保肝顆粒對大鼠酒精性肝損傷的早期干預作用

朱正望, 高達, 郭桓博, 趙靜涵, 王琳琳, 苗明三, 朱平生*

(1.河南中醫藥大學第一臨床醫學院, 鄭州 450046; 2.河南中醫藥大學藥學院, 鄭州 450046)

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是臨床常見的一種肝病,隨著經濟社會的發展,ALD的發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。研究表明,進入人體的酒精90%以上在肝臟代謝,可導致肝細胞破壞,持續性的肝細胞損傷會引發肝炎、肝硬化甚至肝癌[3-4]。目前臨床上主要是采取戒酒和藥物治療綜合干預,但由于其臨床癥狀為非特異性,也可無癥狀,發展過程較隱匿,不易被感知,故此在確診時,肝損傷往往已較重,且患者早期用藥依從性較差,這就使ALD的早期干預成為臨床治療上的難點[5-6]。因此,針對ALD的早發現、早干預對重型肝病的防治和保障大眾健康具有十分重要的意義。

中醫藥在防治ALD方面發揮著重要作用,本研究中的保肝顆粒選用藥食同源藥材組方,能在不增加肝臟負擔的前提下,發揮保肝作用,患者接受度好、依從性高,已獲得國家發明專利(專利號:ZL 2016 1 1252370.X),具有深入研究的價值。近年來相關研究發現,中醫藥可以通過減少炎癥、降低自由基的損傷、調節免疫功能、改善肝功能等來修復受損肝細胞,起到保護肝臟的作用,應用前景廣闊[7-8]。但其研究多集中于中醫藥對ALD的治療,鮮見從早期生物標志物入手研究ALD的早期發現及預防。前期實驗研究發現,嘌呤核苷酸磷酸化酶(purine nucleotide phosphorylase, PNP)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GLDH)、精氨酸酶1(arginase 1, Arg-1)和α-谷胱甘肽-S-轉移酶(α-glutathione S-transferase, α-GST)作為早期生物標志物較ALT、AST等傳統肝功能檢測指標更加靈敏,對早期肝損傷的診斷有較高的價值[9]。因此,通過檢測ALD大鼠傳統肝功能指標、早期生物標志物、相關細胞因子以及脂質過氧化指標,動態觀察保肝顆粒對ALD早期的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠144只,SPF級,體重180～200 g,雌雄各半,購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(魯)2014-0007。河南中醫藥大學動物實驗中心許可證號:SYXK(豫)2015-0005,本實驗由河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準:DWLL16010005。

1.2 實驗藥物與試劑

保肝顆粒由茵陳30 g、梔子20 g、枸杞子30 g、五味子20 g、薏苡仁20 g、烏梅15 g、葛根30 g、大棗30 g、甘草9 g組成,由河南中醫藥大學制劑室制備;聯苯雙酯(萬邦德制藥集團有限公司,批號:A020141140);無水乙醇(天津市永大化學試劑有限公司,批號:20150724);丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)試劑盒(上海復星長征醫學科學有限公司,批號:D1507053、D1507073、D1506073、D1507013);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20160121、20160130);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、PNP、GLDH、Arg-1、α-GST ELISA試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司,批號:E20160701A、20160810)。

1.3 實驗儀器

MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司),HH-S4恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司),Cytation 3型酶標儀(美國BioTek儀器有限公司),UV-1901紫外可見分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司),BS-2000全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司),如圖1所示。

圖1 實驗儀器圖片Fig.1 Experimental instrument picture

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥

將144只Wistar大鼠于實驗室適應性喂養7 d,隨機分為空白組、模型組、聯苯雙酯組、保肝顆粒低、中、高劑量組,每組24只,雌雄各半。每日禁食不禁水6 h后,聯苯雙酯組(3.75 mg/kg,相當于臨床成人用量的10倍)按相應濃度灌胃給藥,保肝顆粒低、中、高劑量組分別給予低、中、高(17、34、68 g/kg,相當于臨床成人用量的5、10、20倍)劑量保肝顆粒混懸液灌胃,空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃,10 mL/kg。

1.4.2 造模與取材

給藥1 h后除空白組外,其余各組按10 mL/kg灌胃50%乙醇,再1 h后按前用量重復灌胃50%乙醇一次,空白組灌胃等體積蒸餾水,連續6 d。在實驗開始的第2、3、4、6天酒精灌胃3 h后分別隨機取每組大鼠6只,麻醉后腹主動脈取血;處死各組動物,解剖并剝離肝臟,取適量肝組織勻漿[10]。

1.4.3 肝功能指標檢測

腹主動脈取血,3 500 r/min離心10 min,分離血清,采用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平。

1.4.4 血清炎癥因子檢測

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TNF-α、IL-6水平,具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進行。

1.4.5 肝組織指標檢測

稱取適量肝右葉加預冷生理鹽水,組織勻漿器研磨,配制成10%的肝組織勻漿,3 500 r/min離心10 min,取上清液,采用微板法檢測肝組織勻漿中SOD水平,比色法檢測MDA水平。

1.4.6 血清早期生物標志物檢測

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平,具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進行。

實驗流程如圖2所示。

圖2 實驗設計路線圖Fig.2 Experimental design roadmap

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平在2、3、4、6 d明顯升高(P<0.05,P<0.01),且隨著時間的增加呈遞增趨勢;與模型組比較,聯苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆粒可明顯改善酒精性肝損傷大鼠的肝功水平。結果如表1所示。

表1 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平的影響Table 1 Effects of Baogan Granules on serum levels of ALT, AST, ALP and TBIL in rats with alcoholic liver injury n=6)

2.2 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-α、IL-6的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平在2、3、4、6 d均明顯升高(P<0.01),說明酒精進入體內后,造成了肝臟的損傷,致使機體釋放炎癥因子;與模型組比較,聯苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆粒可抑制機體炎癥因子的釋放,減輕炎癥反應。結果如表2所示。

表2 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-α、 IL-6水平的影響

2.3 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠肝勻漿MDA、SOD的影響

與空白組比較,模型組大鼠肝勻漿中MDA水平在2、3、4、6 d不斷升高,SOD水平明顯降低(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,聯苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠肝勻漿中MDA水平在2、4、6 d明顯降低,SOD水平在3、4、6 d明顯升高(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆粒可減少酒精性肝損傷模型大鼠肝臟脂質過氧化產物的生成,增加抗氧化活性。結果如表3所示。

表3 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠肝勻漿MDA、 SOD水平的影響

2.4 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清中PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平雖在2、3、4、6 d均升高(P<0.05,P<0.01),但在酒精灌胃后的第2天即有明顯的升高,之后有下降趨勢,說明PNP、GLDH、Arg-1、α-GST作為新型的早期生物標志物對酒精性肝損傷有較好的靈敏性;與模型組比較,聯苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠血清中PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆粒可以在酒精性肝損傷早期即起到明顯的肝臟保護作用。結果如表4所示。

表4 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平的影響

3 討論

古代中醫文獻中并沒有ALD這一病名,可將其歸為“脅痛”等范疇[11]。酒性濕熱,過量飲酒可使濕熱郁結,阻遏脾胃,使脾胃喪失其升清降濁之用,同時濕熱煎灼日久易耗傷陰液,致使肝腎陰虛;或者酒入人體,損傷肝膽,使肝疏泄功能失常,氣機逆亂[12]。因此,ALD的病位主要在脾胃肝膽,久則及腎。保肝顆粒由茵陳、梔子、枸杞子、五味子、薏苡仁、烏梅、葛根、大棗、甘草組成,方中茵陳清熱祛濕退黃為君藥;梔子清利肝膽兩經之濕熱,枸杞子補益肝腎,二者相合補瀉兼施同為臣藥;五味子、烏梅益氣生津,薏苡仁健脾、滲濕利水,葛根升舉中焦陽氣、生津,共為佐藥;甘草、大棗補益脾胃,調和諸藥,用為使藥;諸藥合用共奏清熱利濕、調和肝脾、養陰柔肝之功。現代藥理研究表明,保肝顆粒中主要藥物均有一定的保肝護肝作用,如茵陳對多種類型肝損傷具有保護作用,其肝保護機制與抗炎、抗氧化、調節膽汁酸代謝、抑制肝細胞凋亡等有關[13];梔子常用于自身免疫性疾病、肝損傷等治療,其活性成分具有調節免疫、減少炎癥因子產生和抗氧化等多種藥理作用[14];枸杞子中的化學成分具有抗氧化、保肝、調節免疫等多種藥理活性[15];五味子中的主要化學成分具有保肝降酶、減輕肝細胞脂質過氧化損傷、恢復受損肝細胞的作用[16];薏苡仁含有多種活性物質,具有抗炎、抗氧化、提高機體免疫等活性[17]。

乙醇因其主要在肝臟代謝,過量飲酒時超過肝臟代謝能力,酒精便在體內蓄積,具有肝毒性的乙醇和其代謝產物可直接損傷肝細胞及其細胞器,造成肝臟損傷[18-19]。AST、ALT一直是臨床上用于檢查肝臟疾病使用最多的指標,常用來評價肝功能的異常,當肝臟受到損傷時,細胞線粒體和胞漿內的AST、ALT進入血液,使血清中AST、ALT的活性升高[20]。同時,肝臟的損傷導致體內ALP、TBIL排泄障礙而反流入血,從而引起血清ALP、TBIL水平增高。本實驗結果顯示,模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBIL水平明顯升高,給藥后,保肝顆粒各劑量組均能不同程度的降低大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBIL水平,對改善肝功能有顯著的作用。

ALD的具體發病機制尚不完全清楚,“二次打擊”學說認為,其與氧化應激和脂質過氧化、炎癥因子的釋放、線粒體功能障礙等多種因素密切相關,而氧化應激在ALD的發生、發展過程中起著關鍵作用[21-22]。生理狀態下,機體氧化和抗氧化系統處于動態平衡狀態,過量攝入酒精,乙醇在肝臟代謝過程中產生的ROS和乙醛可降低肝臟抗氧化系統的活性,破壞肝臟的氧化還原平衡,肝臟中活性氧生成增多,而氧化產物作為氧化應激反應的誘發因素,進而對肝細胞形成“二次打擊”,引起肝細胞發生炎癥、壞死,由此引起一系列肝臟的病理損傷[23]。MDA作為生物體脂質過氧化的標志物,可引起細胞腫脹、壞死[24]。SOD是細胞內抵抗氧化應激最重要的一種酶,能很好的清除自由基,對抗氧化應激,使機體免受氧化的損傷[25]。氧化應激下ROS的增加可導致TNF-α、IL-6等促炎細胞因子的釋放,加重炎癥反應,進一步損害肝功能,加速ALD的疾病進程,引起肝臟纖維化、肝硬化,甚至肝癌的發生[26]。研究發現,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平、肝勻漿中MDA水平明顯升高,肝勻漿中SOD水平明顯降低;保肝顆粒干預后,在不同的時間段內可以不同程度的降低大鼠血清中TNF-α、IL-6水平、肝勻漿中MDA水平,升高肝勻漿中SOD水平,提示保肝顆粒可通過改善ALD模型大鼠的氧化應激損傷起到保護肝臟的作用。

酒精造成的肝臟綜合性影響不容忽視,發生肝損傷后,早期可通過及時服用相應藥物予以糾正,若未在損傷早期進行干預,持續性的肝損傷易發展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[27]。目前ALT、AST是臨床上評價肝損傷的重要指標,然而這些指標常在肝細胞發生較重的實質性損傷后才會出現明顯變化,且酒精性肝損傷患者早期一般無明顯臨床癥狀,因此能夠更早的發現病變,盡早進行干預,對于防止病情發展有著重要的意義。PNP是嘌呤補救途徑中的關鍵酶,只有當肝細胞受損時才能在血液中檢測出來;GLDH是一種細胞線粒體酶,在肝組織中分布最多,肝損傷時血液中的GLDH升高;Arg-1主要分布于肝細胞核、微粒體,是肝臟中一種重要的水解酶;α-GST 是谷胱甘肽結合反應的關鍵酶,存在于肝小葉中心細胞,其分子量小,在肝損傷早期階段就會透過細胞膜進入血液[28]。課題組前期研究發現,PNP、GLDH、Arg-1和α-GST可以作為肝損傷早期檢測生物標志物,且較傳統肝功能檢測有較強的靈敏性[9]。本實驗在前期研究的基礎上進一步發現,ALD模型組大鼠血清中PNP、GLDH、Arg-1和α-GST在肝損傷時出現較早,且變化更為明顯。

4 結論

通過動態觀察ALD大鼠血清中肝功能指標、早期生物標志物、相關細胞因子以及肝組織中脂質過氧化指標,結果表明,保肝顆粒在酒精性肝損傷早期即可起到較好的保護作用,且其可以通過減少炎性因子釋放、增強機體的抗氧化能力,從而減輕肝臟損傷,恢復肝臟功能。