經典藏藥如意珍寶片多次給藥的藥代動力學研究

侯紅平 王彩霞 彭 博 李 冰 劉榮霞 陳騰飛 李 峰 車向宜 宋 玲 高云航 楊 慶 羅 倩 葉祖光 張廣平

(1 中國中醫科學院中藥研究所,北京,100029; 2 煙臺賽普特檢測服務有限公司,煙臺,264005;3 山東煙臺大學,煙臺,264005; 4 甘肅奇正藏藥有限公司,北京,100102)

根植于高原的藏族醫藥(以下簡稱為藏醫藥)學是世界傳統醫學寶庫的重要組成部分,是世界上最古老的傳統醫藥體系之一,源于西藏,關于其文字記載始于1 300多年前。現代藏藥應用的地域除西藏自治區外,還包括青海、內蒙古、四川、云南等地所屬的一些自治區和縣。傳統藏醫藥在腦卒中、阿爾茨海默病、癲癇、血管神經性頭痛等疾病中構建了對中樞神經系統疾病的整體認識及辨證用藥規律[1-3],在現代藏醫臨床診療中具有較高的使用頻率。采用現代醫學技術方法和手段,解析經典藏醫藥的特色和優勢,不僅能夠展現其在現代醫學中的臨床價值,而且補充現代醫療的不足。

珍寶類復方是藏醫家以名貴、珍稀藏藥材進行調配組合的經典且獨特的配方形式。其中,如意珍寶片處方初見于13世紀藏醫藥學家仁青堅贊所著的《秘訣珍珠串》,收錄于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥》,也是藏醫中名貴的珍寶藥物之一,由珍珠母、紅花、人工麝香、決明子、肉豆蔻、訶子、余甘子、沉香等30味藥材組成;具有清熱醒腦、舒經通絡、活血化瘀、促進血液循環的作用,主要用于治療藏醫中的白脈病,同時能夠改善癱瘓、口眼斜、通風、關節不利等癥狀[4-5],廣泛應用于臨床。

目前,基于藏醫理論的研究基礎較為薄弱,未形成精準臨床定位并形成合理用藥規范。本研究以如意珍寶片范例,采用現代質譜技術和高效液相色譜技術的聯合分析,探討如意珍寶片多次給藥的藥代動力學特征和組織分布,尋找其藥物代謝的規律和特點,為藏醫藥的精準定位和臨床的合理用藥提供依據,對藏醫藥的發展具有重要的作用。

1 材料

1.1 動物 斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,體質量150～170 g,5～6周齡,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,SCXK(京)2016-0011。飼養于中國中醫科學院中藥研究所實驗動物屏障環境(SPF級)中,SYXK(京)2019-0003。飼養條件：屏障環境溫度20～24 ℃,相對濕度45%～65%,12 h/12 h光照與黑暗交替進行。所有實驗操作均獲得中藥研究所動物倫理委員會的許可(倫理審批號：2020B134)。

1.2 藥物 如意珍寶片(奇正藏藥股份有限公司,批號：2004007)。

1.3 試劑與儀器 沉香四醇(成都普思生物科技股份有限公司,批號：PU0295-0025,純度99.7%),胡椒堿(大連美侖生物技術有限公司,批號：A0528AS,純度99.0%),異甘草素(上海麥克林生化科技有限公司,批號：C10987045,純度99.2%),阿魏酸(上海麥克林生化科技有限公司,批號：C11347527,純度99.2%),伏立諾他(上海麥克林生化科技有限公司,批號：C11120592,純度98.7%)等。超高效液相色譜系統(Waters公司,美國,型號：ACQUITY UPLC H-CLASS),質譜系統(SCIEX公司,美國,型號：6500+),分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,瑞士,型號：METTLER TOLEDO XPE205),離心機(艾本德股份公司,德國,型號：5427R),渦旋混合儀(IKA公司,德國,型號：VORTEX2)。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18,2.1×100 mm I.D.,1.7 μm粒徑。預柱：ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-column,130 ?,1.7 μm,2.1 mm×5 mm。流動相A(Mobile PhaseA：MPA)：5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)。流動相B(Mobile PhaseB：MPB)：甲醇。柱溫箱溫度(Column Temperature)：40 ℃。流速(Flow Rate)：0.300 mL/min。自動進樣器溫度：4 ℃。進樣體積(Injection Volume)：5.00 μL[6]。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子化(Electrospray Ionization,ESI)。離子化模式(Ionization Mode)：正/負(Positive/Negative)離子模式。監測模式(Mode)：多反應監測(MRM)。電噴霧電壓(Ion Spray Voltage)：5 500 V/-4 500 V。離子噴霧溫度(Ion Spray Temp)：450 ℃。氣簾氣種類(Curtain Gas Type)：氮氣設置(Nitrogen Setting),35.0 psi。霧化氣種類(Nebulizing Gas,Gas1)：Nitrogen Setting,50.0 psi。輔助氣種類(Auxiliary Gas,Gas 2)：Nitrogen Setting,50.0 psi。數據采集時間(Acquisition Time)：10.0 min[6]。

表1 不同分析物的分析條件

2.2 標準曲線制備 取空白大鼠血漿45.0 μL于2.0 mL離心管中,加入標準系列溶液或質控溶液5.00 μL,渦旋10 s混合均勻,使血漿中的胡椒堿和異甘草素濃度分別相當于0.100、0.500、1.00、4.00、10.0、40.0、100、200 ng/mL,沉香四醇、阿魏酸濃度相當于0.500、2.50、5.00、20.0、50.0、200、500、1 000 ng/mL或異甘草素、胡椒堿濃度相當于0.300、1.50、15.0、150 ng/mL;沉香四醇、阿魏酸濃度相當于1.50、7.50、75.0、750 ng/mL,按上述操作,經高效液相色譜-串聯質譜(High Performance Liquid Chromatography-tandem mass Spectrometry,HPLC-MS/MS)分析。

2.3 線性關系考察 按照上述方法制備校正標樣。

2.4 精密度試驗 按照上述方法配制高濃度質控樣品(High-concentration Quality Control,HQC)、中濃度質控樣品(Middle-concentration Quality Control,MQC)、低濃度質控樣品(Low-concentration Quality Control,LQC)及定量下限(Lower Limit of Quantitative,LLOQ)4個濃度的血漿樣品,進行準確度和精密度實驗(n=6)。批間精密度實驗時,3 d內進行上述實驗3批次,計算n=18的精密度。

2.5 穩定性試驗 考察大鼠血漿樣品室溫放置6 h、樣品經處理后自動進樣器放置24 h、3次冷凍-解凍循環(-80 ℃,12 h)、在-80 ℃下4個月后待測物的穩定性以及對照品儲備液2～8 ℃ 2個月內穩定性。

2.6 血漿樣品處理 取大鼠血漿樣品50.0 μL于2.0 mL離心管中,加入含有內標的甲醇溶液(80.0 ng/mL)150 μL,渦旋1 min,離心15 min(12 700 r/min,4 ℃,離心半徑：20 cm),取上清100 μL于2.0 mL離心管中,加水50.0 μL稀釋,渦旋1 min,取上清100 μL于進樣小瓶中,經LC-MS/MS分析。

2.7 給藥方法與血樣采集 SD大鼠12只,雌雄各半,按體質量隨機分層方法,分為2組,對照組和觀察組(最大給藥劑量,6.00 g/kg),連續給藥7 d,在最后一次給藥前0 min及給藥開始后0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、24、48 h眼眶采血,肝素抗凝,4 ℃,10 000 r/mim(離心半徑：20 cm)離心2 min,分裝血漿,-80 ℃凍存。

2.8 數據處理及分析 數據-圖譜積分方法：分析物和內標的色譜圖采集由軟件Analyst 1.6.3完成,色譜峰積分由分析軟件MultiQuant 3.0.3(AB Sciex)進行處理,在優化積分參數后,對目標色譜峰自動積分,不允許對色譜峰進行單獨積分或手動積分。分析物濃度計算：由分析軟件MultiQuant 3.0.3完成積分后,采用加權(W=1/x2)最小二乘法以血漿中分析物濃度(X)與峰面積比(Y)進行線性回歸,所得的回歸方程(Y=a+bX)即為標準曲線。根據分析批的標準曲線計算大鼠血漿中分析物的濃度,單位為ng/mL。應用Phoenix WinNonlin(版本8.1.0.3530)的非房室模型模塊進行藥代參數計算[7]。統計分析基于主要藥動學參數(Cmax和AUC0-t)對數轉換后服從正態分布假設,對轉換后的參數采用LEVENE檢驗進行方差齊性檢驗,當方差齊性(P>0.05),性別差異采用Student-t檢驗,劑量差異采用單因素方差分析,當方差不齊性(P≤0.05),性別差異采用Mann-WhitneyU檢驗(M-W法),劑量差異采用Kruskal-WallisH秩和檢驗進行統計分析,對于不服從正態分布的其他藥動學參數,性別差異采用Mann-WhitneyU檢驗(M-W法),劑量差異采用Kruskal-WallisH秩和檢驗進行統計分析。

3 結果

3.1 方法學評價

3.1.1 線性關系考察 胡椒堿和異甘草素在0.100～200 ng/mL范圍內線性關系良好(R2≥0.997),沉香四醇在0.500～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好(R2≥0.999),阿魏酸在2.50～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好(R2≥0.998)。至少75%的校正標樣(含最少6個有效濃度)的回算濃度在標示值的±13%以內,定量下限在±4%以內,方法靈敏度高、線性范圍寬,結果符合生物分析相關要求[6]。

3.1.2 精密度 分析結果表明方法準確度高、精密度好,結果符合生物分析相關要求[6]。

3.1.3 穩定性 樣品室溫6 h內穩定,樣品經處理后在自動進樣器放置24 h穩定,樣品3次凍融循環穩定,樣品-80 ℃ 4個月內穩定,對照品儲備液2～8 ℃ 2個月內穩定。

3.2 藥代動力學

3.2.1 4種成分的藥時曲線 大鼠連續7天灌胃給予如意珍寶片6.00 g/kg的體內血漿中沉香四醇、異甘草素、胡椒堿、阿魏酸的平均藥時曲線。見圖1。

圖1 4種成分的藥時曲線

3.2.2 性別導致體內藥代動力學參數的差異比較 經統計分析,結果表明性別差異不會對沉香四醇、異甘草素和胡椒堿的藥動學參數產生影響(P>0.05)。而性別差異會對阿魏酸的Cmax、AUC0-t產生影響(P<0.01或P<0.001),不會對Tmax產生影響(P>0.05)。見表2。

表2 性別導致體內藥代動力學參數的差異比較

4 討論

如意珍寶丸,又名“桑培奴布日布”,是藏醫名貴珍寶藥物之一,由珍珠母、沉香、金礞石、紅花等30味藏藥材組成,具有清熱、醒腦開竅、舒筋活絡等功效,主要用于治療溫熱病、陳舊熱證、白脈病、偏癱、口眼斜等病癥[8-10]。現代藥理研究表明,如意珍寶片能顯著提高血管性癡呆模型大鼠腦內單胺類神經遞質水平[11],可顯著改變硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠腦電圖的異常頻段波,對偏頭痛的治療效果較好[12-13],同時可明顯降低急性血瘀模型大鼠血液中切變率黏度值、血漿黏度值、紅細胞聚集指數等[14]。

本研究根據如意珍寶片的藥材組成及前期進行的入血成分研究,選取來自于如意珍寶片的藥材中可能的活性成分[15-16],選取了沉香中的沉香四醇(C17H18O6),蓽茇中的胡椒堿(C17H19NO3)、降香中的異甘草素(C15H12O4)和甘草膏中的阿魏酸(C10H10O4)作為目標化合物,建立了4種化合物在血漿和組織中的含量檢測方法。

大鼠給予7 d連續灌胃如意珍寶片后,血漿中沉香四醇達峰時間大部分在1～8 h之間。阿魏酸血藥濃度在給藥間隔時間內在體內血藥濃度呈波動狀態,推測主要的原因是食源性影響,大鼠在給藥同時食用可能含有阿魏酸的谷物飼料,導致阿魏酸在體內血藥濃度呈波動狀態[17-20]。經t檢驗和秩和檢驗分析,沉香四醇、異甘草素和胡椒堿在大鼠體內主要藥動學參數差異無統計學意義(P>0.05),阿魏酸在大鼠體內主要藥動學參數(Cmax、AUC0-t)差異有統計學意義(P<0.01)。

本研究通過前期方法學的建立和驗證,對經典藏藥如意珍寶片的多次藥代動力學特征進行了解析,為藏藥藥代動力學方法的探索和建立提供了示范,不但對臨床應用有一定的指導作用,同時加快對藏藥理論和藥物的研究歷程,具有重要的價值和意義。

利益沖突聲明：無。