重癥醫學科耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因型和同源性分析

張立榮，江 滟

（1.貴州醫科大學檢驗學院微免教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省黔東南州從江縣人民醫院檢驗科，貴州 從江 557400；3.貴州醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心微免科，貴州 貴陽 550004）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， SA）所致的下呼吸道感染、化膿性感染在革蘭陽性球菌感染病原菌中占比非常高，近幾年由它引起的感染死亡率逐年增高［1］，在青霉素尚未研究發現之前，由金黃色葡萄球菌感染造成的死亡率達80%以上，然而在青霉素引入治療未達兩年，耐藥菌株陸續在各個國家及地區發現，且數量急劇增加，現如今大部分醫院調查數據發現已對青霉素耐藥率達90%以上［2］。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus， MRSA）的 高 耐 藥率更是給臨床帶來了極大的治療困難，研究顯示mecA耐藥基因產生后而賦予菌體耐藥性，致使大部分β-內酰胺類藥物對其治療無效［3］。同時MRSA菌株之間還存在著耐藥基因與毒力基因轉導或綴合，導致菌株對多種類抗菌藥物產生極高的耐藥性，從而形成強大侵襲致病力［4］。調查發現在美國由革蘭陽性球菌造成的多耐藥菌致死率最高的菌仍是MRSA［5，6］。抗菌藥物大量使用與細菌耐藥性存在必然的聯系，探討二者的相關關系旨在對臨床指導使用抗菌藥物有一定作用。多位點序列分型（Multilocus sequence typing， MLST）是是一種重要的分子生物學分析方法，對新出現的不同抗生素耐藥菌株，及毒力、與抗原相關的特殊基因型，起重要研究作用［7］。

本研究擬對貴州省從江縣人民醫院（以下簡稱該院）重癥醫學科下呼吸道分離的SA 的耐藥變遷情況進行回顧性分析，并對其中40 株MRSA 的耐藥基因進行檢測及同源性分析以期為臨床用藥和醫院感染控制提供有效的依據。

1 材料與方法

1.1 患者一般資料

表1 年齡、性別與感染人數的關系Tab 1 The relationship between age， gender， and number of infected individuals

1.2 實驗菌株

收集該院重癥醫學科2018 年1 月～2021 年12月下呼吸道感染患者痰液、血液標本分離出的40 株MRSA。本研究經貴州省從江縣人民醫院倫理委員會通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定及藥敏試驗 VITEK2-compact 微生物分析儀對菌株進行鑒定及藥敏，儀器法得到的藥敏試驗結果結合手工藥敏法分析所有藥敏結果，得到的藥敏結果以美國臨床實驗室標準化協會最新標準作結果判斷［9］。

1.3.2 MRSA 的判定 將30 μg 頭孢西丁藥敏紙片貼于已接種好SA 的MH 平板上，經35 ℃培養16～18 h 后 觀 察，抑 菌 圈 直 徑≤21 mm 即 可 判 定 為MRSA。

1.3.3 耐藥基因檢測 按天根生化試劑公司提供的細菌DNA 試劑盒操作方法而提取到SA 的DNA，引物的設計借鑒文獻［10］，從而合成SA 的3 種耐藥基因（mecA、SCCmec、femB） 及耐消毒劑基因（qacA/B），引物信息見表2。

表2 基因引物擴增序列Tab 2 Primer sequences

1.3.4 同源性分析 從pubMLST 網站上（https：//pubmlst.org/bigsdb？ db=pubmlst-abaumannii_seqdef）查詢并獲得SA 的管家基因，PCR 法擴增上述管家基因部分基因片段，得到的PCR 產物送至第三方測序公司進行測序，測序結果按順序依次輸入MLST 網站數據庫中。從而得到每株菌相對應的序列型。

管家基因引物設計參考文獻［11］，引物信息分別見于見表3。PCR 反應條件：95 ℃預變性15 min，94 ℃變 性30 s，57 ℃退 火 1.5 min，共 進 行30 個 循環，最后72 ℃延伸1.5 min。

表3 金黃色葡萄球菌管家基因引物擴增序序列Tab 3 Primer amplified sequence of housekeeper gene of Staphylococcus aureus

1.4 同一克隆菌株判定標準

運用凝膠圖像分析系統，作電泳條帶識別分析，將數據整理后，運用eBURST 軟件、MEGA7.0軟件進行遺傳相關信息分析，判斷7 個管家基因型中的6 個基因型相同即為同一流行克隆群，包含3個及以上ST 型的克隆群為1 個克隆復合體（Clonal complex， CC）［12］。

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1.5 統計學處理

運用SPSS29.0 軟件中的統計學方法皮爾遜相關性分析（Peason Correlation）分析細菌耐藥率與各類抗菌藥物用藥頻率的關系，P＜0.05 表明差異具有統計學意義，存在相關關系，＞0 表示為正相關，負數表示為負相關。r＞0.8 表示耐藥率與DDDs 明顯相關，0.4～0.6 為中等程度相關關系，r＜0.4 為不存在相關關系。

2 結果

2.1 標本分布情況

2018～2021 年ICU 下呼吸道感染共分離出637株SA，其中以痰液標本占比最高，共分離出226 株（35.48%），全血112 株（17.58%），胸水中共分離出107 株（16.8%），肺 泡 灌 洗 液 共 分 離 出86 株（13.5%），肺膿腫穿刺液共分離出59 株（9.26%），其他標本共分離出47 株（7.38%），見表4。

表4 2018 年-2021 年金黃色葡萄球菌標本分布情況Tab 4 Distribution of Staphylococcus aureus specimens from 2018 to 2021

2.2 耐藥變遷情況

SA 耐藥變化情況顯示連續4 年青霉素耐藥率均高于92%以上，居高不下。四環素、克林霉素、復方新諾明4 年平均耐藥率分別為40.19%、34.22%、33.90%。苯唑西林平均耐藥率為20.04%，奎奴普丁/達福普丁平均耐藥率僅有3.61%。耐藥趨勢顯示四環素、克林霉素、復方新諾明耐藥率在2019 年有所下降后卻又再次持續升高。紅霉素、苯唑西林、左氧氟沙星、奎奴普丁/達福普丁的耐藥率呈現逐年增長趨勢。耐藥情況見表5。

表5 2018-2021 年金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥情況［n（%）］Tab 5 Resistance of Staphylococcus aureus to antibiotics in 2018～2021［n（%）］

2.3 各抗菌藥物的DDDs

2018～2021 年左氧氟沙星的DDDs 位于榜首，其次為頭孢類抗菌藥物（頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林），青霉素、慶大霉素、紅霉素、復方新諾明、苯唑西林呈下降趨勢，萬古霉素、替加環素、頭孢曲松呈上升趨勢。見表6。

表6 2018-2021 年常用抗菌藥物的DDDsTab 6 DDDs of common antibacterial drugs in 2018-2021

2.4 耐藥率與各抗菌藥物的DDDs 的相關性

相關性分析表明，SA 對苯唑西林耐藥率與苯唑西林DDDs 存在明顯正相關，SA 對左氧氟沙星耐藥率與左氧氟沙星DDDs 存在明顯正相關，SA 對克林霉素耐藥率與復方新諾明DDDs 存在明顯負相關，其他抗菌藥物耐藥率與各藥物DDDs 相關性無統計學意義。見表7。

表7 金黃色葡萄球菌耐藥率與常用抗菌藥物DDDs 的相關性Tab 7 Correlation between drug resistance rate of Staphylococcus aureus and DDDs

2.5 耐藥基因檢測結果

40 株MRSA 的mecA基 因 檢 出39 株 占 比97.5%（39/40），SCCmec基因、femB基因檢測結果為陰性。6 株菌檢出耐消毒劑qacA/B基因，占比15%（6/40），mecA、qacA/B基因共同檢出5 株，占比12.5%（5/40）具體情況見表8，部分電泳結果見圖1、2。

圖1 mecA 基因擴增產物電泳圖Fig 1 Electrophoresis of mecA gene amplification products

圖2 qacA/B 基因擴增產物電泳圖Fig 2 Electrophoresis of qacA/B gene amplification products

表8 40 株MRSA 耐藥基因檢測結果Tab 8 Detection results of drug resistance genes of 40 MRSA strains

2.6 MLST 分型結果

40 株MRSA 各管家基因測序結果經與Pubmlist 數據庫比對，得到的數據顯示共得到7 個序列型，占比最高的型別為ST59 型，其后占比從高到低依次為ST45 型，ST239 型、ST28 型、ST188 型、ST1型和ST630 型。8 株ST59 型菌株來源于不同時間不同病人，5 株源于同一時間不同病人同屬ST59型。4 株ST59、5 株ST45 型源于不同時間段的不同病人，表明該院存在科內克隆菌株，在不同病人間的傳播和流行。分型結果見表9。

表9 MRSA 多位點序列分型結果Tab 9 Results of MRSA multiple-point sequence typing

2.7 基于eBURST 算法的進化分析

遺傳學上將序列有所差異但存在相關性的集合稱之為克隆復合體，其中CC 中的核心ST 型是相對流行的型別，可由其衍生出許多與它相關的親緣性型別，eBURST 軟件將3 個及3 個以上ST 分型推算為一個CC，其中包含一個最原始的ST 型，其余2個或以上ST 型為其親緣型別。運用e BURST 軟件對40 株MRSA 實驗菌株進行進化分析，結果顯示7 個ST 型共形成一個克隆型，即（ST239-ST630），及5 個獨特型（ST1、ST28、ST45、ST188、ST59）。所有試驗菌株未能形成1 個CC，僅有ST239 和ST630 存在一個點位變異，未發現第三個存在兩點變異的ST 型，所以未能形成一個CC。將40 株MRSA 實驗菌株與國際MRSA 數據庫進行比對后發現，ST1、ST239、ST188、ST630 同屬與CC5家族，ST45 歸屬于CC45 家族，本研究中的40 株MRSA 中 的ST45 為 該 家 族 的 祖 先，ST59 歸 屬 于CC59 家族，本研究中的40 株MRSA 中的ST45 為該家族的祖先。

2.8 分離株遺傳進化分析

遺傳學上常將遺傳的多樣性通過遺傳距離來作為基準，從而表達群體演化過程及群體遺傳的差異性，如遺傳距離較小，種群的分化時間則較短，遺傳距離越遠，則分化時間更長。運用MEGA7.0 軟件對菌株的等位基因譜作進化分析，據核酸序列上的STs 的進化距離從而繪制出系統進化樹圖（如圖3 所示），從進化樹圖中可以看出，對于有互相有單位點變異的ST239 與ST630、ST1 與ST188，其 親緣關系相近。表明菌株在進化時，大多數時候保持遺傳的相對穩定性（即進化得出的ST 型一致），但也可能出現多位點的變異，致使細菌基因呈現多態性。

圖3 MEGA 分析構建40 株MRSA 的進化樹Fig 3 Evolution tree of 40 MRSA strains analyzed and constructed by MEGA

3 討論

SA 是呼吸道和皮膚的定植菌，是引起化膿性感染的主要病原菌，可導致局部感染如癤或癰甚至全身性感染［13］。MRSA 為世界衛生組織重點關注的多重耐藥菌株對象之一，因其高耐藥性及高傳播能力，易集中爆發于重癥監護室下呼吸道感染患者，臨床抗感染治療困難，患者病死率高［14］。

本研究中SA 對呋喃妥因耐藥率僅為0.9%（6/637），對利奈唑胺、替加環素、萬古霉素完全敏感。這一點和省內某醫院、南方福建，北方遼寧某醫院一致，均未發現三者的耐藥菌株，本研究出現23 株奎奴普丁耐藥株，耐藥率為3.61%［15-18］，同比成都地區4 年內耐藥率有所不同，該地區奎奴普丁耐藥率為0［19］。利福平、利奈唑胺敏感性較好。呋喃妥因常應用于尿路感染，不建議治療下呼吸道感染［20］，因此替加環素、萬古霉素以及利奈唑胺推薦使用。MRSA 所致的感染性疾病以四環素類、糖肽類/脂肽類抗生素、喹努普汀/達福普、復方新諾明推薦使用，呋喃妥因不推薦。本研究結果提示除傳統經驗藥物外，其對利福平以及慶大霉素敏感性亦較高。

該院主要以頭孢類抗生素及青霉素類使用率最高，其中頭孢類抗生素以頭孢曲松作為代表作抗生素，其使用率最高，兩類抗生素用藥頻率呈現逐年增長趨勢，臨床對這兩類抗生素的偏向性選擇明顯，可能主要原因是青霉素類抗生素屬廣譜抗生素且為初級抗生素，是臨床中抗感染的首選藥物，頭孢類抗生素因其抗菌活性較青霉素類更強，且過敏反應少等原因，逐漸成為青霉素抗感染失敗后的首選藥物，因此二者使用率一直居高不下，提示現階段臨床抗感染藥物選擇主要為青霉素類及頭孢類。

細菌耐藥變遷可能有多方面原因，SA 耐藥率與各抗菌藥物用藥頻率的相關性分析顯示，大部分藥物耐藥率與自身藥物DDDs 無相關性，部分藥物耐藥率與其他藥物用藥頻率存在明顯正相關，部分藥物耐藥率與其他藥物用藥頻率存在明顯負相關，這與有關報道是一致的［21］。SA 對苯唑西林的產生抗藥的機理是產生β-內酰胺酶及產生了除PBP2a的另外一種低親和力PBPs 導致耐藥，左氧氟沙星抗菌作用主要是以抑制細菌DNA 活性，從而致使細菌DNA 無法復制及合成而死亡，SA 對苯唑西林、左氧氟沙星耐藥率與各自用藥頻率存在明顯正相關，藥物使用頻率越高，越容易導致SA 對這兩種藥物產生耐藥性。克林霉素的耐藥率與復方新諾明用藥頻率存在明顯負相關，復方新諾明用藥頻率高可能會使克林霉素的耐藥率低，表明藥物的應用與細菌耐藥性關系比較復雜，存在相互交叉作用。本研究中有部分藥物使用頻率DDDs 與SA 耐藥性無相關關系，可能與本研究未涉及到的一些耐藥變遷因素有關，有待更進一步研究。

據報道青霉素結合蛋白PBP2a 對β-酰胺酶類抗生素的親和力極低，是導致MRSA 多耐藥的主要原因，而mecA是編碼PBP2a 蛋白最重要的基因結構，因此mecA基因的攜帶率導致了MRSA 多耐性的產生［22］。多數研究提示mecA基因檢測法測定MRSA的準確為96.83%，這種基因檢測方法比起傳統的苯唑西林紙片法更簡單、更快速、更準確。因此，此檢測方法在我院更值得提倡及推廣，使MRSA 檢測更快速高效，更好的為臨床提供藥敏指導［23］。研究所收集的40 株MRSA 中mecA基因占比97.5%，和多數文獻報道一致［24，25］。MRSA 中若檢出mecA基因則提示均對青霉素、頭孢菌素以及單環酰胺類高度耐藥，本研究與上述學者研究結果基本吻合。40 株MRSA 中未發現攜帶SCCmec、fem耐藥基因菌株，這可能與本次收集的數量不足有關。

國外學者指出［26］SA 攜帶耐消毒劑基因后即對普通消毒劑產生耐性，而致使其無法被殺滅，其中耐消毒劑基因qacA/B對季胺類、胍類及腙類消毒劑抗性表現最為明顯，是導致近幾年來MRSA 對這幾類消毒劑抗性增加的主要原因［27］。東北地區燒傷患者的qacA/B基因的攜帶率為86.32%［28］，高于馬來西亞某醫院對報道的qacA/B攜帶率為53.13%，丁新玲等［29］報道的MRSA 菌株qacA/B基因攜帶率為56%，而MSSA 的qacA/B基因攜帶率稍低，攜帶率為41%，伊朗某省對MRSA 及MSSA菌株qacA/B基因攜帶率亦是不同，分別為68%、58.2%［30］，表明多地區關于qacA/B基因存在顯著性地區差異，及標本類型之間的差異，MRSA 攜帶率高于MSSA。40 株MRSA 中發現6 株攜帶有qacA/B基因，攜帶率為15%，攜帶率雖低于部分地區報道，標本主要收集于ICU 下呼吸道感染標本，可能與收集標本類型不夠全面有關，但依然存在對抗性增加的風險。ICU 內的消毒劑使用高于普通科室，尤其多使用氯類、季胺類和醛類消毒劑，而qacA/B基因主要使細菌增加上述消毒劑的抗性。普通常規方法無法檢測出菌株是否攜帶qacA/B基因，需采用PCR 法才能檢測出菌株是否攜帶耐消毒劑基因qacA/B基因，因此定期收集耐藥或敏感菌掌握qacA/B基因攜帶情況。有利于了解本地區攜帶耐消毒劑MRSA 菌株的分子流行病學情況，從而合理規范消毒劑的使用。

本研究仍存在一些不足之處，如數據資料收集到得標本數偏小，可能研究結果會造成偏倚，還需要加大菌株數量的收集及增加更長年限來更好的驗證本結論；此外，研究僅對耐消毒劑qcaA/B 基因進行了檢測，尚不能表明MRSA 未攜帶有耐消毒劑的其它基因。

MRSA 菌株的克隆群存在地區性差異，美國常見型別主要是ST1 和ST8，歐洲多以ST80 為常見型 別，而 亞 洲 國 家 則 多 以ST30、ST59 型 為 主［31］。本次研究的40 株MRSA 經MLST 分型結果顯示，ST59 型菌株是我院重癥醫學科主要的流行菌株，占比為42.5%（17/40），與亞洲部分報道一致。2000年以前我國的主要流行型別為ST239-t030-SCCmecIII，2000 以 后 主 要 以ST239-t037-SCCmecIII 為主，目前國內主要流行的型別主要以ST239 和ST59 為主［32］，本實驗研究與其基本一致。本研究中檢出的ST188、ST45 這一型別在韓國及國內的廣州相關研究中也有發現，其他型別檢出量較少［33，34］。表明ST59、ST45 兩種型別可能同為重癥監護室克隆株的總趨勢，并且會造成科內傳播的風險。臨床醫師及醫院感控部門應引起高度重視，及時隔離MRSA 感染病人，采取相應措施減少科內流行克隆株的傳播。

作者貢獻度說明：

張立榮：查詢并整理相關課題文獻，建立課題研究方案，對試驗數據進行整理與相關統計分析，撰寫論文；江滟：研究選題推薦，為試驗提供技術或材料支持，全篇論文的指導性支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。