho GTP 酶激活蛋白。既往研究表明，ROCK 基因缺陷小鼠心血管疾病發病率減少[26]，靶向抑制ROCK表現出一定的治療效果[27]，提示ROCK是AS的潛在治療靶點，也是合適的成像靶點。

3.2 評價Fe3O4@PEG-ROCK1 作為靶向探針和陰性對比劑

MRI 陰性對比劑一般以超順磁性氧化鐵物質為主，能縮短組織的T2 弛豫時間，減低信號[28]。本研究在USPIO表面修飾油酸和PEG，能增加穩定性和延長體內循環時間[29]。Fe3O4@PEG 與ROCK1 抗體偶聯，制成功能化探針Fe3O4@PEG-ROCK1，使其定向結合ROCK1 分子，增加目標區域結合量。這與既往研究中靶向探針制備方法類似[30]。巨噬細胞的內吞作用是營養物質清除、免疫監視和治療藥物遞送的關鍵調節途徑，可影響納米探針的穩定性及靶向成像效果。本實驗中，巨噬細胞對Fe3O4@PEG-ROCK1的攝取遠低于Fe3O4@PEG，說明Fe3O4@PEG-ROCK1可下調巨噬細胞的吞噬清除，進而更好地結合靶點，發揮成像作用。但是WEN等[31]制備的氧化低密度脂蛋白的靶向探針被泡沫細胞大量吞噬，QIU 等[28]制備的黏附因子的靶向探針被巨噬細胞大量吞噬，可能是靶向分子在細胞中分布不同。黏附因子和氧化低密度脂蛋白分別在巨噬細胞和泡沫細胞中大量表達，而ROCK與體內多種細胞作用發揮調控功能。

生物相容性是納米探針應用臨床的重要參數[32]。Fe3O4@PEG-ROCK1穩定性良好，兩周之內粒徑尺寸和電位無明顯波動，電鏡圖顯示分布均勻，無團聚。ROCK1 抗體連接到Fe3O4@PEG 表面仍保持免疫活性。細胞毒性實驗顯示一定鐵濃度范圍內Fe3O4@PEG-ROCK1 的細胞存活率在80% 以上。Fe3O4@PEG-ROCK1 的弛豫值為162.3 mM-1s-1，優于目前大部分的磁性材料[29]，是良好的分子探針和MRI對比劑。

3.3 評價Fe3O4@PEG和Fe3O4@PEG-ROCK1體內成像

Fe3O4@PEG 無特異性，在斑塊中的沉積量取決于巨噬細胞的非特異性吞噬[29]，磁共振信號改變反映斑塊中的炎癥反應。而Fe3O4@PEG-ROCK1 定向結合斑塊及血管壁中的ROCK1 分子，信號改變反映ROCK1 含量，鑒于ROCK1 在AS 發生發展以及預后中的重要作用，靶向ROCK1 成像有利于ROCK1 活性的精準體外監測。相關研究表明靶向探針在目標區域的沉積量可以達到四倍[33-34]。本實驗中，對比8、16 h斑塊信號，Fe3O4@PEG-ROCK1組較Fe3O4@PEG組信號下降更明顯，說明Fe3O4@PEG-ROCK1在斑塊及血管壁中沉積量更多。Fe3O4@PEG 組斑塊信號在16 h 時增加，可能是Fe3O4@PEG 在體內被巨噬細胞快速地非特異性地吞噬代謝，繼而導致斑塊信號的快速變化。WU 等[35]研究表明小鼠巨噬細胞Fe3O4-NPs 的攝取在8 h 達到最大值，在12～24 h 內細胞內含量下降，可能與細胞的胞吐作用有關。

3.4 斑塊ROCK1分子靶向MRI的臨床價值

本研究是第一項針對ROCK1 的分子影像學研究，證明了在體監測斑塊的 ROCK1 活性的可行性。這有助于識別不穩定斑塊、評估斑塊生物學特性，有利于實現高危斑塊的早期識別及危險事件的早期預防診治。不穩定斑塊與薄纖維帽、大的脂質核心、炎癥反應、新生血管、鈣化等相關[5]。既往類似研究靶向特異性分子反映不穩定斑塊某一方面，如血管內皮生長因子在維持和調控血管的形成及血管新生等生理過程發揮重要作用，相關的靶向磁共振信號改變反映新血管生成的情況[21]。P-選擇素和黏附因子是參與內皮細胞介導的炎癥反應過程的重要因子，信號改變反映斑塊炎癥活性[18]。ROCK 與不穩定斑塊的因素密切相關，靶向ROCK 成像更能反映斑塊的綜合信息。

3.5 研究的局限性

本實驗研究還需進一步完善：第一，實驗所用的樣本量較少，可能導致結果可靠性下降，應擴大實驗樣本量進行下一步驗證；第二，沒有研究ROCK 抑制劑的治療作用以及相關MRI，補充這一部分能進一步驗證本文的研究結果且對靶向探針的臨床應用有更直觀的展示；第三，靶向探針在體內循環時間更長可能會產生毒性及進一步改善探針的生物相容性和降低毒性。

4 結論

本研究構建靶向探針Fe3O4@PEG-ROCK1，該探針穩定性好，特異性強，保持良好生物活性和磁敏感性。Fe3O4@PEG-ROCK1 可在體監測斑塊中ROCK1 的表達，有利于高危斑塊的風險預測和無創監測。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：楊雅雯構思設計本研究的方案，起草和撰寫稿件，獲取、分析和解釋本研究的數據；馬占龍構思設計本研究的方案，對稿件的重要內容進行修改，獲得國家自然科學基金項目的資助；夏敏、宋夢星構思設計本研究的方案，獲取、分析本研究的數據，對稿件重要內容進行修改。全體作者都同意最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性和誠信。