山藥多糖延緩秀麗隱桿線蟲衰老的藥效評價及作用機制研究

劉澤坤 賀小芳 洪 穎 盛麗莉 李后開

(上海中醫藥大學中藥學院,上海,201203)

衰老是隨著時間進行的整體功能的退行性變化,具有累積性、普遍性、漸進性的特點。在衰老過程中,機體功能和代謝會發生衰退,與人類疾病息息相關。衰老是大多數慢性疾病,包括心腦血管疾病、骨質疏松癥、癌癥及神經退行性疾病等的主要危險因素[1-4]。由于衰老是一個極其復雜的全面性變化,涉及多器官多系統,并且存在個體差異和臟器特異性[5],已成為當今社會嚴峻的醫學問題。隨著人口老齡化的進一步加劇,衰老相關疾病涌現為社會以及經濟發展帶來了很大負擔。因此,減緩衰老或者促進“健康老齡化”成為當今社會亟待解決的問題。

中醫藥歷史源遠流長,中藥在抗衰老方面也積累了大量實踐經驗,其所應用的抗衰老方劑以及用藥規律也為我們現代抗衰老中藥的藥理研究奠定了基礎。衰老常表現為脾腎不足、氣血虧虛、陰陽虛損等身體虛虧的現象,在《醫門法律》也有云：“老衰久病,補益為先?！鄙剿幾鳛榫哂写硇缘难a氣類藥食同源中藥,其性溫味甘,歸脾、胃、肺經,具有補脾養胃,生津益肺,補腎澀精的功效[6],在《神農本草經》上就記載其具有“補虛贏,益氣力,久服耳目聰明,輕身延年”的作用。現代藥理學研究表明,山藥具有多種活性成分,而多糖是其主要的活性成分。目前已有研究表明山藥多糖(Chinese Yam Polysaccharides,CYP)具有抗氧化[7]、降血脂[8]、抗腫瘤[9]、調節免疫[10-11]等多種藥理活性。然而山藥多糖延緩自然衰老的藥理活性尚無研究報道。

秀麗隱桿線蟲因其蟲體小、世代和生命周期較短、基因組完全測序以及與人類基因的同源性高等優點,已逐漸成為衰老和藥物篩選研究的中的重要動物模型[12-14]。因此,本研究將基于秀麗隱桿線蟲模型對山藥多糖的抗衰老藥理活性及其作用機制進行探究,為中藥抗衰老藥理作用機制研究提供思路和示范。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株及菌株 野生型秀麗隱桿線蟲N2(CaenorhabditiselegansBristol N2)批號：3190712、大腸桿菌OP50(E.coli)批號：29021,購自福建上源生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 山藥多糖(上海源葉生物有限公司,批號：S24912)。

1.1.3 試劑與儀器 瓊脂粉(OXOID公司,英國,批號：LP0011);蛋白胨(BBI公司,以色列,批號：A100636-0100);氫氧化鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、無水氯化鈣(分析純)、七水合硫酸鎂(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)、磷酸氫二鉀(分析純)、膽固醇(分析純)(國藥集團化學試劑有限公司,批號分別為：10019718、10019318、10005861、10013018、10017618、20032118、69008214);總超氧化物歧化酶測定試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為A001-3-2、A007-1-1);2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)(SIGMA公司,德國,批號：D6683);瓊脂糖(Amresco公司,美國,批號：N605)生化培養箱(上海一恒科學儀器有限公司,型號：LRH-70);酶標儀(瑞士TECAN,瑞士,型號：SPARK 10M);磁力攪拌儀(上海思樂儀器,型號：S10-2);體視顯微鏡(麥克迪奧科技有限公司,型號：SMZ171TLED);恒溫搖床(HASUC,型號：HS-200B);低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國,型號：5810R);倒置熒光顯微鏡系統(Leica,德國,型號：DMi8 M/C/A)。

1.2 方法

1.2.1 培養基及相關溶液配制 1)NGM培養基配制：蛋白胨(Peptone)2 g,瓊脂16 g,氯化鈉2.4 g,置于潔凈1 000 mL燒瓶,加入1 mol/L磷酸緩沖液20 mL,蒸餾水定容至800 mL,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,之后置于55 ℃水浴鍋中冷卻,加入5 mg/mL膽固醇0.8 mL,高壓滅菌的1 mol/L MgSO4,1 mol/L CaCl2各0.8 mL,搖勻即得到完全培養基。2)M9緩沖液：3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl,0.25 g MgSO4·7H2O,溶于1 000 mL雙重去離子水(Double Distilled Water,dd H2O)中,121 ℃,30 min高壓蒸汽滅菌。3)1 mol/L磷酸緩沖液：稱取108.3 g KH2PO4和35.6 g K2HPO4溶于1 000 mL蒸餾水中,調節pH值到6.0即可。

1.2.2 NGM平板制備 制備菌液：使用接種環沾取OP50菌液在無抗LB平板上劃單菌落,37 ℃培養12 h,取出含OP50的單菌落平板,用無菌槍尖挑取一個單菌落到50 mL LB培養基中,于37 ℃搖床12 h振蕩培養。含OP50菌液及藥物NGM平板制作：1)在超凈工作臺內取2 mL制備好的菌液,15 000×g,離心2 min,棄去上清。2)沉淀用160 μL dd H2O復溶,用移液槍吸取40 μL菌液加于空白的NGM平板的中央,輕輕將菌液均勻涂布成菌斑。將布好菌液的NGM平板置于封閉的超清工作臺下晾干,紫外照射1 h滅菌。3)含CYP培養平板制作：藥液使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,用移液槍吸取40 μL制備好的藥液,均勻涂布于空白的NGM平板上,覆蓋住菌液。

1.2.3 線蟲培養及線蟲同期化 線蟲的培養：利用挑蟲針挑取線蟲至含大腸桿菌的NGM平板,于20 ℃培養箱恒溫培養,NGM中涂有0.2 mL OP50作為線蟲的食物。線蟲的同期化：1)在超凈工作臺內使用無菌M9緩沖液沖洗NGM平板若干次,洗下線蟲和蟲卵;2)將裂解液按與蟲液2∶1的比例加入裝有線蟲的離心管;3)渦旋至蟲體裂解,時間不超過5 min;4)將試管在臺式離心機中以1 300×g,離心半徑：10 cm,20 ℃離心2 min,以沉淀蟲卵;5)棄去上清至0.1 mL后,添加無菌水至5 mL,搖勻,重復步驟4)和5),使用移液槍將剩余0.1 mL液體中的蟲卵轉移到接種有大腸桿菌OP50菌苔的干凈NGM平板邊緣,20 ℃培養孵化48 h,獲得L4期線蟲。

1.2.4 藥物干預 CYP給藥劑量為0.05、0.1、0.2 mg/mL,對照組使用dd H2O作為溶劑對照。

1.2.5 檢測指標與方法

1.2.5.1 壽命觀察 按照步驟1.2.2中方法,將L4期線蟲挑至含有藥物以及OP50的NGM平板上,進行給藥處理,從給藥當天,線蟲年齡標記為0 d。實驗過程中每隔2 d將給藥線蟲挑至新平板上,避免子代的干擾。每天觀察線蟲的狀態,記錄存活、死亡數量,觀察線蟲生長狀態,線蟲死亡判定標準為經觸碰后不彎曲身體或頭部不擺動,身體僵直。記錄線蟲的死亡數目,并制作生長曲線。

1.2.5.2 咽泵頻率和身體活動觀察 按照步驟1.2.2中方法,將同期化線蟲在20 ℃恒溫條件下培養至L4期,實驗過程中每隔2 d將給藥線蟲挑至新平板上,避免子代的干擾。在給藥處理的第0、3、6、9、12天,在顯微鏡下記錄30 s內單條線蟲吞咽次數和身體彎曲次數。

1.2.5.3 脂褐素熒光觀察 將同期化線蟲在20 ℃恒溫條件下培養至L4期,將L4期線蟲挑至含有CYP以及OP50的NGM平板上,CYP給藥劑量為0.05、0.1、0.2 mg/mL,對照組使用dd H2O作為溶劑對照,給藥5 d,中間每隔2 d,將給藥線蟲挑至新平板上,避免子代的干擾;在給藥5 d后,將給藥線蟲移至含有M9緩沖液的離心管中;將裝有線蟲的離心管離心,100×g,離心2 min,以沉淀線蟲。棄去上清后,添加2 mmol/L鹽酸左旋咪唑麻醉;麻醉后,將線蟲置于2%瓊脂糖平板上。用熒光顯微鏡分別在明場和暗場觀察其形態,然后拍照;使用ImageJ統計熒光強度,并使用Graphpad Pism 8進行統計分析。

1.2.5.4 熱應激實驗 將同期化線蟲在20 ℃恒溫條件下培養至L4期,將L4期線蟲挑至含有CYP以及OP50的NGM平板上,CYP給藥劑量為0.05、0.1、0.2 mg/mL,對照組使用dd H2O作為溶劑對照,給藥3 d,中間每隔2 d,將給藥線蟲挑至新平板上,避免子代的干擾;在給藥3 d后,將給藥線蟲移至不含藥的NGM平板中,在35 ℃下孵育,每2 h計數1次,統計線蟲的存活率,直至全部僵直死亡。

1.2.5.5 氧化應激實驗 將同期化線蟲在20 ℃恒溫條件下培養至L4期,將L4期線蟲挑至含有CYP以及OP50的NGM平板上,CYP給藥劑量為0.05、0.1、0.2 mg/mL,對照組使用dd H2O作為溶劑對照,給藥5 d,中間每隔2 d,將給藥線蟲挑至新平板上,避免子代的干擾;在給藥5 d后,將給藥線蟲移至不含藥的NGM平板中,在H2O2下培養,每天記錄線蟲的存活和死亡只數1次,統計線蟲的存活率,直至全部死亡。

1.2.5.6 活性氧熒光檢測 將同期化線蟲在20 ℃恒溫條件下培養至L4期。給藥處理：將L4期線蟲挑至含有CYP以及OP50的NGM平板上,CYP給藥劑量為0.05、0.1、0.2 mg/mL,空白對照組使用dd H2O作為溶劑對照,給藥6 d,中間每隔2 d,將給藥線蟲挑至新平板上,避免子代的干擾;在給藥第0、3、6天時,將線蟲移至含有50 μL的H2DCFDA的M9緩沖液中,在20 ℃黑暗環境中孵育30 min;棄去上清后,添加2 mmol/L鹽酸左旋咪唑麻醉,后將活蟲置于2%瓊脂糖載玻片上。用熒光顯微鏡分別在明場和暗場觀察其形態以及ROS水平,然后拍照;使用ImageJ統計熒光強度,并使用Graphpad Pism 8進行統計分析。

1.2.5.7 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)以及過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性檢測 將同期化的線蟲卵進行給藥處理：將裂解的線蟲卵添加至含有CYP以及OP50的NGM平板上,CYP給藥劑量為0.05、0.1、0.2 mg/mL,對照組使用dd H2O作為溶劑對照,每組線蟲在2 000條左右,給藥48 h;使用無菌生理鹽水沖洗NGM平板若干次,洗下線蟲至離心管中;將試管在離心機中離心,100×g,離心半徑：10 cm,20 ℃離心2 min,以沉淀線蟲,棄去上清;使用無菌生理鹽水以100×g,20 ℃離心2 min洗滌線蟲,重復2～3次;后續實驗操作根據生化試劑盒說明書進行。

1.2.6 轉錄組測序

1.2.6.1 RNA提取與測序 同期化處理的線蟲培養48 h后,Trizol法提取空白組和0.2 mg/Ml CYP組線蟲組織總RNA,并使用DNase I去除基因組DNA。采用2100 Bioanalyser(Agilent)檢測RNA樣品的質量。(每組3個樣本,每個樣本的RNA來源于500只以上的線蟲)。

1.2.6.2 測序數據處理與分析 文庫使用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測序平臺進行高通量測序,對原始測序數據進行過濾,得到高質量的測序數據(Clean Data)以保證后續分析的順利進行,使用HiSat2(http：//ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)將Clean Data(Reads)與參考基因組進行比對,獲得用于后續轉錄本組裝、表達量計算等的Mapped Data(Reads),同時從測序飽和度、基因覆蓋度、Reads在參考基因組不同區域分布及Reads在不同染色體分布對該次轉錄本測序的比對結果進行質量評估。通過定位到基因組區域的序列(Clean Reads)的數量(Reads Counts)來計算基因的表達水平。使用軟件RSEM(http：//deweylab.github.io/RSEM/)分別對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析。

1.2.6.3 差異基因的篩選 使用DESeq2(Bioconductor-DESeq2),根據比對到基因的Read Count數據進行差異表達計算,篩選標準為：FDR<0.01&|log2FC|≥3。

1.2.6.4 差異基因京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 使用KOBAS(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/)進行KEGG PATHWAY富集分析,使用Fisher精確檢驗進行計算。為控制計算假陽性率,采用BH(FDR)方法進行多重檢驗,經過校正的P值(CorrectedP-Value)以0.05為閾值,滿足此條件的KEGG通路定義為在差異表達基因中顯著富集的KEGG通路。

2 結果

2.1 CYP對線蟲壽命、咽泵頻率及身體活動頻率的影響 實驗結果顯示,不同濃度的CYP均可以延長線蟲壽命,對照組、0.05、0.1、0.2 mg/mL CYP的線蟲的最終死亡時間分別是19、20、23、23天,其中0.1、0.2 mg/mL CYP作用更為顯著(圖1A)。在實驗終點時,0.1、0.2 mg/mL的CYP顯著增加線蟲咽泵頻率(圖1B,P<0.05)。0.2 mg/mL CYP顯著增加線蟲身體活動頻率(圖1C,P<0.05)。因此,CYP具有延長線蟲壽命,增加咽泵頻率和身體活動頻率的作用。

圖1 CYP對線蟲壽命、咽泵頻率及身體活動的影響

2.2 CYP對線蟲脂褐素積累的影響 線蟲的脂褐素是一種自發熒光色素,作為線蟲衰老的指示劑,是檢測藥物對于線蟲是否抗衰老作用的重要指標之一。脂褐素熒光積累分析發現,對照組脂褐素熒光強度明顯高于CYP組。不同濃度的CYP均可以降低線蟲衰老過程中的脂褐素積累,其中,低、中濃度CYP差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 CYP對線蟲衰老過程中脂褐素積累的影響

2.3 CYP對線蟲抗壓能力的影響 本研究采取了耐熱性實驗以及急性氧化應激實驗2個抗壓性實驗來探究CYP對線蟲抗壓能力的影響。實驗結果如圖3A所示,0.05、0.1、0.2 mg/mL CYP均增加線蟲在35 ℃下的耐熱性(P<0.05),其中0.1 mg/mL CYP改善效果更為明顯。不同濃度CYP均顯著增加了線蟲在強氧化環境下的壽命,并且呈現劑量依賴性。

圖3 CYP對線蟲抗壓性的影響

2.4 CYP對線蟲抗氧化能力的影響 利用活性氧探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)來檢測在線蟲衰老過程中活性氧。在熒光顯微鏡下觀察對照組以及CYP組線蟲的活性氧熒光強度積累情況,結果如圖4A所示,相比于第3天時,對照組在第6天時的活性氧熒光顯著增強,而0.05、0.1、0.2 mg/mL CYP均顯著減少了活性氧熒光其強度。因此,CYP可以降低線蟲衰老過程中的活性氧積累,提高線蟲的抗氧化能力。抗氧化酶活性實驗結果如圖4B所示,0.1、0.2 mg/mL CYP顯著增加了線蟲衰老過程中的SOD活性(P<0.05);不同濃度CYP均顯著提高衰老過程中CAT酶活性(P<0.05)。

圖4 CYP對線蟲活抗氧化能力的影響

2.5 轉錄組測序結果

2.5.1 原始序列質量控制 對照組(Con)和0.2 mg/mL CYP組樣本的總RNA量為(98.90±32.33)μg/μL和(296.90±48.87)μg/μL。原始測序序列統計結果如表1所示。

表1 測序數據統計

2.5.2 差異基因篩選 本次測序檢測到Con組和CYP組的共有基因12 713個,Con組特有基因2 509個,CYP組特有基因587個。主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)顯示,Con和CYP組在PC1層面呈現顯著明顯分離(貢獻度84.20%)。見圖5A。結果顯示共有5 513個差異表達基因,其中3 584個基因表達被CYP干預下調,1 929個基因表達被CYP干預上調。見圖5 B。

圖5 對照組(Con)和0.2 mg/mL CYP組的差異基因表達基因的PCA分析(A)及火山圖(B)

2.5.3 差異表達基因的KEGG分析 在Level 1水平的生物體系統(Organismal Systems)相關通路中,差異基因主要被聚類到內分泌系統(Endocrine System)、免疫系統(Immune System)、神經系統(Nervous System)和衰老(Aging)等;在代謝(Metabolism)相關通路中差異基因主要被聚類到脂代謝(Lipid Metabolism),碳水化合物代謝(Carbohydrate Metabolism)和氨基酸代謝(Amino acid Metabolism);在細胞過程(Cellular Processes)相關通路中,差異基因主要被聚類到細胞的生長和死亡(Cell Growth and Death)相關通路;在遺傳信息加工(Genetic Information Processing)相關通路中,差異基因主要被聚類到遺傳信息的轉錄(Transcription)相關通路。見圖6。

圖6 對照組與CYP組的差異基因表達基因KEGG富集分析

2.5.4 衰老相關差異表達基因分析 KEGG功能分析中出現衰老(Aging)通路的富集,包含30個差異表達基因,其中20個基因在CYP干預后顯著下調,10個基因顯著上調。見圖7A。與衰老相關的差異表達基因集的KEGG功能富集分析的TOP20如圖7B所示,其中前10條通路分別是：Longevity regulating pathway-worm,Longevity regulating pathway-multiple species,Chemical carcinogenesis-reactive oxygen species,Pathways in cancer,Fluid shear stress and atherosclerosis,Longevity regulating pathway,Autophagy-animal,Hepatocellular carcinoma,FOXO signaling pathway和Insulin signaling pathway。其中,衰老差異表達基因顯著富集于自噬、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)及胰島素信號通路。

圖7 對照組和0.2 mg/mL CYP組的與衰老相關的差異基因熱譜圖(A)和KEGG富集分析(B)

3 討論

模型是疾病研究及藥物篩選最重要的基礎。在衰老研究中,常用的衰老模型分為自發性衰老動物模型和誘發性衰老動物模型,相較誘發性衰老動物模型,自然衰老動物模型是現在最接近人類衰老特點的動物模型。秀麗隱桿線蟲因其生命周期短、基因序列清楚、成本低廉等特點,是近年來常被應用于衰老及其相關疾病研究優良自然模型[15]。

我們采用壽命、咽泵頻率和身體活動情況這3個線蟲衰老研究中的經典指標考察CYP對線蟲壽命及健康狀況的直接影響,發現CYP可以延長線蟲壽命并提高線蟲衰老過程中下降的咽泵頻率和身體活動頻率。脂褐素又稱老年素,是溶酶體作用后剩下不再能被消化的物質而形成的殘余體,其積累隨生物體年齡增長而增多,是衰老的重要指征之一[16-18],我們發現CYP可以降低線蟲衰老過程中的脂褐素積累?？箟盒允窃u價衰老過程中線蟲對于外界刺激的承受能力的重要指標,包括耐高溫及抗急性氧化應激等[19],我們的結果表明在高溫壓力及強氧化應激條件下,CYP能夠保護線蟲抗熱激損傷并提高抗氧化應激能力。在衰老的自由基理論中,隨著時間的推移,細胞產生自由基未被及時清除,會造成細胞損傷,進而引發衰老乃至死亡[20-22]?；钚匝?Reactive Oxygen Species,ROS)作為氧來源的自由基也是指征線蟲衰老的重要指標,我們的實驗表明CYP能夠降低線蟲衰老過程中活性氧積累。SOD以及CAT是清除體內的活性氧,限制活性氧引起的細胞損傷的關鍵抗氧化劑[23-26]。我們的檢測結果發現CYP可以提高機體內的抗氧化酶活性,與前期活性氧熒光檢測實驗結果一致,表明CYP具有抗衰老藥理活性。已有文獻表明,CYP可以提高D-半乳糖誘導衰老小鼠模型以及黑腹果蠅的SOD以及CAT活性[27-28],我們的實驗結果與其類似。

胰島素/IGF-1信號通路(IIS)是研究最多的長壽通路之一,在線蟲生長發育、代謝、行為、壽命方面起到重要的調控作用,也是第一個被報道影響線蟲衰老的信號通路。多個研究發現,胰島素信號通路是調控線蟲壽命的重要通路[29-32]。mTOR信號通路和自噬通路也是線蟲延長壽命并改善的健康壽命的有效通路之一,與線蟲的生長和生殖息息相關[33-34]。我們通過RNA-seq檢測技術分析了CYP組和對照組的差異基因表達,研究發現sip-1、daf-18、gst-26、hsp-60等基因顯著上調,sip-1是編碼線蟲小熱休克蛋白的基因,受胰島素/IGF-1信號轉導(IIS)通路調節,它的表達能夠提高線蟲的耐熱性并在胚胎發育以及成年壽命的調節中起正向作用;而daf-18參與線蟲發育的多個過程,包括確定成年壽命,對dauer幼蟲發育的積極調節;hsp-60也參與多個線蟲生理過程,包括線粒體未折疊蛋白反應和線蟲幼蟲發育。當線蟲去hsp-60活性時,會在胚胎和幼蟲發育的早期階段停滯;gst-26則參與谷胱甘肽代謝過程,是編碼抗氧化系統中谷胱甘肽S-轉移酶亞群的重要基因,與線蟲的抗氧化能力息息相關。對于差異基因,并進行了通路富集分析,發現與線蟲衰老相關的差異基因顯著富集于胰島素通路、mTOR信號通路和自噬通路。這說明CYP可以通過調控衰老相關基因表達發揮延緩衰老作用,可能與多個通路的協同作用有關,具體調控機制有待進一步驗證。

利益沖突聲明：作者聲明沒有經濟利益沖突。