中藥調控氧化應激治療男性不育癥實驗研究進展

田朝暉 鄧潤培 曾明月 劉 嘉 楊 超 陶方澤 夏 偉 余琪偉 曾慶琪

(1 恩施土家族苗族自治州中心醫院,恩施,445000; 2 南京中醫藥大學,南京,210029; 3 南京大學,南京,211102; 4 江蘇衛生健康職業學院,南京,210029; 5 南京市中醫院,南京,210029; 6 南京市江寧醫院,南京,210029; 7 昆山市中醫醫院,昆山,215300)

不孕不育的發病率高達到15%,其中男性不育癥(Male Infertility,MI)約占50%[1]。MI不是一種獨立疾病,而是由某一種或多種疾病和因素造成的結果,世界衛生組織將MI的影響因素分為17類[2],可見MI的發病機制十分復雜。研究發現,氧化應激(Oxidative Stress,OS)是造成MI的重要原因之一[3]。生理狀態下,正常水平的活性氧(Reactive Oxygens Pecies,ROS)對精子的活力、精子獲能以及頂體反應發揮積極作用,病理狀態下過量的ROS導致OS發生,對男性生育造成不利影響?？寡趸瘎┳鳛橐环N潛在的治療方案,在改善精液質量方面發揮著重要作用[4]。近年來,廣大學者十分關注中藥抗氧化研究,報道了許多中藥調控OS治療MI的實驗研究。本文對OS與MI的關系,以及單味中藥調控OS治療MI進行綜述,以期為中醫藥治療MI提供一定的理論依據。

1 OS與MI的關系

1.1 對精子發生的影響

精子發生場所是睪丸,是一個高度復雜的細胞分裂分化過程,需要經歷精原細胞增殖分化、精母細胞減數分裂和精子形成3個階段。精子發生與睪丸間質細胞和支持細胞關系密切,并受到下丘腦-垂體-睪丸軸的調控。過量ROS主要通過以下途徑對精子生成造成影響。見圖1。

圖1 OS對精子生成的影響

1.1.1 對睪丸生精細胞的影響 OS是指機體遭受各種有害刺激時產生過多ROS自由基無法及時清除,導致氧化系統和抗氧化系統平衡失調,引起組織或細胞功能紊亂和損傷的一種狀態[5]。生理狀態下細胞凋亡是為了維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主有序地死亡。當OS時,過量ROS使細胞內酶失活而導致細胞凋亡,線粒體是介導細胞凋亡最重要的細胞器,過量ROS可損傷線粒體膜,釋放細胞色素C,由此激發半胱氨酸蛋白酶的級聯反應,觸發了細胞凋亡。研究表明,多種因素可以造成睪丸OS損傷,引起生精細胞凋亡增加,影響精子產生和成熟[6]。

1.1.2 對睪丸間質細胞的影響 睪酮是精子發生的必要條件,間質細胞是合成睪酮的主要細胞。OS可造成線粒體損傷,而線粒體膜上含有睪酮等甾體激素合成的關鍵酶,線粒體膜結構損傷及膜電位降低可誘導間質細胞凋亡,使睪丸內睪酮濃度降低,而睪酮濃度的降低,又加劇線粒體膜結構和功能損傷,形成正反饋效應,產生更多ROS及更強的OS[6-7]。

1.1.3 對睪丸支持細胞的影響 支持細胞形成血生精小管屏障為生精細胞分化和發育提供微環境,為各級精子細胞提供營養、保護和支持,支持細胞還可以合成并分泌雄激素結合蛋白,并與睪酮、脫氫睪酮具有較強結合力,使生精小管內睪酮濃度增加,為精子發生創造條件。各種病因導致的睪丸OS增強均可損傷支持細胞結構和功能,破壞血生精小管屏障,增加細胞凋亡,影響精子發生[7]。

1.1.4 對睪酮合成的影響 精子發生的復雜生理過程需要睪丸內環境中高濃度睪酮,睪酮主要源于睪丸間質細胞合成,受下丘腦-垂體-睪丸軸負反饋調節。OS導致線粒體受損,線粒體內呼吸鏈電子轉移率降低,可能誘導間質細胞凋亡,加重睪酮缺乏。睪酮水平降低,可伴隨抗氧化能力降低。OS損傷加重又可抑制睪酮合成過程中關鍵酶的活性,引起睪酮水平下降。出現OS損傷加重-睪酮水平降低-睪丸抗氧化能力減弱-OS損傷加重的惡性循環,從而影響睪酮合成,造成精子發生障礙。

1.2 對精子質量的影響

OS對精子質量影響很大,因為精子缺乏胞質抗氧化酶系統而不能對過量ROS造成的損傷及時修復,導致精子極容易受到氧化損傷[8]。過量ROS主要通過以下途徑對精子質量造成影響。

1.2.1 對精子膜的損傷 精子膜表面含有大量高濃度多聚不飽和脂肪酸和雙鍵結構,ROS攻擊精子膜表面多聚不飽和脂肪酸發生過氧化反應,脂肪酸失去雙鍵,導致精子膜結構受到損傷,缺陷精子數量增加,精子活力減弱,精子獲能和頂體受到影響,導致MI[9]。過氧化反應產生的丙二醛(Malonaldehyde,MDA)對精子細胞具有毒性作用,使精子膜通透性增加,完整性受損,胞內調控精子運動能力減弱,導致精子活力下降甚至變為不動精子,因此MDA可反映精子膜的脂類過氧化程度[10]。

1.2.2 對精子DNA的損傷 脫氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)是遺傳物質的傳遞者,當DNA受損后精子質量受到極大影響。過量ROS會損傷精子核DNA的完整性。DNA核酸含有親核基團,ROS能與其堿基反應使DNA鏈聚集,改變DNA正常結構,其單鏈或雙鏈斷裂,DNA片段化產生,造成遺傳信息改變或缺失[11]。ROS還可通過脂質過氧化作用引起超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)表達變化,從而影響DNA合成,升高DNA碎片化指數(DNA Fragmentation Index,DFI)。DNA受損后產生畸形精子,而畸形的精子又導致更多ROS,從而形成惡性循環,使精子畸形率升高,導致MI[12]。

1.2.3 對精子線粒體的損傷 線粒體是為精子細胞提供能量的場所,其通過糖酵解和氧化磷酸化產生三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)為精子細胞活動供應能量。線粒體的結構和功能受到破壞,直接影響精子活力。OS時過量ROS[13]對精子線粒體造成損傷,導致線粒體脫落,數量減少,影響線粒體膜上呼吸鏈和產生腺苷三磷酸酶系的正常功能,造成線粒體DNA氧化損傷,誘導線粒體內釋放鈣離子,線粒體內鈣離子濃度升高可引起細胞色素氧化酶系統功能失調,導致氧化單電子還原成氧自由基增多,觸發細胞凋亡,進而導致精子活力減弱甚至喪失。

1.2.4 對精子運動能力的損傷 研究表明,精液OS指數與精子活率、前向運動率、低滲腫脹率、快速直線運動濃度、快速直線運動總數、直線速度、路徑速度、總抗氧化能力和正常形態率負相關[14]。ROS水平與精子的運動能力負相關,可能是ROS引起ATP減少,進而導致精子活力的減弱甚至喪失。

2 中藥單體調控OS

2.1 多糖類化合物 研究發現,黃芪多糖、黨參多糖、枸杞多糖、黃精多糖、女貞子多糖、石斛多糖、當歸多糖、山茱萸多糖屬于多糖類化合物,具有抗氧化作用,能改善OS損傷致MI模型的生殖功能[15-22]。見表1。體內實驗發現,這些多糖類化合物能提高小鼠睪丸、附睪臟器系數,改善小鼠睪丸精曲小管內徑、生精上皮高度,明顯增加睪丸曲精小管生精小管內生精細胞數量[15-22]。對性激素的影響主要表現在增加血清睪酮、促黃體生成素、促性腺激素釋放激素含量。對抗氧化酶的影響主要表現在升高睪丸組織SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)、總抗氧化能力活性,降低MDA含量。對精子質量的影響主要表現在增加精子數量及密度,增加正常形態精子率,提升精子活力,降低精子畸形率,增加精子頂體反應率。進一步研究發現,枸杞多糖能上調大鼠精子細胞B細胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)表達,下調Bcl-2關聯X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)表達,提高線粒體膜電位[23]。當歸多糖能下調小鼠睪丸組織P53、P21蛋白表達,拮抗致衰劑對睪丸細胞的損傷,其作用機制與抑制p53/p21/pRb信號通路,提高抗氧化能力有關[24]。黃精多糖能上調小鼠睪丸組織磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1(NADPH Quinineoxidoreductase-1,NQO-1)、核因子E2相關因子2(Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 2,Nrf2)、血紅素氧化酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)mRNA的表達水平,下調胱天蛋白酶-3(Caspase 3)信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid,mRNA)表達水平明,其機制可能與調控Nrf2和Caspase-3信號通路表達有關[25]。體外實驗發現,黨參多糖可明顯降低體外培養的大鼠睪丸間質細胞SOD和MDA含量,提高GSH-Px活力[26]。女貞子多糖能增加脂多糖誘導的大鼠睪丸支持細胞SOD、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、GSH-Px活性,降MDA濃度,調節支持細胞分泌轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)、白細胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)和白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6),減輕炎癥反應,降低細胞凋亡,發揮生殖保護作用[27]。

表1 多糖類化合物調控OS改善生殖功能

2.2 黃酮類化合物 黃酮類化合物是一類廣泛分布于自然界且具有多樣生物活性的天然化合物,由于黃酮類化合物大多呈黃色或淡黃色,且分子中亦多含有酮基,因此被稱為黃酮。淫羊藿苷、菟絲子總黃酮、槲皮素屬于黃酮類化合物,研究發現[28-36],這些黃酮類化合物具有抗氧化作用,能改善OS損傷致MI模型的生殖功能。見表2。體內實驗發現,淫羊藿苷能增強大鼠睪丸附睪指數、精子密度、精子活動率,升高血清睪酮,降低肌酐、尿素氮,增強睪丸組織抗氧化酶活性[28-29]。菟絲子總黃酮能增加大鼠精子數量及活動率,增加睪酮分泌,增強睪丸內酸性磷酸酯酶、乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶活性,降低MDA含量,升高GSH和SOD水平,減少細胞凋亡,其作用機制與下調脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,Fas)和脂肪酸合成酶配體(Fatty Acid Synthase Ligand,FasL)基因表達有關[30]。紫云英苷能恢復小鼠睪丸曲細精管完整性,促使生精細胞排列有序,層次清楚,間質趨于正常,生精細胞及管腔內精子細胞數量恢復正常,修復睪丸組織形態損傷,增強抗氧化酶活性,其作用機制與抑制磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(Phosphorylation c-Jun N-terminal Protein Kainse,p-JNK)表達,減少睪丸細胞凋亡有關[31-32]。槲皮素能增強大鼠睪丸組織抗氧化酶活性,其作用機制與激活Nrf2/Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-Like Ech-Associated Protein-1,KEAPl)抗氧化通路有關[33-34]。體外實驗發現,淫羊藿苷能增強衰老大鼠睪丸組織初級精母細胞和精原細胞抗氧化酶水平,減輕DNA損傷,其作用機制與激活Nrf2/HO-1信號通路有關[35]。金絲桃苷能增強小鼠精母細胞(GC-2)抗氧化酶活性,抑制細胞凋亡,其作用機制與激活Keap1/Nrf2/HO-1信號通路有關[36]。

表2 黃酮類化合物調控OS改善生殖功能

2.3 皂苷類化合物 皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷。研究發現,人參皂苷Rg1、薯蕷皂苷元、蒺藜皂苷屬于皂苷類化合物,具有抗氧化作用,能改善OS損傷MI模型的生殖功能。見表3。體內實驗發現,少弱精子癥小鼠模型使用薯蕷皂苷元治療后,勃起潛伏期降低,精子數量及密度提升,睪丸、附睪、脾臟、胸腺的臟器系數增加,精子數目及精子活力增加,睪丸組織中的SOD活性升高,MDA含量降低,說明薯蕷皂苷元能增強睪丸組織的抗氧化能力,減輕OS損傷,對小鼠生殖系統具有保護作用[37]。蒺藜皂苷可提高衰老小鼠附睪精子密度、精子活率、精子活力,降低精子畸形率,增強全血抗氧化酶活性,促進鈉泵表達,其作用機制與抗氧化,增加免疫功能,促進損傷細胞修復有關[38-39]。體外實驗發現,睪丸間質細胞(TM3)衰老模型,經人參皂苷Rg1干預后,IL-1等炎癥介質基因表達下降,GSH-Px和CAT活性升高,MDA與ROS含量降低,睪酮合成關鍵酶基因及蛋白表達上調,作用機制可能是通過激活Nrf2/抗氧化反應元件(Anti-oxida-tive Response Element,ARE)抗氧化信號通路,調控雄激素分泌功能,對睪丸損傷具有明確的保護作用[40]。體內實驗發現,人參皂苷Rg1可以提高實驗性精索靜脈曲張大鼠睪丸生精細胞Bcl-2的表達,同時下調Caspase-3的表達,抑制生精細胞凋亡,提高睪丸生精功能[41]。

表3 皂苷類化合物調控OS改善生殖功能

2.4 苯丙素類化合物 苯丙素類化合物是指以C6-C3為基本單元的一類化合物。研究發現,姜黃素、五味子甲素、白藜蘆醇屬于苯丙素類化合物,具有抗氧化作用,能改善OS損傷致MI模型的生殖功能。見表4。體內實驗發現,姜黃素能增強大鼠左側睪丸系數,修復睪丸結構損傷,增大生精小管直徑,降低生精細胞凋亡指數,升高血清睪酮水平,增加GSH活力,增強生殖功能[42]。白藜蘆醇可降低大鼠睪丸組織MDA水平,升高SOD、GSH水平,影響c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal Protein Kainse,JNK)活性,其作用機制為抑制凋亡信號調節激酶1(Apoptosis Signal-Regulated Kinase-1,ASK1)/JNK/活化轉錄因子2(Activated Transcription Factor 2,ATF2)信號通路,增強抗氧化能力,減少生精細胞凋亡,保護生精能力[43]。五味子甲素能增加大鼠睪丸系數,升高睪丸組織中谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST),升高GSH/氧化型谷胱甘肽(Glutathione Oxidized,GSSG)比值,通過抗氧化作用,保護大鼠睪丸生精功能[44]。體外實驗證明,姜黃素可降低人精子懸液ROS含量,增加精子活動率、精子低滲腫脹率,降低精子畸形率,對精子DNA損傷具有一定保護作用,且這種保護作用呈雙向性,中劑量時作用最顯著,當姜黃素達到一定濃度時,可從抗氧化作用轉換成促氧化作用[45]。添加白藜蘆醇的冷凍保護劑可以提高小鼠精原干細胞存活數量,降低細胞凋亡率,這種作用可能與其降低ROS水平和Caspase-3的表達有關[46]。

表4 苯丙素類化合物調控OS改善生殖功能

2.5 其他類化合物

研究發現,環烯醚萜苷類化合物(桃葉珊瑚苷)、氮苷類化合物(紅景天苷)、苯乙醇苷類化合物(肉蓯蓉苯乙醇苷)、低聚糖類化合物(巴戟甲素)、多肽類化合物(牡蠣肽)也具有抗氧化作用,能改善OS損傷致MI模型的生殖功能。見表5。

表5 其他化合物調控OS改善生殖功能

2.5.1 環烯醚萜苷類化合物 桃葉珊瑚苷屬于環烯醚萜類化合物[47]。體內實驗發現,桃葉珊瑚苷能保持小鼠正常睪丸重量、精子形態、血生精小管屏障完整性,提高GSH活性,降低Bax/Bcl-2比值,降低Caspase-3的裂解和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]的表達,發揮抗氧化作用[48]。此外,桃葉珊瑚苷通過有效抑制蛋白激酶R樣內質網激酶(Protein Kinase R-like ER Kinase,PERK)/EBP同源蛋白(C/EBP Homologous Protein,CHOP)和JNK依賴的凋亡途徑來抑制細胞凋亡,并通過上調緊密連接蛋白和縫隙連接蛋白表達保護血生精小管屏障的完整性。

2.5.2 氮苷類化合物 紅景天苷屬于氮苷類化合物。體外實驗發現,紅景天苷能有效提高大鼠睪丸支持細胞SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,增加雄激素結合蛋白(Androgen Binding Protein,ABP)和抑制素βB亞基(InhibinβB,INHβB)mRNA表達量,減輕OS造成的睪丸支持細胞損傷[49]。體內實驗發現,紅景天苷能改善大鼠睪丸細胞結構、生精小管萎縮、生精細胞脫現象,升高睪酮、黃體生成素水平,降低尿促卵泡素水平,升高睪丸組織抗氧化酶活性,降低脂肪酸合成酶、脂肪酸合成酶配體、Caspase-3蛋白表達量,抑制生精細胞凋亡,作用機制與抑制Fas/Fasl信號通路有關[50]。

2.5.3 低聚糖類化合物 巴戟甲素屬低聚糖類化合物。用羥基脲構建小鼠腎陽虛模型,經巴戟天主要成分巴戟甲素干預后,首次追逐并射精的時間減少,交配成功率增加,精囊和前列腺的臟器系數增加,精子計數和活力增加,血清睪酮升高,皮質醇降低,睪丸組織中SOD含量升高,GPX、CAT活性增強,MDA活性下降[51]。說明巴戟甲素可以清除ROS自由基,保護精子DNA免受過氧化氫的損傷,抑制細胞膜脂質過氧化反應,修復氧化損傷睪丸的超微結構,對生殖功能發揮保護作用。

2.5.4 苯乙醇苷類化合物 取大鼠精子制備精子懸液,應用FeSO4/H2O2體系產生ROS,應用肉蓯蓉苯乙醇苷與精子共同孵育后可提高體外大鼠精子懸液SOD活力,降低MDA含量,抑制精子膜脂質過氧化反應,發揮抗氧化作用,增加精子尾部低滲膨脹率,對精子膜結構和功能具有明顯的保護作用[52]。采用共聚焦顯微拉曼光譜技術檢測發現人精子細胞核拉曼光譜的強度和峰位移發生顯著變化,給予肉蓯蓉苯乙醇苷保護處理后,這種變化被抑制[53]。肉蓯蓉苯乙醇苷能提高精子中SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,對氧化損傷的精子的DNA起到一定的保護作用。

2.5.5 多肽類化合物 牡蠣肽屬多肽類化合物。用D-半乳糖誘導大鼠衰老模型經牡蠣肽干預后,能縮短衰老雄鼠捕捉雌鼠潛伏期,增加捕捉次數、射精次數和射精潛伏期[54]。血清鋅和睪酮含量升高,可提升血清及睪丸組織SOD、GSH-Px和CAT水平,提升抗氧化能力。還可改善睪丸萎縮癥狀,修復生精小管上皮結構損傷,促進生精細胞、支持細胞和間質細胞增殖并減少壞死,增加精子數量、精子存活率,降低精子畸形率。說明牡蠣肽對D-半乳糖致衰老雄性大鼠性行為及生殖功能具有改善作用,能在多層次改善生殖衰老狀態。

3 小結

綜上所述,OS與MI關系密切,OS通過影響生精細胞、間質細胞、支持細胞及睪酮的合成,影響精子發生。通過損傷精子膜、DNA、線粒體,降低精子運動能力,加速細胞凋,使精子質量下降,最終導致MI的發生[55]。單味中藥中的有效成分多糖類化合物(黃芪多糖、黨參多糖、枸杞多糖、黃精多糖、山茱萸多糖、當歸多糖、女貞子多糖、石斛多糖),黃酮類化合物(菟絲子總黃酮、槲皮素、紫云英苷、羊藿苷、金絲桃苷),皂苷類化合物(人參皂苷Rg1、蒺藜皂苷、薯蕷皂苷元),苯丙素類化合物(五味子甲素、姜黃素、白藜蘆醇),環烯醚萜苷類化合物(桃葉珊瑚苷),氮苷類化合物(紅景天苷),低聚糖類化合物(巴戟甲素),苯乙醇苷類化合物(肉蓯蓉苯乙醇苷)多肽類化合物(牡蠣肽)均具有抗氧化作用,可提升雄性動物MI模型的生殖功能。

4 討論

目前治療MI的方法主要有藥物治療和非藥物治療,藥物治療包括抗雌激素、雄激素、抗氧化治療等,常用抗氧化劑包括維生素E、維生素C、輔酶Q10及乙酰半胱氨酸等。MI的主要病機以臟腑虛損為本,濕熱瘀滯為標,治療方面既要補益虛損,充養腎精,提升精液質量;同時又要暢通精室,清熱解毒,利濕祛濁,方能生精。黃芪、黨參、人參、紅景天補氣健脾;枸杞子、黃精、女貞子、淫羊藿、菟絲子、山藥、杜仲、山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉補腎填精;石斛、當歸、五味子滋陰補血;馬齒莧、白蒺藜、姜黃、虎杖、牡蠣清熱解毒,行氣化瘀;均為臨床治療MI的常用藥物。研究表明,這些藥物具有抗氧化作用,能改善MI模型的生殖功能,為中醫藥治療MI提供了一定的理論支撐,值得進一步深入探討。中醫藥調控OS提升生殖功能的研究也還存在一些問題：1)動物實驗和細胞實驗較多,臨床研究較少;2)藥效學研究較多,作用機制研究較少;3)沒有對MI最終治療效果指標妊娠率進行觀察;4)安全性研究較少。我們應該進一步借助現代科學技術手段,深入研究單味中藥在組織細胞和分子基因層次上的作用機制,采用隨機雙盲對照開展臨床研究,全面評估中醫藥通過調控OS治療MI的有效性和安全性,為中醫藥抗氧化治療MI提供理論支持,進一步推廣中醫藥治療MI的獨特優勢。

利益沖突聲明：無。