N端B細胞表位缺失的兔出血癥病毒VP60蛋白的表達及其免疫原性

劉維龍 胡波 范志宇 魏后軍 仇汝龍 宋艷華 陳萌萌 葛雷 熊富強 王芳

摘要： ?本研究將A3C單抗識別的VP60蛋白NTA區域作為識別標記，設計一系列編碼VP60 NTA區域重疊多肽的基因序列并連接于pGEX-4T-1載體，確定A3C單抗識別的精確表位。然后構建重組質粒Bacmid- ?VP60△A3C ?，將Bacmid- ?VP60△A3C ?轉染Sf9昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鑒定結果表明，重組蛋白VP60△A3C在Sf9細胞中高效表達，電鏡觀察顯示其形態和結構與兔出血癥病毒VP60蛋白類似。將重組蛋白VP60△A3C以每只200 μg免疫2月齡RHDV血清陰性的新西蘭兔，免疫后14 d，以兔出血癥病毒WF株攻毒新西蘭兔。結果表明，免疫組無死亡，而對照組全部死亡。本研究結果為制備表位缺失的兔出血癥亞單位疫苗奠定了基礎。

關鍵詞： ?兔出血癥病毒； VP60蛋白； B細胞表位； 免疫原性

中圖分類號： ?S855.3 ???文獻標識碼： A ???文章編號： ?1000-4440（2024）03-0508-06

Expression of rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein with B cell epitope deletion in N terminus and its immunogenicity in rabbit

LIU Wei-long1，2， HU Bo1，3， FAN Zhi-yu1，2，3， WEI Hou-jun1，3， QIU Ru-long1，3， SONG Yan-hua1，3， CHEN Meng-meng1，3， GE Lei1，3， XIONG Fu-qiang3，4， WANG Fang1，2，3，4

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Veterinary Bio-Product Engineering， Ministry of Agriculture， Nanjing 210014， China； 2.Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi 860000， China； 3.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China； 4.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： ?This study used the NTA region of the VP60 protein recognized by A3C monoclonal antibody as a recognition marker， designed a series of gene sequences encoding overlapping peptides in the VP60 NTA region， and connected them to the pGEX-4T-1 vector to determine the precise epitopes recognized by A3C monoclonal antibody. Then recombinant plasmid Bacmid- ?VP60△A3C ??was constructed. Bacmid- ?VP60△A3C ??was transfected into Sf9 insect cells， and recombinant baculovirus rBac- ?VP60△A3C ??was obtained. The identification results of RT-PCR， HA， IFA， and Western blot showed that the recombinant protein VP60△A3C was highly expressed in Sf9 cells. Electron microscopy observation showed that its morphology and structure were similar to those of rabbit hemorrhagic disease virus VP60 protein. The 2-month-old RHDV serum negative New Zealand rabbits were immunized with recombinant protein VP60△A3C at a rate of 200 μg per rabbit， and New Zealand rabbits were challenged with rabbit hemorrhagic disease virus WF strain after 14 days. The results showed that there were no deaths in the immune group， while all deaths occurred in the control group. The results of this study lay the foundation for the development of epitope-deleted subunit vaccine of rabbit hemorrhagic disease.

Key words： ?rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）； VP60 protein； B cell epitope； immunogenicity

兔出血癥（Rabbit hemorrhagic disease， RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus， RHDV）引起的高發病率和死亡率的烈性傳染病[1]。RHDV分為GI.1（RHDV1）和GI.2（RHDV2）2種基因型，分別引起兔出血癥1型和兔出血癥2型，2種基因型病毒之間交叉保護性低[2-4]。自2020年GI.2型RHDV在中國出現以來[5]，2種基因型RHDV在中國處于共同流行態勢。GI.1型RHDV主要感染2月齡以上兔，幼兔感染后不發病，但可帶毒，并在群體傳播中發揮重要作用[6]，表明感染幼兔是該病重要的傳染源之一。

RHDV的衣殼蛋白（VP60）可以自組裝形成35～40 nm的病毒樣顆粒（VLPs）。同時，VP60可在機體內誘導產生中和抗體，是RHDV的主要免疫保護性抗原，也是宿主免疫防御 RHDV 的主要靶標，在病毒診斷和國內外疫苗設計中起重要作用[1]，但現有疫苗和抗體檢測方法均無法鑒別疫苗免疫和病毒感染。鑒于GI.1型RHDV感染幼兔的帶毒和病毒傳播特點，因此構建一種基于VP60蛋白的表位標記疫苗并配套相應的表位抗體檢測技術用于感染兔群的檢測，是區分疫苗免疫和病毒感染的可行方案。前期我們發現A3C單抗識別的VP60蛋白N端B細胞表位具有強免疫原性但不具有中和活性，因此將該表位位點作為一種識別標記，構建一種A3C識別表位缺失的VP60蛋白，在昆蟲細胞中表達并研究其VLPs形成能力，可為構建兔出血癥表位缺失的標記疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌種和細胞 ?重組質粒pFastbac1- ?VP60 ?（GI.1型 ?VP60 ?）、Sf9 昆蟲細胞、大腸桿菌 DH10 Bac 由本實驗室保存； BL21（DE3）感受態購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 ?DNA Marker DL 2 000、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒、ECL顯色試劑盒、1.1×PCR mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司，FBS購自GIBCO公司，山羊抗小鼠FITC-IgG、山羊抗小鼠HRP-IgG購自Biosharp生物科技公司，VP60單克隆抗體A3C、1D4由本實驗室制備，Taq高保真酶、轉染試劑 Lipofectamine 3000和Grace培養基購自Invitrogen公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達質粒的合成 ?在前期模糊定位非中和單抗A3C識別VP60 NTA區域的基礎[7]上，設計一系列VP60 NTA區域重疊多肽的基因序列并連接于pGEX-4T-1載體（表1）。

1.2.2 單抗A3C識別表位的鑒定 ?將合成的重組表達質粒pGEX-4T-1- ?VP60 NTA1 ?、pGEX-4T-1- ?VP60 NTA2 ?、pGEX-4T-1- ?VP60 NTA3 ?、pGEX-4T-1- ?VP60 NTA4 ?分別轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態，陽性菌經0.5 mmol/L IPTG誘導表達后獲得重組蛋白pGEX-4T-1-VP60 NTA1、pGEX-4T-1-VP60 NTA2、pGEX-4T-1-VP60 NTA3、pGEX-4T-1-VP60 NTA4，經SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜上，經5%脫脂乳封閉后，以識別VP60 NTA區的單抗A3C為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，進行Western Blot鑒定，確定A3C單抗識別的精確表位。

1.2.3 引物合成 ?A3C識別表位缺失株構建引物及一系列鑒定引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表2）。

1.2.4 缺失A3C識別表位的重組轉移載體的構建 ?以本實驗室保存的重組質粒pFastbac1- ?VP60 ?為模板，以 ?VP60△A3C ?-F/ ?VP60△A3C ?-R引物進行PCR反應，擴增缺失A3C識別表位的 ?VP60 ?基因。PCR反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 7 min，30個循環；72 ℃ 5 min。將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行鑒定，120 V電泳30 min后，回收PCR陽性產物，使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒對PCR產物進行連接、轉化，用pFastBac-F/pFastBac-R引物進行擴增及測序鑒定，獲得正確缺失A3C識別表位的桿狀病毒重組轉移載體pFastbac1- ?VP60△A3C ?。

1.2.5 缺失A3C識別表位的重組穿梭載體的構建 ?將重組轉移載體pFastbac1- ?VP60△A3C ?轉化含有穿梭載體的大腸桿菌DH10Bac，使用藍白斑篩選法，將大腸桿菌DH10Bac涂布于含3種抗性的平板上（含50 μg/ml Kanamycin、7 μg/ml Gentamicin、10 μg/ml Tetracycline、100 μg/ml X-gal和40 μg/ml IPTG），37 ℃恒溫培養2 d后，挑取白色陽性單菌落純化培養后提取質粒。以M13-F/M13-R進行PCR反應，獲得重組穿梭載體Bacmid- ?VP60△A3C ?。

1.2.6 細胞轉染 ?使用轉染試劑 Lipofectamine 3000將重組穿梭載體Bacmid- ?VP60△A3C ?轉染Sf9昆蟲細胞，結束后每12 h觀察細胞狀態，待細胞出現間隙增大、折光性增強、形態變圓等病變特征時收集細胞及其培養物，以1 000 r/min離心5 min收獲上清液即為rBac- ?VP60△A3C ?原液（F1代病毒）。

1.2.7 mRNA的檢測 ?收集接種rBac- ?VP60△A3C ?的Sf9昆蟲細胞樣品，采用Trizol法提取感染細胞內總RNA，反轉錄為cDNA后，以 ?VP60 ?-F/ ?VP60 ?-R引物進行RT-PCR擴增，鑒定mRNA的存在。PCR程序為：95 ℃ 5 min，然后進入循環95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min。將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min后，紫外燈下觀察結果并拍照。

1.2.8 間接免疫熒光試驗（IFA） ?預先將Sf9細胞在24孔細胞板上培養至密度為85%～90%，每孔接種等量的重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?，同時以野生型毒株感染Sf9 細胞作陰性對照。在感染Sf9細胞24 h后，棄去培養液，PBS 洗滌2次，加入提前-20 ℃冷藏的甲醇和丙酮混合成的固定液，4 ℃作用1 h；PBS洗滌3次，加入PBS稀釋的1D4單抗（1∶200），37 ℃孵育90 min，PBS洗滌3次后，加入PBS 1∶50倍稀釋的山羊抗小鼠FITC-IgG，黑暗條件下37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.9 SDS-PAGE和Western Blot檢測 ?將重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?接種Sf9細胞，72 h后收獲細胞培養物，反復凍融3次后，取上清液，等比例加入Loading buffer處理后進行蛋白質電泳，結束后將凝膠半干轉印至PVDF膜上，5%脫脂乳37 ℃ 封閉2 h，PBST洗滌3次后，以1D4單抗（1∶1 000）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，進行Western Blot鑒定。

1.2.10 血凝效價測定 ?參照中華人民共和國農業行業標準NY/T 572-2016兔病毒性出血病血凝與血凝抑制試驗方法[8]進行。

1.2.11 電鏡觀察 ?對獲得的重組蛋白表達產物以紅細胞吸附釋放法[9]進行純化并超速離心，蛋白質樣品VP60△A3C經生理鹽水重懸后取少量置于銅網靜置2 min，加入2%磷鎢酸染液，利用透射電鏡觀察重組蛋白樣品并拍照。

1.2.12 免疫保護性研究 ?將純化的VP60△A3C蛋白稀釋至200 μg/ml，免疫兔出血癥病毒抗原和抗體均陰性的2月齡新西蘭兔5只，每只頸部皮下注射1 ml，同時以5只接種生理鹽水的新西蘭兔作為對照組。免疫后14 d，分別頸部皮下注射1 000 LD50的兔出血癥病毒，攻毒后7 d內每12 h觀察試驗兔并記錄。

2 結果與分析

2.1 A3C單抗識別表位的鑒定

對VP60 NTA1、VP60 NTA2、VP60 NTA3、VP60 NTA4 4個蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉印PVDF膜后，以單抗A3C為一抗，羊抗鼠HRP-IgG為二抗進行Western Blot鑒定，結果顯示，VP60 NTA1、VP60 NTA2和VP60 NTA4 3個蛋白有陽性條帶，而VP60 NTA3無條帶（圖1），由此確定單抗A3C識別的精確氨基酸位點為DGMDPG，對應的核苷酸序列為GACGGCATGGATCCTGGT。

2.2 重組轉移載體和重組穿梭載體的鑒定

以重組質粒pFastbac1- ?VP60 ?為模板擴增得到缺失A3C識別表位的桿狀病毒重組轉移載體pFastbac1- ?VP60△A3C ?，大小約6 000 bp（圖2A）。經測序驗證后將pFastbac1- ?VP60△A3C ?轉化大腸桿菌DH10Bac，提取陽性質粒用引物M13-F/M13-R進行PCR鑒定，擴增產物大小約為4 000 bp，而陰性對照擴增產物大小約為300 bp，表明成功獲得重組穿梭載體Bacmid- ?VP60△A3C ?（圖2B）。

2.3 RT-PCR鑒定重組病毒的表達

按Trizol法提取接種rBac- ?VP60△A3C ?的Sf9細胞總RNA，以 ?VP60 ?-F/ ?VP60 ?-R為引物進行RT-PCR擴增，鑒定mRNA。結果顯示，出現大小約為 1 800 bp的電泳條帶（圖3），大小與目的基因近似，表明 ?VP60△A3C ?基因得到表達。

2.4 間接免疫熒光檢測（IFA）

將rBac- ?VP60△A3C ?感染Sf9細胞24 h后，以1D4單抗（1∶200）為一抗，羊抗鼠FITC-IgG（1∶50）為二抗進行IFA檢測。結果顯示，感染rBac- ?VP60△A3C ?的Sf9細胞可見很強的特異性熒光，而陰性對照無特異性熒光出現（圖4），說明VP60△A3C蛋白有效表達。

2.5 SDS-PAGE和Western-Blot鑒定

將rBac- ?VP60△A3C ?感染Sf9細胞72 h后，以1D4單抗（1∶1 000）為一抗，羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，進行Western Blot鑒定。PVDF膜經顯色后出現相對分子質量為6×104的條帶（圖5），與預期一致，結果表明VP60△A3C蛋白有效表達。

2.6 表達蛋白的血凝效價測定

將rBac- ?VP60△A3C ?感染Sf9細胞4 d后，以96孔“U”形血凝板對表達產物進行血凝效價測定。結果表明，VP60△A3C蛋白能凝集人1% O型紅細胞懸液，血凝效價為1∶4 096，表明VP60△A3C蛋白高效表達。

2.7 電鏡觀察

電鏡觀察結果表明，VP60△A3C蛋白可形成大小為35～40 nm、形態和結構與兔出血癥病毒VP60蛋白類似的VLPs，說明缺失A3C識別表位不影響VP60蛋白病毒樣顆粒的組裝（圖6）。

2.8 免疫原性檢測

將VP60△A3C蛋白進行純化后免疫RHDV血清陰性的新西蘭兔，14 d后進行攻毒，檢驗重組蛋白對家兔的免疫保護作用。結果顯示，以紅細胞吸附釋放法獲得純化的VP60△A3C蛋白，經蛋白質定量后以每只200 μg的劑量免疫新西蘭兔，然后以RHDV WF株攻毒，免疫組家兔獲得100%保護，而注射生理鹽水的對照組家兔全部死亡（表3），表明VP60△A3C蛋白具有良好的免疫原性。

3 討 論

目前尚未建立天然RHDV的體外培養系統，病毒難以在體外穩定增殖，因此國內外新型疫苗的研究主要將VP60蛋白作為RHDV的免疫保護性抗原分子。目前 ?VP60 ?已在桿狀病毒、酵母、大腸桿菌、乳酸桿菌、痘病毒等多種系統中表達并開展免疫原性研究[10-15]，且以桿狀病毒表達系統研究較多。另外也有利用桿狀病毒表達系統進行以VP60為載體研究外源表位免疫原性的報道[16]。該系統表達效率較高，可以實現外源蛋白的全懸浮細胞培養表達，且已有商品化疫苗產品上市。

現有研究結果表明VP60蛋白可分為NTA區、S區和P區，NTA區位于VP60蛋白的N端[17]。VP60蛋白形成的VLPs結構中，N端位于VLPs內部，而C端位于外表面，是受體結合區域和中和表位所在區域[17]，且VP60氨基酸的一些改變并不影響VLPs的形成[16，18]。本實驗室在前期研究中發現了VP60 N端存在一個免疫原性強但不具有中和活性的B細胞表位，由單抗A3C識別，并已進行了模糊定位[7]。本研究在此基礎上首先精確定位了單抗A3C識別的B細胞表位，構建了該表位缺失的重組桿狀病毒rBac- ?VP60△A3C ?，其感染Sf9細胞后表達的缺失A3C識別表位的VP60蛋白可自組裝成VLPs，表明該表位的缺失不影響病毒樣顆粒的形成。將表達蛋白純化后免疫新西蘭兔，可以完全保護家兔免受GI.1型強毒株的感染，表明表位缺失的VP60蛋白依然具有良好的免疫原性，是一種優良的兔出血癥候選疫苗分子。

感染幼兔是GI.1型兔出血癥重要的傳染源之一，由于目前無法區分GI.1型疫苗免疫和病毒感染，因此難以在養殖兔群中完全清除被RHDV感染的幼兔。本研究構建了基于表位缺失的VP60蛋白，可用于制備一種基于表位缺失的兔出血癥標記疫苗，后續建立檢測該表位抗體的ELISA檢測技術，有望實現GI.1型兔出血癥疫苗免疫和病毒感染的鑒別，為兔出血癥的防控提供新的技術產品。

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（責任編輯：成紓寒）