7.0 T MRI評估青藏高原環境下亞硒酸鈉改善大鼠肺動脈高壓后左心室功能的初步研究

尹紅科，梁博深，陳皓田，王磊，趙思斯，方鑫，郜發寶*

作者單位 1.四川大學華西醫院放射科，成都 610041；2.四川大學華西醫院分子影像研究室，成都 610041

0 引言

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一種罕見病，其特征是肺血管阻力的增加[1]。PAH典型的動脈病變包括新生內膜形成、內膜纖維化以及平滑肌細胞增生[2]。持續的動脈病變會引起右心室后負荷增加，進而導致右心室重構以適應過高的肺動脈壓[3]。由于右心室是右心功能的主要承擔者，其結構和功能是預測PAH 預后的重要因素[4]。因此，目前對于PAH 繼發的心臟功能改變大量研究僅關注右心室[5]。實際上，左右心室共同位于空間有限的心包內、共用一個室間隔、被共同的心肌纖維所包繞，兩者在結構和功能上相互依存[6]。PAH 發生后右心室收縮時間延長會導致室間隔向左移位進而阻礙左心室充盈[7]。MA 等[8]的研究測量了結締組織病相關PAH患者的左心室舒張功能，結果表明左心室舒張功能參數可用于指導治療。目前有多種PAH 動物模型用于基礎研究領域，主要分為藥物誘導和非藥物誘導。其中藥物誘導PAH 動物模型是通過皮下注射野百合堿（monocrotaline, MCT）[9]，非藥物誘導則以手術的方式建立模型。MCT誘導的PAH大鼠模型最為經典，其優勢在于時間成本低、操作簡便、重復性好。

硒是一種微量元素，其具有抗氧化和抗炎等屬性[10]。與此同時，硒作為硒蛋白的重要組成部分，參與了機體眾多的生理功能[11]。一項研究揭示了硒蛋白在PAH 發病機制中的作用，證實其可以作為一種新的生物標志物和治療靶點[12]。正常生理條件下適度提高血清中硒含量有利于心血管健康[13-14]，而硒缺乏常導致克山病的發生[15]。臨床實踐過程中，最常采用亞硒酸鈉（sodium selenite, SE）作為補硒制劑[16]。近年來，已有研究報道SE 通過誘導鐵死亡、下調丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1）的表達發揮抗腫瘤特性[17-18]。ABEDELAHI等[19]的研究表明SE 能夠通過減少活性氧的產生、增強谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活性進而提高機體抗氧化能力。一項先前的研究發現，通過灌胃補充不同劑量的SE，可以緩解MCT 誘導的PAH[20]。然而，針對PAH 的大多數研究[21-23]都是在平原環境中進行的，而不是在高原。高原最突出的地理氣候特征是低氧，低氧會引起肺血管收縮進一步加劇PAH 的誘發[24]。因此，雖然SE 能夠緩解PAH，但其在實際的高原低氧環境中的適用性和效果，以及SE 對高原低氧環境下PAH 后左心室功能的作用有待進一步研究闡明。與常見的1.5 T或3.0 T 磁共振成像相比，7.0 T 磁共振成像可以提供更多的技術優勢，主要包括：更高的時間和空間分辨率、良好的信噪比，及高質量的血管成像[25]。得益于影像技術的進步，心臟磁共振（cardiac magnetic resonance, CMR）成像已經成為評估心臟結構和功能的金標準[26]，利用其組織追蹤（tissue tracking, TT）技術可以為心臟結構、功能和心肌力學檢測提供早期無創的方法[27]。本研究利用CMR-TT技術評估SE在高原低氧環境下對PAH 后左心室功能的影響，同時輔以病理染色和血清生化檢測進行初步的機制探索。本研究將為臨床評估和管理高原低氧環境下PAH繼發的左心室功能損傷提供基礎支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗主要藥品

MCT（純度95%，CAS，315-22-0）、SE（純度99.0%，CAS，10102-18-8）購置于Sigma Aldrich 公司（中國，上海）；4%多聚甲醛溶液購置于四川愛德科技有限公司；TUNEL 染色試劑盒（E-CK-A325，中國，武漢）購置于伊萊瑞特生物科技公司；生化檢測試劑盒（E-BC-K020-M，中國，武漢）購置于艾爾生生物科技有限公司。

1.2 實驗動物及處理

本研究經過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準，批準文號：20231219007。所有大鼠均飼養在室溫（23±2） ℃、濕度55%±5%、可自由獲取飲用水和食物、12 h光照/黑暗循環和通風良好的環境中。于-20 ℃的冰箱中取出MCT，并用電子天平（Sartorius，BSA323S-CW，德國）稱取0.4 g的MCT 晶體，充分溶解于40 mL 的溶劑中（無水乙醇∶生理鹽水=1∶4）。實驗中所使用的MCT 溶液均現用現配。46 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6～8 周齡,平均體質量180～220 g）購置于成都達碩實驗動物有限公司，于第二日從成都（海拔500 m）陸運至青海省玉樹州高原動物實驗室（海拔4250 m），并將所有的大鼠隨機分為對照組（n=10）、模型組（MCT 組，n=20）和治療組（SE 組，n=16）。高原低氧環境下飼養28 周，對照組注射與模型組相等量的生理鹽水，而MCT組和SE組大鼠則一次性腹腔注射60 mg/kg 的MCT 建立PAH模型。一周后，SE 組給予0.7 mg/kg SE 灌胃一個月，而對照組和MCT 組正常飼養一個月。干預完成后將所有大鼠運回成都。隨機從三組中各選取8 只大鼠進行CMR成像以評估左心室功能、應變及T2弛豫時間。最后，取材大鼠左心室和血液樣本進行病理和生化檢測。

1.3 實驗儀器

7.0 T 磁共振成像儀（Bruker，BioSpec 70/30 USR，德國）。掃描前的準備工作簡化如下：（1）使用呼吸麻醉機（Midmark 公司，MATRX VIP3000，美國）麻醉大鼠后，將其俯臥于檢查臺上，使心臟置于表面線圈中心；（2）在大鼠前肢和左后肢皮下植入三個心門控電極并用醫用膠帶固定；（3）呼吸門控放置于大鼠腹部呼吸最明顯的部位；（4）將加熱墊放置于大鼠體表以維持掃描過程中體溫的恒定。CMR 成像序列包括心臟快速小角度激發（fast low angle shot,FLASH）電影序列和T2 mapping 序列，以評估左心室功能、應變和T2 弛豫時間，FLASH 電影序列的具體參數如下：翻轉角20°、視野50 mm×50 mm、重復時間8 ms、回波時間2.5 ms、層間距1.5 mm、層厚1.5 mm、矩陣（192×192）、分辨率0.26×0.26 mm/pixel、層數8～10。使用T2 mapping 序列對心臟基底部、心中部、心尖部三個層面進行了成像，成像參數如下：重復時間1200 ms，回波時間8 ms、層數3，層厚1.5 mm，矩陣192×192，視野50 mm×50 mm，激發角90°。掃描過程中待大鼠心電穩定后，記錄每只大鼠的心率和呼吸頻率。

1.4 CMR圖像分析

CMR 圖像分析由一名具有7 年工作經驗和中級職稱的實驗工程師完成。將DICOM 圖像導入CVI42 分析軟件（CVI42，v5.1.1，加拿大）中。在心臟長軸和短軸圖像上定義左、右心室舒張末期和收縮末期后，從心底到心尖逐層勾畫心內膜和心外膜。勾畫完成后，軟件自動計算心室心功能和左心室應變參數，包括左心室射血分數（left ventricular ejection fraction, LVEF）、左心室收縮末容積（left ventricular end-systolic volume, LVESV）、左心室舒張末容積（left ventricular end-diastolic volume, LVEDV）、左心室每搏輸出量（left ventricular stroke volume,LVSV）、右心室舒張末期容積（right ventricular end-diastolic volume, RVEDV）、右心室收縮末期容積（right ventricular end-systolic volume, RVESV）、右心室每搏輸出量（right ventricular stroke volume,RVSV）、右心室射血分數（right ventricular ejection fraction, RVEF）、左室整體縱向應變（left ventricular global longitudinal strain, LVGLS）、左心室整體周向應變（left ventricular global circumferential strain,LVGCS），及左心室整體徑向應變（left ventricular global radial strain, LVGRS）。對于T2 mapping序列，選取4個無偽影的感興趣區分別測量心臟基底部、心中部、心尖部三個層面，并計算所有測量值的均數以量化反映心肌水腫的T2弛豫時間（圖1）。

圖1 應用心臟磁共振組織追蹤技術獲取各組大鼠左心室功能和應變參數。1A：心臟短軸位；1B：心臟長軸位；1C：量化T2 弛豫時間。1A、1B 中的綠線和紅線分別是勾畫的心外膜和心內膜；1C中的小圈代表感興趣區。Fig.1 The left ventricular function and strain parameters of rats in each group are obtained by cardiac magnetic resonance tissue tracking technology.1A:Short axis of heart; 1B: Long axis of heart; 1C: Quantify the T2 relaxation time.The green and red lines in 1A and 1B represent the epicardium and endocardium outlined, respectively, while the small circles in 1C represent region of interest.

1.5 血生化檢測

完成CMR 成像后，采集大鼠血液樣本進行生化檢測。血液樣本在3000 rpm 的轉速下離心15 min 獲得血清，并用生化試劑盒（Elabscience，E-BC-K 020-M，中國，武漢）測定氧化應激相關指標，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、GSH-Px和丙二醛（malondialdehyde, MDA）。

1.6 病理HE染色

取材大鼠新鮮心臟和肺組織置于10%的多聚甲醛溶液（四川愛德科技有限公司，E672002-0050，中國，成都）中固定24 h 以上，然后用不同濃度梯度的乙醇（科隆化學品有限公司，中國，成都）脫水，脫水后嵌入石蠟，將蠟塊放在石蠟切片機上切成3 μm 厚度的切片并染色。最后使用軟件（CaseViewer，4.2，德國）分析圖像，以評估PAH 模型是否誘導成功及SE的療效。

1.7 TUNEL染色

使用原位末端轉移酶標記技術（terminal deoxynucleotice transferase mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）評估左心室心肌細胞凋亡情況。將TUNEL 染色獲得的融合圖像導入Image J（1.8.0，美國）分析軟件中。然后對圖像進行處理并計算各組大鼠左心室心肌細胞凋亡的相對熒光強度。同時將得到的相對熒光強度相對于對照組進行歸一化處理后進行統計分析。

1.8 統計學分析

統計分析軟件采用GraphPad（9.5.1，美國）。正態分布數據表達為均數±標準差，否則以中位數（P25，P75）表示。正態性檢驗用Shapiro-Wilk檢驗，方差齊性檢驗用Bartlett檢驗。對于滿足正態分布并且方差齊的數據，組間差異比較采用單因素方差分析，否則視情況采用Kruskal-WallisH非參數檢驗或Welch方差分析，多重比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準（α）定為0.05。

2 結果

2.1 體質量、心率和呼吸頻率評估

與MCT 組[體質量（542.25±64.00） g]相比，經過SE 干預一個月的SE 組大鼠體質量[（565.50±54.00） g]有所增加。但是，對照組、MCT 組和SE 組大鼠在體質量、心率和呼吸頻率方面的差異均不具有統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 三組大鼠體質量、心率、呼吸頻率及血清SOD、GSH-Px、MDA水平Tab.1 The body weight, heart rate, respiratory rate and serum SOD, GSH-Px and MDA levels in three groups of rats

2.2 血生化評估

各組大鼠血清中SOD、GSH-px 和MDA 水平如表1 所示。對照組和MCT 組大鼠的GSH-Px 值差異具有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，MCT 組大鼠血清中的MDA 增加（P＜0.05）。上述結果提示MCT組大鼠抗氧化能力下降，出現了氧化應激損傷。相較于MCT 組，SE 組大鼠血清中SOD 和GSH-Px 的水平有所升高（P均＜0.05），而MDA 的水平有所降低（P＜0.05），提示經SE治療可以提高抗氧化能力、緩解氧化應激損傷。

2.3 左心室功能評估

相較于對照組，MCT 組的LVEF 和LVGCS 降低（P均＜0.05），提示PAH 發生后左心室功能存在一定程度的損傷。而SE 干預扭轉了這一趨勢，具體表現為SE 組的LVEF、LVGRS 和LVGCS 相較于MTC 組明顯提高（P均＜0.05）。總之，SE 干預能在一定程度上提升PAH后左心室功能，詳見表2。

表2 三組大鼠的心室心功能、左心室應變和左心室T2弛豫時間Tab.2 The ventricular cardiac function, left ventricular strain and left ventricular T2 relaxation time in three groups of rats

2.4 左心室病理評估

肺組織蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin, HE）染色表明，相較于對照組大鼠，MCT組肺動脈管壁明顯增厚、中層平滑肌明顯增生。這表明本研究在高原低氧條件下成功建立了MCT誘導的PAH大鼠模型。左心室HE染色表明，MCT組左心室心肌細胞胞漿出現了少量空泡化。然而，SE組未見上述病理改變，提示SE干預能減輕PAH后的左心室損傷，具體詳見圖2。

圖2 三組大鼠肺組織（2A～2C）和左心室（2D～2F）的病理蘇木精-伊紅（HE）染色（HE ×40）。2A：對照組大鼠肺組織HE 染色；2B：模型組大鼠肺組織HE 染色；2C：治療組大鼠肺組織HE染色；2D：對照組大鼠左心室HE染色；2E：模型組大鼠左心室HE 染色；2F：治療組大鼠左心室HE 染色（黑箭代表肺動脈和心肌細胞胞漿內空泡形成）。Fig.2 The pathological Hematoxylin-Eosin(HE) staining of lung tissue (2A-2C) and left ventricle (2D-2F) in three groups of rats(HE ×40).2A: HE staining of lung tissue in control group rats; 2B: HE staining of lung tissue in model group rats; 2C: HE staining of lung tissue in treatment group rats; 2D: HE staining of the left ventricle in control group rats; 2E: HE staining of the left ventricle in model group rats; 2F: HE staining of the left ventricle in treatment group rats (the black arrow indicates the pulmonary artery and cardiomyocyte intracytoplasmic vacuolation).

2.5 左心室心肌細胞凋亡評估

TUNEL免疫熒光染色顯示，與對照組大鼠相比，MCT 組大鼠左心室的相對熒光強度顯著增高（P＜0.001），而SE 處理后使治療組的TUNEL 染色相對熒光強度較MCT 組明顯降低（P＜0.001）（圖3）。這提示SE 對MCT 誘導PAH 后大鼠左心室心肌細胞的凋亡具有保護作用。

圖3 各組大鼠左心室凋亡免疫熒光染色（×40）。藍色為正常心肌細胞核，紅色為凋亡的心肌細胞核。3A：對照組凋亡染色；3B：模型組凋亡染色；3C：治療組凋亡染色；3D：各組大鼠左心室凋亡染色相對熒光強度的統計結果，C：對照組；MCT：模型組；SE：治療組。MCT：野百合堿；SE：亞硒酸鈉。****表示P＜0.001差異具有統計學意義。Fig.3 The apoptotic staining of left ventricle in each group of rats (×40).The blue signifies the nuclei of normal myocardial cells, while red denotes the nuclei of apoptotic myocardial cells.3A: Apoptotic staining of the control group; 3B: Apoptotic staining of the model group; 3C: Apoptotic staining of the treatment group;3D: Statistical results of the relative fluorescence intensity of apoptotic staining in the left ventricle of rats in each group, C: control group; MCT: model group; SE:treatment group.MCT: monocrotaline; SE: sodium selenite.**** indicates a statistically significant difference at P＜0.001.

3 討論

本研究應用7.0 T 磁共振成像技術研究了MCT誘導PAH 大鼠的心室功能改變，并在此基礎上采用SE 進行相關干預。結果發現，相較于對照組，MCT組大鼠左心室功能受損，表現為LVEF 和LVGCS 降低，而SE 治療后明顯提升了左心室功能和應變。借助血清生化檢測和病理染色，實驗也探索了SE 療效的相關機制。本研究首次提出在高原低氧環境下SE可緩解PAH 繼發的左心室功能損傷，這可能為臨床治療提供潛在新方法。

3.1 構建PAH大鼠模型

出于操作的考慮，本研究不同于以往大多數研究所采用的經大鼠頸背部皮下注射MCT 建立PAH模型[28]，而是通過腹腔注射的方式。這種方式很大程度上提高了操作的簡便性。實驗過程中，定期觀察了各組大鼠的一般情況包括體質量、攝食、飲水等，結果發現模型大鼠在注射MCT 2 周后逐漸出現食欲缺乏、體質量降低，這可能與PAH 的形成有關。不同于先前研究中所使用的MCT 溶液配制方式[29]，本研究將MCT 充分溶解于含有無水乙醇和生理鹽水的溶劑（無水乙醇∶生理鹽水=1∶4）中。右心導管技術直接測量平均肺動脈壓是判斷PAH 模型是否成功的金標準[30]，但是由于實驗開展期間正值新型冠狀病毒疫情，加之高原條件的限制，本研究只能通過病理來判斷模型建立情況。肺組織HE 染色表明：相較于對照組，模型組的肺動脈管壁明顯增厚、中層平滑肌明顯增生，這與以往研究[31]結果一致。總之，本研究在高原低氧環境下成功建立了PAH大鼠模型。

3.2 SE與PAH后左心室功能

目前，PAH 尚缺乏有效的治療手段。對于PAH的研究大多數在平原進行[32-35]，而本研究則在高原低氧環境構建MCT 誘導的PAH 模型。同時利用CMR-TT在心臟方面的優勢探討SE在青藏高原低氧環境下對PAH 后左心室功能的影響。本研究對各組大鼠均進行了常規的心臟FLASH 電影序列掃描，同時也進行了T2 mapping 序列的采集。電影序列可提供心室結構、功能和應變等相關信息，而T2 mapping序列可定量心肌T2 弛豫時間以此反映心肌水腫情況[36-38]。上述兩種序列可為臨床評估PAH 后心室功能異常提供參考信息。本研究發現，相較于對照組大鼠，MCT 組大鼠的LVEF 和LVGCS 有所降低（P＜0.05），提示PAH 發生后左心室功能在一定程度上受到影響，這可能與低氧暴露、疾病自身所引起的右心室后負荷增加相關。其他團隊的研究證實肺PAH 患者相較于正常對照人群存在LVGLS降低[39-40]，而本研究發現MCT 誘導PAH 形成后LVGCS 同樣存在降低。此外，本研究還探索性地利用SE 干預進而發現其可以在高原低氧環境下提升PAH 后左心室功能，具體表現為：SE 組的LVEF、LVGRS 和LVGCS 得到提高。這可以為高原環境下PAH 引起的左心室功能降低的治療提供參考依據。本研究還定量了各組大鼠左心室T2弛豫時間，但差異無統計學意義，可能的原因在于檢測時間點的選取未在最佳范圍內。

3.3 SE與氧化應激和左心室凋亡

本研究取樣了大鼠心臟組織，對左心室進行了病理HE 和TUNEL 染色。結果表明，與對照組相比，模型組大鼠左心室局部心肌細胞胞漿內出現少量空泡化、左心室心肌細胞凋亡增加，提示高原低氧環境下MCT誘導PAH形成后左心室功能的改變可能涉及多個病理過程和機制。SOD和GSH-Px作為內源性抗氧化酶反映機體抗氧化能力[41]，而MDA 則是活性氧介導脂質過氧化生成的一種不飽和醛類物質，它可以反映氧化應激損傷[42]。本研究中給予SE 干預緩解了左室上述病理改變，結合血生化檢測結果SE 組呈現出SOD 和GSH-Px升高、MDA 降低，本研究推測這可能與SE提升大鼠抗氧化能力、緩解氧化應激損傷相關。

3.4 局限性

當然，本研究存在如下局限：（1）未能在藥物誘導PAH形成后，縱向評估左心室功能變化；（2）未能深入探討SE提升左心室功能的具體信號通路；（3）未及時檢測各組大鼠血清硒含量；（4）由于高原地區實驗條件的限制，雖然所有大鼠運回成都后本研究在盡可能短的時間內進行了檢測，但脫離低氧環境對實驗結果的影響依然存在。

4 結論

綜上所述，本研究在高原低氧環境下成功構建了MCT 誘導的PAH 大鼠模型，初步探索了SE 對PAH 繼發左心室功能不全的改善作用及其潛在機制。結果顯示，SE 干預顯著提升了PAH 大鼠的左心室功能，這一作用可能與其提高抗氧化水平、抑制心肌細胞凋亡有關。盡管存在未縱向評估左心室功能變化、未測定血清硒含量及高原實驗條件的限制等局限性，但為治療高原環境下PAH 引起的左心室功能損傷提供了新策略和見解。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：郜發寶設計了本研究的方案，對稿件重要內容進行了修改，獲得了國家自然科學基金項目的資助；尹紅科起草和撰寫稿件，獲取、分析并解釋本研究的數據；梁博深、陳皓田、王磊、趙思斯、方鑫獲取和解釋了本研究的數據，對稿件重要內容進行了修改。全體作者都同意發表最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性和誠信。