宏基因組病原學測序在下呼吸道感染的診斷價值和應用進展

孫佳佳 王偉

下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)因其高發病率、重癥率和死亡率,迄今仍是全球關注的重大衛生問題。準確及時地診斷出感染病原體,是有效治療該類疾病的關鍵環節。現有眾多微生物檢測技術尚存各自短板,難以滿足當前日益發展的臨床病原學診斷需求。宏基因組下一代測序技術(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是一種新型的病原學檢測技術,以其廣覆蓋、高通量、無先驗、無偏倚、精準快速等突出優勢,被逐步推廣應用于感染性疾病的病因診斷。本文擬對該技術在下呼吸道病原學診斷的臨床應用和未來發展作一綜述。

一、下呼吸道感染(LRTI)的流行病學和診療現狀

LRTI通常指包括急性氣管、支氣管以及肺部的感染性炎癥,影像學可呈滲出、實變影、膿腫、空洞甚至胸膜炎等多種表現,其致病病原體涵蓋細菌、真菌、病毒、非典型病原體甚至寄生蟲等多種微生物[1],目前仍是全球發病率和死亡率均高的疾病之一,尤其幼兒和老年患者,轉為重癥者屢不鮮見[2-3]。WHO報告2019年即有260萬LRTI患者死亡,并警告該病已成為人類死亡的第四大病因[4]。

LRTI的防治形勢之所以嚴峻,其關鍵原因在于許多患者的感染病原學診斷不明。呼吸道作為人體開放性器官,存在常態化微生物群,維持著復雜的微生態平衡[5],當機體免疫力下降、外感病原時,該平衡即易被打破而發生LRTI的一系列癥候群和并發癥,甚至轉為重癥或死亡。

沿用至今的經驗性抗感染仍是LRTI的主要對因治療,針對常見菌多能奏效,但在處理特殊、重癥、難治或罕見病原體感染時,療效常不理想;事實上,隨著社會發展、人們生活習性改變、廣譜抗菌藥物的一些不當應用和免疫缺陷/異常患者數量的增多,近年來非普通病原體所致的LRTI發病率不降反升[6-7],使得精準的抗感染治療成為亟待解決的關鍵環節。惟有盡可能快速、準確地檢出LRTI的致病病原體,才有望突破診療困境,大幅提高患者治愈率和改善預后[8]。

二、下呼吸道感染(LRTI)的病原學檢測現狀

按技術原理和發展過程,目前LRTI的病原學檢測方法主要分為傳統的培養/涂片法和現代的血清學、分子生物學檢測法。

培養/涂片法直觀明確,簡便經濟,但總體而言,陽性檢出率低[9];尤其對于部分苛/厭氧菌[10]、培養耗時長的分枝桿菌[11]和諸如放線菌等一些罕見疑難病原體,該方法均難以確診[12],易導致臨床誤診誤治。

隨著免疫學的發展和多種抗原抗體的發現,血清酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)通過結合抗原和測出抗體表達,已成為LRTI感染病原檢測的重要手段[13]。然而,受感染窗口期、抗體存在時間以及個體免疫狀態強弱的不同影響,ELISA也存在早期感染不易檢出、無法判斷是否現癥感染、結果假陰性、漏檢等可能。

分子生物學技術近年來發展迅猛,在各類病原學檢測方面發揮了重要作用。不僅實時定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction, q-PCR)現已應用廣泛,數字PCR(Digital polymerase chain reaction, dPCR)、多重PCR微球探針(Luminex)、環介導恒溫擴增(Loop Mediated Isothermal Amplification Technology, LAMP)[14]和核酸即時檢測(point-of-care testing, POCT)[15]等各新型擴增方法也在不斷更新。它們均具高靈敏度與特異性,擴增效率和儀器性能不斷優化,系統操作十分便捷,部分甚至可在床旁即時得出結果。然而即便如此,上述這些新型方法仍需臨床上的先驗預判,故仍僅能檢出數量有限的意向潛在病原體;同時,引物設計和產物分析的復雜繁瑣,也增加了結果判讀錯誤的幾率[16]。

除以上技術之外,電腦自動化也促進了微生物檢測平臺的改進。比如:全自動微生物鑒定分析儀(VITEK-2) ,可通過編碼轉換為生物信息編碼模式,由電腦程序自動掃描、讀數,分析和報告鑒定病原及藥敏[17],但該法僅限于檢測細菌。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)[12]可快速、簡便地檢測到活躍狀態的病原微生物,但前提是需要該病原體已有明確蛋白譜。

綜上可見,現有各類病原檢測方法雖各有所長,但都無法克服一個共性化的弱點,即:它們都屬于在臨床預判背景下的“驗證性檢測”,病原學覆蓋面有限,且無法檢測未知的微生物[18]。這種固有的不足,削弱了它們的診斷效能,以致對復雜、少見、疑難的LRTI會有漏誤診之虞。

三、宏基因組下一代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)的概念及其在非呼吸道感染中的診斷應用

mNGS的概念是指通過樣本采集、處理、核酸提取、文庫構建、上機測序,生物信息分析等,一次性對表征樣品中全部數千～數百萬條DNA/RNA片段同時、獨立地進行高通量隨機測序的技術,它克服了Sanger測序(即熒光標記核苷酸堿基,產生不同長度核苷酸,電泳檢測獲得DNA堿基序列的方法)[19]只能對具有一致性或低多樣性(單一或最多三種微生物)的樣本進行靶向測序的局限性,無需臨床預測,可快速、高效、準確地分析獲取樣品中的微生物和宿主遺傳物質(DNA/RNA)信息。mNGS以其顯著的廣覆蓋優勢,能一次性識別病毒、細菌、真菌、寄生蟲、甚至罕見或新發的大量各類病原體[20],從根本上彌補了以往檢測手段的不足。2014年,《新英格蘭雜志》報道了首例mNGS診斷了一例各種傳統檢測手段均無法確診的神經系統鉤端螺旋體病例[21],自此mNGS開始應用于臨床并逐步展現出對感染性疾病的診斷潛能。Ren等回顧性統計了2015～2019年確診的193名膿毒血癥患者和他們的305份、含血液、BALF和腦脊液各類標本的病原學檢測資料,結果發現,對比傳統檢測法,mNGS的診斷陽性率明顯提高。其中,鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌的最佳診斷reads數分別達2893、1825.5和892.5,因此認為mNGS能夠更敏感地識別膿毒癥患者標本中的多種病原體,而微生物的reads讀數可能有助于鑒別疑似和確診病原體[22]。復發性尿路感染(Recurrent Urinary Tract Infection,RUTI)是影響腎移植患者預后的關鍵因素之一,Duan等研究19例RUTI的腎移植受者尿液的mNGS和傳統培養,比較結果提示:mNGS在總陽性率(100.0%vs31.6%;P<0.01)和細菌鑒定率(89.5%vs31.6%,P<0.01)、病毒鑒定率(57.9%vs0;P<0.01)及真菌鑒定率(42.1%vs0;P<0.01)方面,均顯著高于培養法;且更容易發現混合感染(89.5%vs10.5%;P<0.01),該研究中14例患者因mNGS指導,調整了抗感染方案,病情得到緩解[23],故認為mNGS具有更高的病因診斷價值。人工關節感染(Prosthetic Joint Infections,PJI)是全關節置換術后的常見嚴重并發癥,早期確診病原診斷至關重要。Jun Tan等[24]對納入955名PJI患者的380項已發表研究進行Meta分析,發現mNGS對PJI的綜合診斷敏感性和特異性分別為0.93(95%CI, 0.83～0.97)和0.95(95%CI, 0.92～0.97),陽性、陰性似然比分別為18.3(95%CI, 10.9～30.6)和0.07(95%CI, 0.03至0.18),曲線下面積為0.96(95%CI, 0.93至0.97),得出結論:mNGS對PJI的診斷具有高準確性,尤其適用于感染標本培養陰性的患者。上述報道均展示了mNGS在病原微生物診斷鑒定領域的顯著優勢。

四、mNGS技術在下呼吸道感染(LRTI)診斷中的應用

細菌是LRTI中最常見病原體,但傳統培養法陽性率并不理想,mNGS的出現,有望突破培養困難的藩籬[25]。2018年Langelier等運用mNGS成功在26例LRTI患者中檢測出全部38種致病病原體以及升高10倍以上的氣道微生物,以此為導向的針對性抗感染使得患者迅速改善,治療時間和費用明顯降低[26]。2019年上海瑞金醫院發表了13位免疫缺陷的難治性重癥社區獲得性肺炎(Treatment resistant severe community acquired pneumonia, TR-sCAP)患者的致病微生物結果,其中傳統法檢出6例(4例細菌、1例真菌和1例病毒),而配對的mNGS法檢出了12例(4例細菌、7例真菌和1例病毒),故認為mNGS在此類重癥機會性感染有明顯診斷優勢[25]。

病毒也是LRTI中常見的病原種類[27],且易引發公共衛生事件。以免疫學和PCR檢測為主的檢測技術診斷效能有限,而mNGS廣覆蓋的檢測卻可提升病毒檢出率。Langelier等[28]對22例LRTI住院患者支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)進行傳統培養、多重PCR和 mNGS檢測,結果表明:培養和PCR共檢出7例患者的病原體;而mNGG卻檢出所有22位患者各自的病原微生物,包括在6例傳統檢測均為陰性患者樣本中,檢出了合胞、冠狀、輪狀等多種RNA病毒,以及人類皰疹、單純皰疹、巨細胞、EB和人乳頭瘤等多種DNA病毒,顯著豐富了病原學信息,為制定綜合抗感染治療方案提供了強有力證據。對于廣受全球關注的新型冠狀病毒(new coronavirus disease 2019, COVID-19)肺炎,mNGS也發揮了獨特的診斷作用,Wang[29]等應用mNGS對82例 COVID-19 患者進行測序,發現部分 HLA 等位基因可能與 COVID-19 的發生有關,表明mNGS還可對傳染性強的流行性病毒感染進一步行基因型鑒定,從而為更新防控策略提供重要的實驗依據。

對于下呼吸道的特殊感染,mNGS也展現出令人鼓舞的優勢。Jin等人于2020年發表了一項mNGS診斷活動性結核病的研究,共納入確診結核病61例,臨床診斷者64例。結果發現:mNGS的診斷敏感度為49.6%,特異度98.3%,高于培養法;同樣在該研究中,mNGS也將診斷時間從2～6周縮短到了32～36小時[30]。下呼吸道真菌感染的涂片或培養檢測,往往敏感度偏低[20],而真實世界中,也不難見到綜合六胺銀染色、1,3-β-D葡聚糖(Glucan, G)和半乳甘露聚糖(Galactomannan, GM)試驗、以及影像學檢查等方法仍無法確診的LRT真菌感染,屬于呼吸科臨床難題之一,而mNGS的應用為此提供了有效解決途徑。Yang等人分析106例疑似肺部真菌感染的病例,發現與病理、G、GM試驗等比較,mNGS特異性雖相似,但診斷敏感性顯著提升(84.4%vs44.4%,P<0.05)[31]。 Shen等報道了1例經多種傳統檢測均未確診的重癥肺炎患者,最終通過BALF的mNGS確診為罕見的馬爾尼菲青霉菌感染,調整治療后轉危為安[32]。鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)是一種相對罕見人畜共患病原體,肺部感染表現各異,重癥和死亡率高,傳統病原檢測多為假陰性,診療難度極大。Wu等對13例病初均需機械通氣的重癥肺炎患者行mNGS,均在48～72小時內明確檢出鸚鵡熱衣原體,調整治療,最終11例完全康復,2名因并存耐多藥銅綠假單胞菌感染死亡[33]。該研究提示mNGS有助于鸚鵡熱肺炎的早期診斷和正確治療,也豐富了sCAP的病因學認識。侯婕等報道了1例肺恙蟲病感染患者,查外斐試驗、血液、BALF培養均呈陰性,最終經由mNGS檢出恙蟲病東方體,僅予多西環素單藥,4天后患者癥狀和感染指標即恢復正常[34]。

上述報道也不難發現,mNGS無偏倚、廣覆蓋的“宏”檢測優勢,在LRTI混合感染的診斷方面也極具價值[35],仍以上文瑞金醫院研究為例,在13位免疫缺陷的難治性sCAP患者的病原檢測中,mNGS還檢出5例卡氏肺囊蟲肺炎和1例煙曲霉菌感染,而此6例對應的傳統檢測法均為陰性結果[25]。

五、mNGS面臨的挑戰和應對措施

mNGS的高敏感和廣覆蓋優勢雖多有體現,但它在真實世界中的應用也不免遇到挑戰。mNGS的終極目的是確定責任病原體,但在報告中,我們常遇見檢出病原體的序列數低和致病病原和背景病原難以區分鑒別的困難。現將此二者發生原因及可能的應對措施分述如下。

第一,mNGS報告中,檢出病原體序列數低,可能原因如下:①標本采集于患者疾病早期/恢復期/抗感染藥物暴露后,或僅為局灶性感染(病變部位少菌狀態)等,使得標本病原體的載量低。②標本采樣、保存、運輸環節中病原微生物核酸破壞和降解[25]。③病原體核酸提取效率低,比如結核菌、真菌等胞壁硬、厚,破壁困難;而胞內微生物如衣原體、立克次體因體積微小,本身核酸提取困難。④DNA/RNA核酸文庫構建不夠完備,感染病原體僅能比對部分短序列。

為應對上述挑戰,可能采取的措施有:①選取合適時機,如在已有癥狀但未用藥時,進行標本采樣,排除干擾因素,局灶性感染盡量在病灶內采樣。②標本采樣和后處理過程中保持無菌化。③通過“去宿主”方法,顯著減少宿主核酸數量[36]來有效提升病原核酸獲取率。④海量病原體的龐大基因組極易和人類基因組混淆,在盡量減少后者宿主干擾同時,也需不斷擴大、優化病原體基因組的文庫構建,以期更準確地明確責任病原。比如具有一次性獲得兆(Mbyte, Mb)以上級別的長讀長序列的三代mNGS,相比二代mNGS,即可大大減少拼接組裝,更有益于獲取優質的微生物序列[37]。

第二,mNGS報告中致病菌與背景菌的區分困難,是導致臨床誤診的另一個原因。mNGS無偏倚、高敏感、廣覆蓋的特性也猶如“雙刃劍”,也可能誤將LRTI標本中的常態微生物、定植菌及環境中污染成分等,報為責任病原,造成假陽性誤診。因此,送檢標本的來源和質控至關重要。理論上,血、痰液、胸腔積液、肺組織、BALF都可作為LRTI的mNGS標本,BALF有“液體肺活檢”之稱,被認為是LRTI患者標本的合適選擇[38],但目前對于BALF,以及鏡下針吸刷檢(bronchial needle brushing, BB)和支氣管肺活檢(transbronchial lung biopsy, TBLB),這些標本哪種最為優選,尚無定論[39]。一般而言,采樣越接近或位于病灶內部,診斷率將越高。隨著徑向支氣管腔內超聲(Radial Endobroncheal Ultrasonography, R-EBUS)和支氣管鏡導航技術的臨床應用,臨床上將更有望獲得代表感染病變特征的LRTI標本。Feng等[40]分析2018～2019年疑似肺部感染的213例患者,經虛擬導航(virtual bronchoscope navigation system,VBN)獲得BALF標本,比較mNGS與傳統方法對肺外周感染的診斷價值。結果發現:在94.49%接受傳統病原檢測均為陰性結果的肺部感染患者中,其BALF的mNGS都檢出了與疾病相關的微生物,mNGS的檢測靈敏度明顯高于傳統法(88.30%vs25.73%,P<0.05),而特異度則相當(81.16%vs88.41%);mNGS同時也體現出了診斷混合感染的優勢。該團隊的另一項121例患者入組的前瞻性研究[41]中,R-EBUS引導取材TBLB標本的mNGS陽性檢出率明顯高于常規TBLB組 (78.7%vs60.0%,P<0.05) ,提示了導航定位下精準取材對確診肺外周感染的價值。 Wang等[38]也開展了20例肺外周感染患者肺穿刺標本mNGS與傳統病原檢測的比較研究,結果提示:mNGS的敏感度和特異度在細菌和真菌中不盡相同(細菌:100% 和76.5%;真菌:57.1%和61.5%);mNGS陽性預測值(細菌:42.9%,真菌:44.4%),遠低于陰性預測值(NPV)(細菌:100%,真菌:72.7%)。該研究表明肺感染性病變穿刺組織的mNGS在病原診斷速度和靈敏度方面較傳統病理培養方法更具優勢,當然,mNGS的結果解讀需要綜合分析。

六、mNGS診斷LRTI的小結及展望

綜上所述,mNGS作為一種無需先驗的高通量檢測技術,因具有“宏”的優勢,可快速敏感地識別LRTI的病原信息,指導對因治療,扭轉改善患者臨床結局,降低醫療資源消耗。因其具有難以匹敵的優勢,現已被認為是對LRTI病原診斷方法的有效補充[42]。但同時也應看到,mNGS對LRTI的診斷仍可能面臨低序列數致病原和與背景菌區分困難的挑戰,這表明該技術仍有待進一步優化。去宿主[36]、正向富集病原體[43]、聯合靶向mNGS(t-mNGS)[44]有望成為解決方法。對于臨床呼吸科醫師而言,除了應熟知mNGS適應證、患者臨床表現、感染學指標、傳統病原檢測結果和用藥應答等各種信息,以期高效解讀mNGS報告外,也應強化“優質取材”意識,盡可能借助各類導航定位技術,獲取可能最大程度地代表疾病特征的標本。相信多方共進的策略,必將進一步提升mNGS的診斷價值,令更多LRTI患者獲益,也有助于推動“微生物導向”[45]的精準醫療策略的臨床實現。